Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1. Клинико-морфологические варианты низкорениновых форм артериальной гипертонией
1.1 Низкорениновый гипералъдостеронизм у больных артериальной гипертонией 10
1.1.1 Первичный гипералъдостеронизм (алъдостерома коры надпочечников) 10
1.1.2 Идиопатический гипералъдостеронизм (диффузная двусторонняя гиперплазия коры надпочечников) 13
1.2 Низкорениновая эссенциальная артериальная гипертония 15
2. Исследование вклада генетических факторов в развитие низкорениновых форм
артериальной гипертонии 18
2.1 Моногенные формы низкоренинового гиперальдостеронизма
2.1.1 Семейный гипералъдостеронизм 1-го типа 18
2.1.2 Семейный гипералъдостеронизм 2-го типа 21
2.2 Анализ генетической предрасположенности к полигенным формам низкорениновой артериальной гипертонии 23
ГЛАВА 2. Материал работы и методы исследования
2.1. Материал исследования 31
2.2. Методы исследования 32
2.2.1. Оценка состояния сердечно-сосудистой системы и надпочечников 32
2.2.1.1. Исследование концентрации алъдостерома и активности ренина в плазме крови 32
2.2.1.2. Методика проведения суточного мониторирования АД 32
2.2.1.3. Методы исследования cepdifa 33
2.2.1.4. Методы визуализаии надпочечников 33
2.2.2. Методы выделения ДНК и геномного типирования 34
2.2.3. Методы статистического анализа 36
ГЛАВА 3. Результаты исследования 39
3.1. Клиническая характеристика обследованных больных 39
3.2. Формирование групп и клиническая характеристика больных с различным функциональным состоянием РААС 40
3.2.1 Сравнительная клиническая характеристика больных в группах с низкорениновым гипералъдостеронизмом и низкорениновой гипертонической болезнью 40
3.2.2 Сравнительная клиническая характеристика больных в группах с первичным гипералъдостеронизмом, идиопатическим гипералъдостеронизмом и низкорениновой гипертонической болезнью 43
3.3. Генетический анализ больных АГ с гиперальдостеронизмом на присутствие химерного гена CYP11B2/CYP1 IB J 47
3.4. Выбор генов для анализа ассоциации с различными формами низкорениновой АГ 49
3.5. Анализ частоты аллелей, частоты носительства генотипов и аллелей полиморфных участков генов РААС и гаплотипов гена REN у больных с различными формами низкорениновой АГ 51
3.6. Комплексный анализ генетической предрасположенности к различным формам низкорениновой АГ с использованием алгоритма APSampler 56
3.7. Анализ связи носительства аллелей, генотипов и их сочетаний с некоторыми клиническими показателями у больных с различными формами низкорениновой АГ 62
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов 70
Выводы 82
Практические рекомендации 84
Список литературы 85
- Первичный гипералъдостеронизм (алъдостерома коры надпочечников)
- Семейный гипералъдостеронизм 1-го типа
- Сравнительная клиническая характеристика больных в группах с низкорениновым гипералъдостеронизмом и низкорениновой гипертонической болезнью
- Анализ частоты аллелей, частоты носительства генотипов и аллелей полиморфных участков генов РААС и гаплотипов гена REN у больных с различными формами низкорениновой АГ
Введение к работе
Низкорениновая форма артериальной гипертонии (АГ) составляет 20-25% среди всех форм АГ; она может быть этиологически связана с опухолевыми и неопухолевыми изменениями в коре надпочечников и протекать с сопутствующим синдромом гиперальдостеронизма. Различные формы гиперальдостеронизма, отличаясь гисто-морфологическими изменениями в коре надпочечников, могут иметь сходные клинические проявления, что затрудняет проведение дифференциального диагноза и выбор адекватного подхода к лечению. В основе диагностики различных форм низкорениновой АГ лежит анализ функционального состояния ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС).
Низкорениновый ГПА может развиваться как на фоне альдостеромы коры надпочечников, так и при других клинико-морфологических вариантах -идиопатическом ГПА (на фоне гиперплазии коры надпочечников) и ГПА, корригируемом глюкокортикоидами (семейный ГПА 1-го типа — моногенное заболевание, которое наследуется по аутосомно-доминантному типу и определяется присутствием химерного гена).
Учитывая важную роль РААС в развитие низкорениновой АГ, высказываются и анализируются гипотезы о возможном участии отдельных генов-кандидатов, кодирующих компоненты этой системы, в формировании предрасположенности к различным формам этого заболевания: альдостеронсинтазы (CYP11B2), ренина (REN), ангиотензиногена (AGT), ангиотензин-превращающего фермента (АСЕ), рецептора ангиотензина II типа 1 (AT2R1) и химазы (СМА). [140] Однако, исследования по выявлению факторов генетической предрасположенности к низкорениновым формам ГПА, отраженные в единичных публикациях, не позволяют с определенностью связывать конкретный аллельный полиморфизм генов и возможное участие сочетания нескольких генов, кодирующих компоненты РААС, с отдельными клинико-морфологическими формами низкорениновой АГ. В то же время, такая
7 информация могла бы иметь существенное значение для выявления генетической гетерогенности этих форм и выяснения вопроса о возможном вкладе генетической гетерогенности в клинические проявления заболевания. Таким образом, изучение связи носительства аллелей, генотипов и сочетаний аллелей и/или генотипов полиморфных участков генов РААС (CYP11B2, REN, AGT, АСЕ, AT2R1 и СМА) с развитием низкоренинового ГПА является актуальным и перспективным.
Цель исследования: изучение роли генов, кодирующих компоненты РААС, как возможных факторов генетической предрасположенности к низкорениновому гиперальдостеронизму, в сопоставлении с клиническими проявлениями заболевания.
Задачи:
проанализировать особенности клинических проявлений низкорениновых форм АГ и сформировать две группы больных АГ с опухолевыми (альдостерома коры надпочечников) и неопухолевыми (гиперплазия коры надпочечников) формами гиперальдостеронизма и группу сравнения, включающую больных с низкорениновой формой гипертонической болезни с нормальным уровнем альдостерона.
провести скрининг больных артериальной гипертонией с опухолевыми и неопухолевыми формами гиперальдостеронизма на наличие химерного гена 11 Р-гидроксилазы/альдостеронсинтазы (CYP11BJ/CYP11B2) с целью выявления больных с семейным гиперальдостеронизмом 1-го типа;
изучить аллельный полиморфизм генов РААС: альдостеронсинтазы (CYP11B2), ренина (REN), ангиотензиногена (AGT), ангиотензин-превращающего фермента (АСЕ), рецептора ангиотензина-П типа 1
8 (AT2R1) и химазы (СМА) у больных с различными формами гиперальдостеронизма и исследовать ассоциацию аллелей и генотипов исследуемых полиморфных участков с развитием отдельных форм низкоренинового гиперальдотеронизма в сравнении с группой больных низкорениновой гипертонической болезнью.
сопоставить носительство аллелей генов альдостеронсинтазы, ренина, ангиотензиногена, ангиотензин-превращающего фермента, рецептора ангиотензина-П типа 1 и химазы у больных с низкорениновыми формами АГ с фактором отягощенной наследственности по АГ, функциональным состоянием РААС и клиническими проявлениями заболевания;
сопоставить носительство аллелей гена ренина (REN) у больных с низкорениновыми формами АГ с различным типом реакции РААС на диагностический нагрузочный тест (4-х часовую ходьбу).
Научная новизна:
Впервые проведен анализ аллельного полиморфизма отдельных генов-кандидатов, кодирующих компоненты РААС (CYP11B2, REN, AGT, АСЕ, AT2R1 и СМА), у больных различными формами ГПА в сопоставлении с больными низкорениновой гипертонической болезнью (группа сравнения) для выявления их возможной роли в формировании генетической предрасположенности к первичному и идиопатическому ГПА.
В проводимых ранее исследованиях по генетической предрасположенности к низкорениновым формам ГПА не исследовали возможного участия сочетания нескольких генов, кодирующих компоненты РААС. В нашем исследовании впервые с использованием программного обеспечения APSampler проведен комплексный анализ связи носительства аллелей, генотипов и сочетаний аллелей и/или генотипов полиморфных участков генов РААС (CYP11B2, REN, AGT, АСЕ, AT2R1 и СМА) с развитием
9 низкоренинового ГПА. Несмотря на сравнительно небольшие группы больных, данный анализ позволил выявить предрасполагающие к развитию отдельных форм низкоренинового ГПА сочетания из 2-3 аллелей или генотипов всех исследованных генов РААС, за исключением AGT, а также выявить сочетание, отрицательно ассоциированное с развитием первичного ГПА, т.е. протективное. Сопоставление данных генетического исследования с особенностями клинических проявлений низкорениновых форм АГ впервые позволило проанализировать связь носительства не только отдельных аллелей и генотипов, но и выявленных сочетаний аллелей и/или генотипов, определяющих генетическую предрасположенность к исследуемым формам низкорениновой АГ, с уровнем АД и показателями, характеризующими функциональное состояние РААС.
Практическая значимость:
Носительство выявленных сочетаний аллелей и/или генотипов полиморфных участков генов, кодирующих компоненты РААС, а именно (-344Т) CYP11B2 + (-5312Т) REN, (-5434Т/Т) REN+ (-1903А) СМА и (-5434Т/Т) REN + (-1166А) AT2R1, может рассматриваться как один из факторов риска развития низкоренинового ГПА в целом. Носительство сочетания (-344Т) CYP11B2 + Bgll G REN+l АСЕ связано с первичным, а (-5312Т) REN + D АСЕ с идиопатическим ГПА; их можно рассматривать как дифференцирующие признаки при разграничении исследованных форм ГПА.
Выявлено сочетание (-5434С) REN + Bgll А/А REN, отрицательно ассоциированное с развитием первичного ГПА, т.е. связанное с протективным эффектом.
Первичный гипералъдостеронизм (алъдостерома коры надпочечников)
В 1955 году, американский хирург Д. Конн впервые описал клинический синдром под названием «первичный альдостеронизм» (ПА) [25]. Первичный гиперальдостеронизм (ПГА) обусловлен избыточной секрецией минералокортикоидного гормона альдостерона аденомой (альдостеромой) коры надпочечников.
По данным различных авторов отмечаются значительные колебания в частоте выявления ПГА. До недавнего времени считалось, что это заболевание наблюдается у 1-2% больных, страдающих АГ [50]. Однако, с появлением новых методов диагностики, частота выявления ПГА неуклонно возрастает. В последние годы установлено, что распространенность этой патологии составляет от 5-15% среди всех форм АГ и от 8-20% среди вторичных форм (симптоматических) АГ [85, 97, 103, 117]. Однако, нередко авторы, указывая распространенность заболевания, включают больных и с опухолью и с гиперплазией коры надпочечников, чем можно объяснить указанный диапазон колебаний распространенности этого заболевания.
В большинстве случаев причиной ПГА является доброкачественная аденома клубочковой зоны коры надпочечников. Чаще аденомы выявляются у женщин в возрасте 30-50 лет [59]. Кроме того, были описаны случаи выявления альдостером у детей [48, 59]. В 70% случаев обнаруживается односторонняя альдостерома, реже выявляются двусторонние опухоли. В большинстве случаев альдостеромы не достигают больших размеров, диаметр их колеблется в пределах от 0,5-6 см, а в 19% случаев не более 1 см [59]. Злокачественный вариант альдостеромы (карцинома) встречается не более чем в 1-3% случаев [134], по данным некоторых авторов - до 6% [141]. Карциномы, секретирующие альдостерон, обычно бывают больших размеров, диаметр их может превышать 5 см [134].
Чаще альдостеромы состоят из клеток клубочковой зоны коры надпочечников, но могут включать в себя также клетки сетчатой и пучковой зон. Кроме того, у большинства больных обнаруживается гиперплазия окружающей образование клубочкой зоны коркового слоя [11, 12, 62, 100].
Синдром ПА обычно протекает с клиническими проявлениями, обусловленными нейро-мышечными симптомами (мышечная слабость, и парестезии, тетания, судороги), почечными симптомами (полиурия, полидипсия, никтурия) и симптомами, связанными с АГ (головные боли, головокружение).
Артериальная гипертония — наиболее частый и постоянный синдром ПГА. Описаны единичные случаи нормотонического течения данного синдрома [78, 118]. В некоторых случаях артериальная гипертония проявляется преимущественным повышением систолического АД вследствие увеличения объема циркулирующей крови и сердечного выброса, тогда как диастолическое давление повышается умеренно. Однако по мере прогрессирования заболевания цифры артериального давления возрастают [121]. В НИИ кардиологии им. А.Л. Мясникова у 73% больных ПГА была выявлена тяжелая АГ (диастолическое АД более 115 мм рт. ст.) [6]. Описаны наблюдения за больными ПГА, протекающим с синдромом злокачественной гипертонии [3]. Злокачественное течение АГ наблюдается в 8% случаев [7, 118], это нередко сопровождается сосудистыми осложнениями.
Нейромышечные симптомы (мышечная слабость, судороги, парестезии) встречается в 38-75%, почечные симптомы (полиурия, полидипсия, никтурия) — в 50-70% [26]. В течение длительного времени постоянным симптомом ПГА считали гипокалиемию [18, 26]. Однако, в дальнейшем было установлено, что в 7-38% ПА может протекать с нормальным уровнем калия в сыворотке крови [89, 119].
При исследовании показателей ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС), на фоне 4-часового ортостатического теста, основанного на циркадных колебаниях секреции альдостерона в зависимости от АКТГ, установлено, что для большинства больных с альдостеромой в ответ на эту пробу наблюдается характерное снижение уровня альдостерона или отсутствие его изменения, так как в условиях, когда значительно снижено регулирующее альдостерон действие РАС (супрессия ренина 1 нг/мл/ч) и действие ионов калия (гипокалиемия), — главенствующим становится влияние АКТГ [10]. 13 Вместе с тем у некоторых больных с альдостеромой отмечена повышенная стимуляция уровня альдостерона на фоне 4-часовой ортостатической нагрузки, что объясняется повышенной чувствительностью адреналовой ткани к ангиотензину у этой категории больных. Этим объясняется выделение данной группы в качестве больных с «ангиотензинзависимыми альдостеромами». Таким образом, по результатам реакции РАС на нагрузочную пробу выделяют «ангиотензиннезависимые» и «ангиотензинзависимые» альдостеромы [47, 53], частота которых по данным некоторых авторов составляет 80% и 20%, соответственно [50].
При выявлении альдостеромы надпочечника показано ее удаление, выполняют одностороннюю адреналэктомию с опухолью [1, 2, 9, 86, 121, 141]. Хирургическое лечение альдостером в большинстве случаев приводит к нормализации АД или к значительному его снижению, а также к нормализации альдостерона и уровня калия в плазме крови [115, 141].
Семейный гипералъдостеронизм 1-го типа
Среди форм АГ, протекающих с супрессией ренина, выделяют также низкорениновую форму эссенциальной гипертонии — низкорениновая форма гипертонической болезни (НРГБ), которая не сопровождается повышенной секрецией альдостерона [36, 42, 46]. Изучение низкорениновой формы ГБ началось в 60-х годах, некоторые авторы эту патологию рассматривают как особую нозологическую форму АГ [4, 36]. Распространенность эссенциальной гипертонии, протекающей с низкой активность ренина в плазме крови, составляет 20-30%. [5, 80]. В отношении тяжести АГ при низкорениновом варианте единодушного мнения нет. Одни авторы отмечают более тяжелое течение заболевания, связывая это преимущественно с возрастным фактором [129]. Другие считают низкую активность ренина прогностически благоприятным признаком [22, 132]. Этиология и патогенез этой формы эссенциальной гипертонии до конца не установлены. Основываясь на результатах некоторых исследований можно предположить, что у пациентов с низкорениновой эссенциальной АГ повышена чувствительность коры надпочечников к ангиотензину II, что может служить механизмом развития АГ [5, 42, 80]. Так, больные с низкорениновой АГ реагировали на инфузию ангиотензина II значительно большим приростом АД и секреции альдостерона, чем здоровые добровольцы [35, 42, 137]. Высказываются также предположения, что данная форма является лишь стадией развития АГ, а низкая активность ренина плазмы крови — результат адаптационных и дегенеративных изменений сосудистой стенки почечных артериол при длительном течении артериальной гипертонии и ее прогрессировании. Это подтверждается снижением уровня ренина с увеличением длительности заболевания и возраста больных АГ, с учетом возможного развития артерио- и нефросклероза [35]. По данным некоторых авторов установлено, что больные с низкорениновой формой ГБ достоверно старше здоровых лиц и больных АГ с нормальной рениновой активностью [61]. Более низкий уровень активности ренина определяется у представителей черной расы [42, 81]. Предполагают, что у больных с низкорениновой эссенциальной АГ, по мере прогрессирования течения заболевания секреция ренина подавляется за счет отрицательной обратной связи с барорецепторов внутрипочечных сосудов, куда передается повышенное системное АД [32]. Существует также и другая теория, согласно которой, низкорениновая форма эссенциальной гипертонии рассматривалась как ранняя стадия развития первичного альдостеронизма. Кроме того, существует точка зрения, что у больных низкорениновой ГБ уровень ренина менее чувствителен к изменениям употребления поваренной соли [5, 32], что, по мнению авторов, косвенно может служить доказательством в пользу ранней фазы развития альдостеронизма.
Концепция об объемзависимом характере низкорениновой ГБ является одной из самых распространенных. Однако данные о состоянии вводно-электролитного баланса у данной группы больных разноречивы. Одни авторы [92, 116] находят повышенным объем плазмы и внеклеточной жидкости, общего и обменоспособного натрия и их обратную корреляцию с активностью 17 ренина; другие [133] четких различий в изменениях объемов и связи с рениновой активностью не наблюдали.
Также, высказывалась теория о специфическом плазменном ингибиторе рениновой активности [61], однако, достоверных сведений по данному субстрату в дальнейших исследованиях получено не было [82].
Кроме того, помимо низкорениновой ГБ, существуют и другие редкие формы АГ, протекающие с супрессией ренина. Артериальная гипертония с низкой активностью ренина наблюдается при синдроме Лиддля - редком семейном аутосомно-доминантном заболевании, протекающем с гипокалиемическим алкалозом без гиперсекреции минералокортикоидов, уровень альдостерона при этом заболевании обычно снижен [71]. Синдром мнимого избытка минералокортикоидов возникает при недостаточности 11(3-гидроксистероиддегидрогеназы - фермента, превращающего кортизол в кортизон [99]. Эта редкая форма АГ с низкой АРП чаще всего выявляется в детском возрасте. Наследственная форма данного заболевания обусловлена мутацией гена почечной формы фермента, проявляется тяжелой АГ и гипокалиемией. Другим редким заболеванием, характеризующимся низкой активностью ренина, является гипертоническая форма врожденной гиперплазии коры надпочечников (ВГКН), при которой недостаточность 113-гидроксилазы или 17а-гидроксилазы приводит к частичной или полной блокаде образования кортизола, тогда как секреция кортикостерона и дезоксикортикостерона не нарушается [71]. Под влиянием избытка дезоксикортикостерона отмечаются задержка натрия в организме и АГ. Наблюдающаяся при этом гиперволемия вызывает снижение активности ренин-ангиотензинной системы.
Таким образом, представленные результаты исследований свидетельствуют о клинической, патогенетической и гисто-морфологической неоднородности низкорениновой АГ и о необходимости дальнейших исследований для анализа этих клинико-морфологических вариантов АГ.
Сравнительная клиническая характеристика больных в группах с низкорениновым гипералъдостеронизмом и низкорениновой гипертонической болезнью
Для получения из крови ДНК необходимой чистоты и достаточной молекулярной массы применяли модифицированный метод с использованием экстракции смесью фенол-хлороформ. Геномное типирование проводили методами на основе ПНР.
Анализ ДНК на присутствие химерного гена CYP11B1/CYP11B2 проводили по наличию продуктов длиной приблизительно 3,9 т.п.н. при проведении ПЦР с парой праймеров, один из которых специфичен для области интрона Е гена CYP11B2, а другой - для 5 -нетранслируемой области гена CYP11B1; параллельно проводили реакцию с праймерами, специально подобранными для получения фрагмента такой же длины из области интрона Е гена CYP11B2 с целью контроля эффективности протяженной ПНР. Продукты амплификации выявляли при электрофорезе в 2%-ном агарозном геле в присутствии бромида этидия. В качестве положительного контроля использовали образец ДНК больного О. с диагностированной ранее семейной формой ГПА 1-го типа, наличие химерного гена у данного больного было выявлено нами и подтверждено ПНР, независимо проведенной в совместной работе с исследователями в Австралии (Queensland, Australia) [8], а также частичным секвенированием.
Метод анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов продуктов ПЦР (метод ПЦР-ПДРФ) применяли для генотипирования полиморфного участка С—344Т в промоторной области гена CYP11B2; участка рестрикционного полиморфизма BgH в интроне 1 гена REN, полиморфного участка гена AGT, определяющего аминокислотную замену Thrl74Met, полиморфного участка А1166С в 3 -нетранслируемой области гена AT2R1 и полиморфного участка G-1903A (СМА/В) гена СМА.
Для генотипирования полиморфных участков С-5434Т и С-5312Т в энхансерной области гена REN применяли метод ПЦР с использованием аллелеспецифических праймеров (метод ПЦР-SSP). Фрагмент ДНК длиной 147 п.н., содержащий полиморфный участок С-5434Т, амшшфицировали с использованием аллелеспецифических праймеров: 5 TT-AGT-CAT-GGT-GGC-CTA-CG-3 (SSP С), 5 TT-AGT-CAT-GGT-GGC-CTA-CA-3 (SSP Т), и общего праймера 5 -CTA-AGG-AAAATTC-GTA-GTG-CCA-3\ а фрагмент ДЕК длиной 242 п.н., содержащий полиморфный участок С-5312Т, амшшфицировали с использованием аллелеспецифических праймеров: 5 -ССА-AAG-CAG-GCTAACT-GG-3 (SSP С), 5 -CCA-AAG-CAG-GCTAACT-GA-3 (SSP Т), и общего праймера 5 AG-GAA-CAAGACACG-GCA-3\ Все праимеры сконструированы с использованием пакетов программ Vector NTI 7.1 и Primo [http://www.changbioscience.com/primo/]. Амплификацию в обоих случаях проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 70 мМ Трис-HCI рН 90, 20 мМ (NH4)2S04, 1 мМ MgCI2, 0,025% Tween 20, 0,025% NP-40, праимеры для выявления аллеля С (SSP С и общий) или для выявления аллеля Т (SSP Т и общий) в количестве 5 пмоль каждый, 0,2 мМ dNTP, 0,5 ед. Taq полимеразы и 100-250 нг геномной ДНК. На реакционную смесь наслаивали минеральное масло. Для -5434Т И-5312С амплификацию проводили в следующих условиях: 95С - 5 мин, 10 циклов: 95С - 1 мин; 62С - 1 мин; 20 циклов: 95С - 30 сек; 56С - 50 сек; 72С - 50 сек. Для -5434С и-5312Т амплификацию проводили в следующих условиях: условиях: 95С - 5 мин, 10 циклов: 95С - 1 мин; 65С - 1 мин; 20 циклов: 95С - 30 сек; 58С - 50 сек; 72С - 50 сек. ПЦР проводили в амплификаторе МС16 (ЗАО "НПФ ДНК-Технология", Россия). Наличие продуктов амплификации проверяли электрофорезом в 2%-ном агарозном геле в присутствии бромида этидия. 36 Генотипирование инсерционно-делеционного полиморфизма (I/D) в 16 интроне гена АСЕ проводили методом ПЦР в два этапа. На первом этапе применяли праймеры, фланкирующие область делеции: 5 -CTG GAG АСС ACT ССС АТС СТТ ТСТ-3 и 5 -GAT GTG GCC АТС ACT ТТС GTC AGA Т-3\ Поскольку аллель без делеции в гетерозиготах амплифицируется хуже, то для проверки его наличия у носителей делеции проводили второй этап ПЦР с использованием праймеров, один из которых лежит в области делеции: 5 GG GAC САС AGC GCC CGC САС ТАС-3 и 5 CG CCA GCC СТС CCA TGC CCA TAA-3 . Амплификацию на каждом этапе проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 70 мМ Трис-HCl рН 9.0, 20 мМ (NH SC , 2.0 мМ MgCl2, 0.025% Tween 20, 0.025% NP-40, праймеры в количестве 5 пмоль каждый, 0.2 мМ dNTP, 0.5 ед. Taq полимеразы и 100-250 нг геномной ДНК. На реакционную смесь наслаивали минеральное масло. Программа амплификации для обоих этапов была следующей: 94С - 5 мин; 8 циклов: 94С - 1 мин, 67С - 1 мин 30 сек, 72С - 1 мин 30 сек; 37 циклов: 94С - 1 мин, 70С - 1 мин, 72С - 5 мин. ПЦР проводили в амплификаторе МС16 (ЗАО "НПФ ДНК Технология", Россия). Наличие продуктов амплификации проверяли электрофорезом в 2%-ном агарозном геле в присутствии бромида этидия.
Анализ частоты аллелей, частоты носительства генотипов и аллелей полиморфных участков генов РААС и гаплотипов гена REN у больных с различными формами низкорениновой АГ
Следующий этап исследования включал поиск сочетаний аллелей и/или генотипов, носительство которых значимо ассоциировано с заболеваниями. Проведенный с помощью программного обеспечения APSampler комплексный анализ выявил целый ряд достоверных отличий больных из группы НРГБ (группа II) от объединенной группы ГПА (группа I), а также при отдельном сравнении группы II с группами 1а и 16 (первичный и идиопатический ГПА, соответственно) (таблица 12).
Частоты носительства большинства сочетаний аллелей/генотипов, условно обозначенных как А - Д, значимо выше у больных из группы 1а и/или 16, и/или в объединенной группе I, чем у больных из группы II, что дает основание считать их предрасполагающими к развитию низкоренинового ГПА, и лишь одно сочетание (сочетание Е) отрицательно ассоциировано с развитием ГПА, т.е. является «протективным». Два из выявленных сочетаний, а именно: (-344Т) CYP11B2 + (-5312Т) REN и (-5312Т) REN + D АСЕ включают в себя по два аллеля генов; два других: (-5434Т/Т) REN+ (-1903 А) СМА и (-5434Т/Т) REN + ( -1166A) AT2R1 представляют собой сочетание гомозиготного генотипа одного гена и аллеля другого; сочетание (-5434С) REN + Bgli А/А REN является комбинацией гомозиготного генотипа гена REN по одному полиморфному участку с аллелем того же гена по другому полиморфному участку; сочетание (-344Т) CYP11B2 + Bgli G REN + I АСЕ является триаллельным. В этих сочетаниях представлены аллели/генотипы полиморфных участков генов CYP11B2, REN, АСЕ, СМА и AT2RJ, т.е. пяти из шести анализируемых нами генов. Значимого вклада сочетаний, включающих аллели гена AGT, мы не наблюдали. При этом все шесть сочетаний включают полиморфные участки гена REN: аллель —5312Т (в условно обозначенных сочетаниях А и Г), либо аллель Bgli G (в сочетании Б), либо аллель -5434С REN и генотип Bgli А/А (сочетание 57 Е), либо генотип -5434Т/Т (в сочетаниях В и Д). Два сочетания (А и Б) несут один и тот же аллель -344Т гена CYP11B2. Выявление протективного сочетания Е, несущего аллели -5434С и Bgll A REN, находится в хорошем соответствии с присутствием альтернативных аллелей -5434Т в предрасполагающих сочетаниях В и Д и Bgll G - в предрасполагающем сочетании Б.
При сравнении больных из группы II и больных из группы 1а выявлены четыре достоверно значимых сочетания, предрасполагающие к первичному ГПА: А - В и Д. Величина/? для данных сочетаний лежит в пределе от 0.009 до 0.02. Сравнение больных из группы II и больных из группы 16 также выявило четыре сочетания, предрасполагающих к идиопатическому ГА: А и В - Г. Когда сравнивали группу II с объединенной группой I (низкорениновый ГПА), значимые различия наблюдали для тех же четырех сочетаний, что и для группы 1а (А - В и Д). Носительство сочетаний А, В и Д, которые предрасполагают к развитию обеих форм ГПА, характеризуются в объединенной группе I большей статистической значимостью, чем в группах 1а и 16, что в совокупности свидетельствует о наличии общих факторов генетической предрасположенности к ПГА и ИГА. Иная картина наблюдается при сравнении этих групп в сочетаниях Б и Г, включающие в себя, наряду с аллелями других генов, разные аллели гена А СЕ. В сочетании Б (-344Т) CYP11B2 + Bgll GREN + I АСЕ сила ассоциаций практически не изменилась, а в сочетании Г (-5312Т REN совместно с D АСЕ) значение р сохранило статистически значимую достоверность, однако доверительный интервал (CI) не пересекал 1. Таким образом, сочетание Б значимо ассоциировано только с первичным ГА (р = 0.009, OR = 5.4), а сочетание Г - только с идиопатическим ГПА (р = 0.004, OR = 10.7), что дает основание считать их факторами риска разных форм низкоренинового ГПА. Единственное выявленное «протективное» сочетание Е (-5434 С ) REN + Bgll А/А REN, достоверно значимо при сравнении группы II с группой 1а и с объединенной группой I, что может свидетельствовать о его протективном эффекте только для первичного ГПА.
Кроме того, мы сравнили значения р для предрасполагающих сочетаний А - Д и "гомологичных" сочетаний, в которых аллель/генотип REN заменен на аллель/генотип другого полиморфного участка этого гена, наиболее часто встречающийся в сравниваемых группах в совместных гаплотипах. Как показано в таблице 13, некоторых гомологичных сочетаний не обнаружено, и только одно из гомологичных сочетаний (-5434Т) REN + D АСЕ является статистически значимым. Однако, значение для этого "гомологичного" сочетания (р=0.03) почти на порядок больше, чем для исходного сочетания (-5312Т) REN совместно с D АСЕ (р=0.004).
