Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Фармакогенетические основы, определяющие нежелательные лекарственные реакции антикоагулянтной терапии 10
1.2. Влияние изофермента цитохрома Р-450 2С9 и гена VKORC1 на антикоагулянтное действие варфарина .16
1.3. Влияние полиморфизма генов CYP2C9 и VKORC1 на формакокинетику и фармакодинамику лозартана 27
2. Материалы и методы 34
2.1. Клиническая характеристика обследованных больных .34
2.2. Лабораторный контроль терапии антикоагулянтом непрямого действия варфарином 40
2.3. Генотипирование пациентов .41
2.3.1.Выделение геномной ДНК 42
2.3.2.Подбор праймеров для ПЦР 43
2.3.3.Амплификация ДНК 43
2.3.4. Расщепление продуктов амплификации рестриктазами ...45
2.3.5.Электрофоретическое разделение ДНК 45
2.4. Определение концентрации лозартана и его метаболита Е-3174 в моче пациентов перед имплантацией искусственного клапана сердца (лозартановый тест) 46
2.4.1.Подготовка проб 47
2.4.2.Хроматографическое определение 47
2.4.3.Статистическая обработка результатов .47
3. Результаты собственных исследований 49
3.1. Изучение частоты распределения аллелей и генотипов по полиморфным маркерам генов CYP2С9 и VKORC1(G3673A) и их сочетаний у пациентов с имплантацией искусственного клапана сердца .49
3.2. Сопоставление подобранных доз варфарина раннего и позднего послеоперационного периода с полиморфизмом генов CYP2C9 и VKORC1(G3673A) 55
3.3. Результаты анализа динамического измерения АД на фоне лозартанового теста 80
3.4. Оценка влияния полиморфизма гена CYP2C9 на активность CYP2C9 по лозартановому тесту у пациентов с имплантированными искусственными клапанами сердца. 81
3.5. Сопоставление подобранных доз варфарина в раннем и позднем послеоперационном периоде с активностью CYP2C9 по лозартановому тесту. 84
3.6. Изучение влияния межлекарственного взаимодействия на поддерживающую дозу варфарина в раннем послеоперационном периоде в зависимости от полиморфизма генов CYP2C9 и VKORC1(G3673A) 90
3.7. Результаты длительного наблюдения за кардиохирургическими пациентами, принимающими варфарин 104
Обсуждение результатов исследования и
Заключение 106
Выводы 114
Практические рекомендации 116
Список литературы. .117
- Влияние изофермента цитохрома Р-450 2С9 и гена VKORC1 на антикоагулянтное действие варфарина
- Влияние полиморфизма генов CYP2C9 и VKORC1 на формакокинетику и фармакодинамику лозартана
- Расщепление продуктов амплификации рестриктазами
- Сопоставление подобранных доз варфарина раннего и позднего послеоперационного периода с полиморфизмом генов CYP2C9 и VKORC1(G3673A)
Введение к работе
Актуальность исследования
Антикоагулянты непрямого действия (АКНД) введены в клиническую практику в середине ХХ века почти одновременно с эпохой становления хирургического лечения пороков сердца. Антагонисты витамина К и по сей день являются единственными и безальтернативными доступными оральными антикоагулянтами для постоянного лечения пациентов с имплантированными искусственными клапанами сердца (ИКС). Клинические испытания II и III фаз исследований новых прямых (независимых от антитромбина III, селективных) ингибиторов тромбина, которые могли бы претендовать на роль альтернативы АКНД в профилактике тромботических осложнений у пациентов после имплантации ИКС, не увенчались успехом [Van de Werf F., 2012]. В тоже время, существующее для антикоагулянтов терапевтическое окно достаточно узкое. Данный факт особо значим для пациентов с ИКС, поскольку с одной стороны его ограничивает риск развития тромбоэмболий, с другой – кровотечений, составляя до 75% всех послеоперационных осложнений [Koertke Н., 2007]. Согласно последним данным это можно объяснить не только поступлением в организм витамина К с пищей, заболеваниями органов ЖКТ, но и со-четанным применением лекарственных средств (ЛС) других групп и генетической предрасположенностью, а именно полиморфизмом гена CYP2C9 - кодирующего основной фермент биотрансформации АКНД [Шевела А.И., 2008]. Существует более 20 аллельных вариантов для данного гена, но самым распространенным из них является CYP2C9*1, так называемый «дикий» тип. Терапевтический диапазон МНО у пациентов с генотипом CYP2C9*1 достигается при стандартном назначении доз антикоагулянтов. Достаточно часто встречаются
и аллельные варианты «медленного» типа СYP2С9*2 и СYР2С9*3, ассоциированные с высокой чувствительностью к варфарину. Имеются сообщения, что сочетание генотипирования по CYP2C9 с фенотипи-рованием (определение активности гена CYP2C9 с помощью лозарта-нового теста) может более точно прогнозировать терапевтическую дозу варфарина [Li Z., 2009]. При этом не исключают действие и такого генетического фактора как эпоксид редуктазы витамина К (VKORC1), который является молекулой мишени для варфарина и тоже влияет на чувствительность к нему [D'Andrea, 2005].
В связи с этим, в настоящее время актуальна разработка новых комплексных фармакогенетических подходов повышающих безопасность и эффективность терапии АКНД у пациентов после имплантации ИКС в условиях полифармакотерапии и учитывающих полиморфизм генов VKORC1 и CYP2C9, а также активность CYP2C9.
Цель исследования: оценить особенности влияния генетических факторов (полиморфизм генов CYP2C9 и VKORC1), активности фермента биотрансформации CYP2C9 и межлекарственного взаимодействия на антикоагулянтное действие варфарина у пациентов после имплантации искусственных клапанов сердца в раннем и позднем послеоперационном периоде.
Задачи исследования:
-
Определить частоту встречаемости генотипов по полиморфным маркерам генов CYP2С9 и VKORC1 (G3673A) и их сочетаний, участвующих в метаболизме варфарина, у пациентов кардиохирурги-ческого профиля.
-
Сопоставить подобранные дозы варфарина раннего и позднего послеоперационного периода с полиморфизмом генов CYP2C9 и VKORC1(G3673A).
-
Оценить влияние полиморфизма гена CYP2C9 на активность CYP2C9 по лозартановому тесту у пациентов до имплантации ИКС.
-
По результатам лозартанового теста оценить взаимосвязь между концентрацией активного метаболита Е-3174 и подобранной дозой варфарина в раннем и позднем послеоперационном периоде.
-
Изучить влияние межлекарственного взаимодействия на поддерживающую дозу варфарина в раннем послеоперационном периоде в зависимости от полиморфизма генов CYP2C9 и VKORC1(G3673A).
Научная новизна диссертации.
Впервые в российской медицине оценено влияние полиморфизма генов CYP2С9 и VKORC1 на особенности дозирования и антикоау-лянтное действие непрямого антикоагулянта варфарина у пациентов с ИКС в раннем и позднем послеоперационном периоде.
Впервые в мире у пациентов с ИКС, по результатам лозартаново-го теста, выявлена взаимосвязь между концентрацией активного метаболита лозартана в моче и подобранной дозой варфарина в позднем послеоперационном периоде.
Впервые в российской популяции оценено влияние межлекарственного взаимодействия на особенности режима дозирования вар-фарина в зависимости от генотипов по CYP2С9 и VKORC1(G3673A) у пациентов с ИКС в раннем послеоперационном периоде.
Практическая значимость работы
Показана необходимость определения носительства генотипов CYP2C9 и VKORC1(G3673A) всем пациентам перед имплантацией ИКС, которым планируется назначение варфарина. Пациентам, планируемым назначение варфарина определение носительства генотипов CYP2C9 целесообразно дополнять определением активности CYP2C9 (по лозартановому тесту).
В раннем послеоперационном периоде у кардиохирургических больных с генотипами CYP2C9*1/*1 и VKORC1-G3673A(GG/GA) необходимо учитывать взаимодействие варфарина с антимикробными препаратами (антибиотиками, противогрибковыми средствами), амиодароном, преднизолоном и другими ЛС, которые также могут оказывать влияние на процессы биотрансформации. После отмены сопутствующей терапии, влияющей на биотрансформацию варфари-на, у этой категории больных целесообразно проводить более строгий контроль МНО с последующей коррекцией дозы АКНД.
Положения, выносимые на защиту
Режим дозирования варфарина у пациентов с ИКС зависит от генотипов по CYP2С9 и VKORC1(G3673A) только в позднем, но не в раннем послеоперационном периоде.
Низкая концентрация лозартана в моче (менее 2500 нг/мл по ло-зартановому тесту) до имплантации ИКС выявляет низкую активность CYP2C9*1/*1, что ассоциировано с подбором более низких доз варфарина в позднем послеоперационном периоде.
Массивная полифармакотерапия в раннем послеоперационном периоде влияет на режим дозирования варфарина у пациентов с генотипами CYP2C9*1/*1 и GG/GA по полиморфному маркеру G3673A гена VKORC1.
Реализация результатов работы
Научные положения и практические рекомендации, сформулированные в диссертации, внедрены в клиническую практику и нашли применение в отделениях кардиохирургического профиля ФГБУ «НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева» РАМН. Результаты, полученные при выполнении диссертационного исследования, можно рекомендовать в клиническую практику кардиохирургических и кардиологических стаци-
онаров, занимающихся лечением больных с ИКС. Полученные данные также могут быть использованы в клинико-фармакологических исследованиях для изучения фармакокинетического и фармакодина-мического взаимодействия варфарина с другими лекарственными препаратами.
Публикации результатов исследования
По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе 5 статей в ведущих рецензируемых научных изданиях, определенных ВАК.
Апробация диссертационного материала
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на ежегодном XVII всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН (Москва, 2010, 2011 и 2013 гг). На международном конгрессе по персонализированной медицине в феврале 2012 г. (г. Флоренция, Италия). На второй конференции Европейской ассоциации предиктивной, профилактической и персонализированной медицины «фармакогеномика: от клетки к клинике» в сентябре 2013 г. (Лиссабон). На конгрессе европейской ассоциации прогнозирования, профилактики и индивидуализации медицины (Брюссель) в сентябре 2013 г. На первом заседании Балтийского общества физиологов (г. Каунас, Литва), май 2013 г.
Объем и структура работы
Влияние изофермента цитохрома Р-450 2С9 и гена VKORC1 на антикоагулянтное действие варфарина
В большинстве случаев эффективная и безопасная терапия ЛС зависит от концентрации препарата в молекуле-мишени, которая в свою очередь зависит от процессов всасывания, распределения и элиминации. Из организма ЛС выводятся путем биотрансформации, чаще через печень и/или слизистую оболочку кишечника, и/или экскрецию ЛС через почки с мочой и/или печенью с желчью [24]. Наибольшее количество изофермента цитохрома Р450 (CYP2С9) располагается в эндоплазматическом ретикулуме гепатоцитов печени, где и происходит I фаза биотрансформации, в то время как II фаза биотрансформации ЛС происходит с участием таких ферментов как N-ацетил- и глюкуронозилтрансфераза [14]. Изофермент цитохрома Р-450 является одним из основных ферментов, осуществляющих биотрансформацию всех известных химических соединений. В настоящее время выделено 53 гена и 24 псевдогена цитохрома Р-450, расположенных в разных локусах различных хромосом [103]. На данный момент известно более 1000 изоформ цитохрома Р-450, которые разделены на семейства, а те в свою очередь на подсемейства. Изоферменты CYP2C8, CYP2C9, CYP2C18, CYP2C19 входят в одно из этих подсемейств. CYP2С9 является главным ферментом метаболизма АКНД (варфарина) [24]. Варфарин представлен в виде рацемической смеси стереоизомеров R- и S-варфарина, метаболизм которых осуществляется различными изоферментами цитохрома Р-450. Следует отметить, что основная антикоагулянтная функция осуществляется S-варфарином, который метаболизируется через генотип CYP2С9, в то время как метаболизм R-варфарина происходит через другие изоферменты цитохрома [3]. Мишенью для R- и S-варфарина является не только К-эпоксид-редуктазный комплекс, но и редуктаза хинона витамина К, способствующая восстановлению хинона витамина К до гидрохинона витамина К (схема 1.2.1).
Схема 1.2.1 Метаболизм и антикоагулянтное действие варфарина [Байдак Д.В. 2007] Изофермент цитохрома Р-450 2С9 локализован в 10-й хромосоме, локуса 10q24.1.24.3 и состоит из 55 тысяч пар оснований. СYP2С9 метаболизирует более 20% всех ЛС, а также многочисленные эндогенные соединения [2]. Существует более 20 аллельных вариантов для данного гена, но самым распространенным из них является CYP2C9 1, так называемый «дикий» тип. У лиц с «диким» типом аллельного варианта биотрансформация кумаринов, в том числе варфарина, происходит с нормальной интенсивностью и терапевтический диапазон МНО достигается при назначении стандартных доз антикоагулянтов [25]. Часто встречают и аллельные варианты «медленного» типа CYP2C9 2 и CYP2C9 3 гена CYP2C9. Данные генотипы имеют аминокислотные замены CGT TGT Argl44Cys и АТТ СТТ Ile359Leu и обладают сниженной скоростью метаболизма оральных антикоагулянтов и других лекарственных субстратов CYP2C9 [23, 75, 117].
Аллельный вариант CYP2C9 4 выявлен только у монголоидной расы, причем встречается данный аллель достаточно редко, а НЛР при применении ЛС, метаболизирующихся через CYP2C9, у носителей данной аллели возникают чаще [32]. Не так давно у негроидной расы были найдены «медленные» аллели CYP2C9 5 и CYP2C9 6, частота встречаемости которых составляет не более 1% [25]. Высокая частота встречаемости аллельного варианта CYP2C9 8 выявлена среди афроамериканцев. Генотипирование данной аллели в этой расовой группе может прогнозировать дозу варфарина. В кавказской популяции выявлены следующие аллельные варианты: CYP2C944 (R125H), CYP2C945 (S162X), CYP2C946 (Т299А), CYP2C947 (P382S), CYP2C948 (D397A) и CYP2C949 (Q454H); их влияние на метаболизм ЛС находится в стадии изучения [37, 46, 54]. Частота встречаемости генотипов CYP2C9 медленного метаболизма в различных этнических группах представлена в таблице 1.2.1. Очевидно, что исследования, посвященные изучению влияния генетических аспектов на антикоагулянтную терапию в различных этнических группах, весьма актуальны. Бесспорно, данные исследования необходимы и в такой многонациональной стране как Россия. Таблица 1.2.1. Распространенность «медленных» метаболизаторов CYP2C9 в различных популяциях [Сычев Д.А., 2006] Исследования, изучающие влияние носительства аллельных вариантов CYP2C9 2 и CYP2С9 3 на антикоагулянтную терапию варфарином, показали, что риск кровотечений и гипокоагуляций (МНО более 4) у этой категории больных возрастает в несколько раз [4, 60, 107, 122, 127]. При этом во многих исследованиях выявлено повышение концентрации S-варфарина в плазме крови и снижение клиренса варфарина из-за его медленного метаболизма [24, 58, 91]. Низкие подобранные дозы варфарина и быстрое достижение терапевтического диапазона МНО у пациентов носителей «медленных» аллельных вариантов (CYP2C9 2 и CYP2С9 3) продемонстрировано во многих исследованиях. В 72% случаев низкие терапевтические дозы варфарина (менее 26,25 мг/нед) были подобраны у этой категории больных в исследованиях, проводимых Scordo M.G. и соавт. (2002) [111]. Peyvandi F. и соавт. (2004) обнаружили, что у 65-66% гомозиготных и гетерозиготных носителей аллельных вариантов CYP2C9 2 и CYP2С9 3 на 4 день после начала приема варфарина показатель МНО приближается к 3 [106]. Тогда как лишь у 33% гомозигот с генотипом CYP2C9 1/ 1 через 4 дня после лечения варфарином достигается подобное значение МНО. Влияние аллельных вариантов CYP2C9 2 и CYP2С9 3 на антикоагулянтную активность изучено не только в зарубежных [81, 94, 113], но и отечественных исследованиях [4, 20, 22, 24]. Сироткина О.В. и соавт. (2004), Мишин И.В. и соавт. (2007) получили аналогичные данные у больных после имплантации ИКС – носители аллельных вариантов CYP2C9 2 и CYP2С9 3 быстрее достигали терапевтического диапазона гипокоагуляции, что требовало снижения дозы варфарина [19, 22]. В исследовании Булытовой Ю.М. и соавт. (2009) эпизоды чрезмерной гипокоагуляции развивались достоверно чаще (до 85% случаев) у пациентов-носителей аллельных вариантов CYP2C9 2 и CYP2C9 3 с ФП по сравнению с пациентами-носителями «дикого» типа [4]. Влияние аллельных вариантов CYP2C9 2 и CYP2C9 3 на режим дозирования варфарина у больных с постоянной формой ФП продемонстрированно в работе Михеевой Ю.А. и соавт. (2008 г) [19]. У пациентов-носителей «дикого» типа (CYP2C9 1/ 1) средняя терапевтическая доза варфарина составила 6,1 мг/сут, тогда как у пациентов с аллельными вариантам CYP2C9 2 и CYP2C9 3 терапевтическая доза варфарина была достоверно ниже - 3,6 и 3,1 мг/сут. VKORC1 – молекула-мишень для оральных антикоагулянтов (в том числе варфарина) расположенная в эндоплазматическом ретикулуме гепатоцитов [103]. Полиморфизм гена VKORC1 в настоящее время также связывают с неадекватным ответом организма на введение оральных антикоагулянтов. Мутация гена, кодирующего субъединицу 1 комплекса VKORC1, ассоциирована с кумаринорезистентностью, а врожденный дефицит витамина К-зависимых факторов – с кровотечениями. В настоящее время известно более 10 однонуклеотидных замен в гене VKORC1. Системный обзор и мета-анализ показал, что у пациентов с полиморфизмом гена VKORC1 чаще отмечается гипокоагуляция и значение МНО выше терапевтического диапазона, требующее тщательного контроля МНО при назначении варфарина. Также отмечены изменения режима дозирования варфарина в зависимости от этнических принадлежностей пациентов [127]. Режим дозирования варфарина в зависимости от полиморфизма гена VKORC (С1173Е) был изучен у 147 пациентов, включенных в исследование, проведенное D`Andrea и соавт. (2005) [44]. Средняя терапевтическая доза варфарина у носителей генотипа СС по полиморфному маркеру С1173Е составила 6,2 мг/сут, у носителей СТ генотипа – 4,8 мг/сут. Наличие у пациентов генотипа ТТ ассоциировано с более низкими дозами варфарина – 3,5 мг/сутки. Аналогичные результаты были получены в исследованиях Reitsma Н.Р. и соавт. (2005), проводимых на фоне приема пациентами аценокумарола и фенпрокумона, Байдак Д.В. и соавт. (2007) – у пациентов, принимающих варфарин и аценокумарол [3, 100].
Влияние некоторых генотипов VKORC1 на терапевтические дозы варфарина показано в работе Rieder М.J. и соавт. (2005) [102]. Средние терапевтические дозы варфарина у пациентов-носителей генотипа АА составили 2,7±0,2 мг/сут, у носителей генотипа АВ – 4,9±0,2 мг/сут и у пациентов с ВВ генотипом – 6,2±0,3 мг/сут (р 0,001). Исследователи полагают, что носительство генотипа АА связанно с низким содержанием VKORC1 в гепатоцитах из-за низкой экспрессии данного гена, в то время как носительство генотипа ВВ связано с более высоким содержанием VKORC1 из-за его повышенной экспрессии. Изучение влияния носительства генотипов (VKORC1)G-1639A у 104 китайцев на фармакодинамику варфарина показало, что пациенты с генотипом АА более чувствительны к варфарину по сравнению с пациентами-носителями генотипа GG (p 0,0001). Распространенность генотипа АА по полиморфному маркеру G-1639A гена VKORC1 среди китайцев составила 82%, тогда как в кавказской этнической группе АА генотип был выявлен лишь в 14% случаев, в то время как АG и GG генотипы составили 47% и 39% соответственно [128].
Влияние полиморфизма генов CYP2C9 и VKORC1 на формакокинетику и фармакодинамику лозартана
Побочные реакции, связанные с межлекарственными взаимодействиями, – ключевая проблема в клинической практике врача. В последние десятилетия появились четкие представления о механизмах взаимодействия ЛС, а также способы индивидуализации фармакотерапии. Узкий терапевтический интервал гипокоагуляции при назначении АКНД диктует необходимость тщательного и настороженного подбора поддерживающей дозы. Учет генетических и фенотипических особенностей пациентов может приводить к более безопасному и эффективному подбору доз непрямых антикоагулянтов. В последние годы для определения фенотипических особенностей пациентов проводят лекарственные пробы, позволяющие определить активность того или иного гена метаболизирующего конкретный препарат.
Изофермент цитохрома Р-450 2С9 также принимает участие в метаболизме антагониста ангиотензиновых рецепторов лозартана. Лозартан – первый блокатор ангиотензиновых рецепторов, который нашел применение в клинической практике у больных с артериальной гипертензией (АГ), начиная с 1989 г. Метаболизируется лозартан с участием гена CYP2C9 с образованием первичного неактивного метаболита E-3179 и слабоактивных метаболитов М1, M2, M5, M7. В последующем из Е-3179 образуется активный метаболит E-3174 (схема 1.3.1), который блокирует ангиотензиновые рецепторы в кровеносных сосудах, тем самым снижая АД [14, 119].
Роль генотипов CYP2C9 в фармакокинетике антагонистов ангиотензиновых рецепторов в настоящее время изучена не достаточно хорошо. По данным Yasar U. и соавт. (2002) у носителей аллелей CYP2C9 2 и CYP2C9 3 максимальная концентрация активного метаболита (Е-3174) после приема лозартана достоверно ниже (р 0,05), чем у пациентов с аллельным вариантом CYP2C9 1 [130]. Причем, именно у носителей аллели CYP2C9 3 концентрация Е-3174 в моче (собранной в течение 8 часов после приема лозартана) была в 40 раз меньше (p 0,01) по сравнению с пациентами, не несущими данные аллели (график 1.3.1). Авторы предполагают, что у носителей аллелей CYP2C9 2 и CYP2C9 3 низкая концентрация Е-3174 в моче обусловлена нарушением ее образования из-за низкой активности CYP2C9.
Метаболическое отношение (МО) – отношение концентрации активного метаболита к концентрации лозартана у носителей генотипа CYP2C9 l/ 3 через 6 часов после приема 25 мг лозартана достоверно ниже по сравнению с МО у носителей CYP2C9 l/ 1 [113]. Эти данные подтверждены и в более крупном исследовании, проводимом среди тюрков. В группе здоровых добровольцев достоверных различий в метаболизме лозартана у носителей генотипов CYP2C9 1 и CYP2C9 2 выявлено не было (МО 0,85 и 0,71 соответственно), при этом среднее МО у пациентов с генотипом CYP2C9 1/ 3 было достоверно выше – 2,35 (р 0,05) [36]. Снижение метаболизма лозартана также отмечено у пациентов с генотипами CYP2C9 5 и CYP2C9 6, в то время как у носителей генотипов CYP2C9 8 и CYP2C9 11 показатели МО лозартана сопоставимы с показателями МО носителей CYP2C9 1/ 3 [32]. Нельзя не отметить, что Lee C.R. и соавт. (2003) в своем исследовании не выявили различий в фармакокинетике лозартана и его активного метаболита у здоровых добровольцев с полиморфизмом гена CYP2C9. Li Z. и соавт. (2009) исследовали фармакокинетику лозартана у пациентов с аллельными вариантами CYP2C9 1/ 1, CYP2C9 1/ 3 и CYP2C9 13 [79]. Через 24 часа после однократного приема 50 мг лозартана в плазме крови определялся его метаболит Е-3174. У носителей аллели CYP2C9 13 оказался более длинный период полувыведения лозартана и его метаболита Е-3174 по сравнению с носителями аллельных вариантов CYP2C9 1/ 1 и CYP2C9 1/ 3. Также статистически отличался период полувыведения лозартана у пациентов с аллельным вариантом CYP2C9 1/ 3 по сравнению с носителями CYP2C9 1/ 1. Joy M.S. и соавт. (2009) изучали влияние цитохрома P450 CYP2C9 ( 2 и 3) на метаболизм лозартана и выведение его активного метаболита Е-3174 у пациентов с первичными и вторичными заболеваниями почек [66]. В большей части случаев у больных с различными аллельными вариантами отмечена менее благоприятная тенденция к снижению протеинурии (-31.7+/-156 против -125+/-323 %; p=0.123). У пациентов с вторичными заболеваниями почек наблюдалось недостаточное снижение диастолического (ДАД) – (9.8+/-16.0 против -3.2+/-10.6 мм рт.ст.; p=0.043) и систолического АД (САД) – (16.2+/-27.1 против -5.5+/-17.5 мм рт.ст.; p=0.044) при различных аллельных вариантах CYP2C9. Аналогичные данные были получены Lajer M и соавт. (2007) у пациентов с сахарным диабетом 1 типа [73].
В последние годы изучают не только межлекарственные взаимодействия, но и взаимодействия пищевых продуктов, в том числе и соков с ЛС [50, 52, 59, 135]. В своем исследовании Аникин Г.С. и соавт. (2010) в моче здоровых добровольцев определяли концентрацию активного метаболита лозартана Е-3174 в зависимости от полиморфизма гена CYP2C9 исходно и после однократного приема клюквенного сока и флуконазола [1]. Статистически значимые различия в значениях концентрации E-3174 обнаружены исходно и после приема клюквенного сока, тогда как прием флуконазола значимо не влиял на концентрацию активного метаболита (диаграмма 1.3.2). Исследуя метаболическое отношение, авторы также выявили низкую активность CYP2C9 у носителей генотипов CYP2C9 1/ 3- 3/ 3 по сравнению с носителями генотипа CYP2C9 1/ 1 (диаграмма 1.3.3). Диаграмма 1.3.2. Значение концентрации E-3174 в группах 1 (CYP2C9 1/ 1) и 2 (CYP2C9 1/ 3+ 3/ 3) в исходе на фоне приема клюквенного сока и флуконазола (Аникин Г.С., 2010) (отмечено значение p) Диаграмма 1.3.3. Значение метаболического отношения в группах 1 (CYP2C9 1/ 1) и 2 (CYP2C9 1/ 3+ 3/ 3) в исходе на фоне приема клюквенного сока и флуконазола (Аникин Г.С., 2010) Таким образом, учитывая тяжесть состояния больных после имплантации ИКС, сопутствующее назначение различных ЛС, влияющих на метаболизм варфарина, и высокий риск развития кровотечений перспективна индивидуализация антикоагулянтной терапии. Определение полиморфизма генов CYP2C9 и VKORC1, а также активности CYP2C9 с помощью лозартанового теста позволит получить достоверную информацию о поддерживающей дозе варфарина, частоте развития кровотечений и колебаний значений МНО у пациентов с имплантированными ИКС в условиях полифармакотерапии. В связи с этим, изучение генетического полиморфизма фермента метаболизма варфарина, а также его активности в сочетании с молекулой-мишенью антагониста витамина К позволит прогнозировать риск п/о осложнений и индивидуализировать подход к назначению непрямых антикоагулянтов у этой категории больных.
Расщепление продуктов амплификации рестриктазами
Для определения активности гена CYP2C9 пациентам назначали однократно лозартан (Лозап, Zentiva, Словацкая Республика) в дозе 50 мг, который запивался 250 мг воды. Прием пищи был разрешен через 2 часа после приема лозартана. В течение 8 часов проводили сбор мочи, из которой отбирали образец объемом 10 мл, замораживали и хранили при температуре -15С до анализа концентраций. Также, в течение 8 часов сбора мочи каждый час проводили контроль состояния добровольца – сбор жалоб, контроль АД и ЧСС.
Определение концентрации лозартана и его метаболита Е-3174 в моче проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) со спектрофотометрическим детектированием. Метод разработан в лаборатории клинико-фармакологической экспертизы лекарственных средств (зав. лабораторией – д.ф.н., проф. Г.В. Раменская) Института клинической фармакологии ФГБУ «НЦ ЭСМП» Минздравсоцразвития.
К 1 мл пробы добавляли 1 мл дистиллированной воды, в течение 5 секунд встряхивали на аппарате Vortex, добавляли 125 мкл 0,1М H3PO4, вновь смешивали с помощью Vortex 5 секунд, затем добавляли 5 мл хлороформа, снова встряхивали на Vortex в течение 5 секунд. Посте этого пробу центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут. Пробу помещали в морозильную камеру (при температуре -37С) для заморозки водной фазы. Органический слой переносили в колбы для упаривания и упаривали досуха. Сухой остаток растворяли в 250 мкл подвижной фазы и аликвоту (10 мкл) вводили в хроматограф. Спектрофотометрический детектор, длин волны = 280 нм. Подвижная фаза – ацетонитрил: 0,1 М дигидрофосфат натрия (1:1,6), рН 3,5-4,0. Подвижную фазу перед использованием фильтровали и дегазировали под вакуумом. Скорость элюирования 1 мл/мин. При данных условиях время удерживания лозартана составило 11±0,2 минут, метаболита 6,7±0,1 минут. Статистический анализ результатов выполнен методами непараметрической статистики (точный двусторонний критерий Фишера, критерий Манна-Уитни) с помощью статистических программ Biostat и Instat. Различия считали статистически значимыми при р 0,05. Доверительный интервал (CI, confidence interval) представляет собой интервал значений, в пределах которого с вероятностью 95% находится ожидаемое значение рассматриваемого параметра. Для определения корреляции между количественными характеристиками пользовались коэффициентом ранговой корреляции Спирмана и линейным коэффициентом корреляции Пирсона. Коэффициент корреляции r от 0,3 до 0,5 при р 0,05 означал положительную умеренную, но достоверную корреляцию между признаками; r 0,5 при р 0,05 – сильную и достоверную связь; отрицательное значение r соответствовало обратной корреляции. Глава 3.
В результате генотипирования по полиморфному маркеру G3673A гена VKORC1 в сочетании с аллельным вариантом СYP2C9 l/ 2 у 16 пациентов с имплантацией ИКС были получены следующие результаты: ? пациенты, несущие генотип VKORC1 -G3673A(АА) в сочетании с аллельным вариантом СYP2C9 l/ 2 - 5 больных; ? пациенты, несущие генотип VKORC1 -G3673A(GA) в сочетании с аллельным вариантом СYP2C9 l/ 2 - 5 больных; ? пациенты, несущие генотип VKORC1 -G3673A(GG) в сочетании с аллельным вариантом СYP2C9 l/ 2 - 6 больных. Частота распределения генотипов по полиморфному маркеру G3673A гена VKORC1 в сочетании с аллельным вариантом СYP2C9 l/ 2 у пациентов с имплантацией ИКС была получена в следующих процентных соотношениях (диаграмма 3.1.4):
Проанализировав литературные источники по частотам аллелей и генотипов СYP2C9 и VKORC1(G367ЗА) стало ясно, что полученные нами результаты сопоставимы с результатами исследований, выполненных у жителей Нидерландов [100, 107]. Результаты нашего исследования также сопоставимы с результатами исследований, проведенных среди российских пациентов с ФП [3, 7] и пациентов с имплантацией ИКС [19].
Сопоставление подобранных доз варфарина раннего и позднего послеоперационного периода с полиморфизмом генов CYP2C9 и VKORC1(G3673A)
Анализ подобранных терапевтических доз варфарина в раннем п/о периоде проводился у 74 пациентов через 2 недели после его назначения. В план лечения кардиохирургических больных также входили ЛС, влияющие на биотрансформацию варфарина. Терапевтический диапазон подобранных доз варфарина в раннем п/о периоде у пациентов с аллельным вариантом CYP2C9 1/ 1 варьировал от 1,25 до 8,75 мг, что в среднем составило 4,8±1,9 мг/сутки. У носителей аллельного варианта CYP2C9 1/ 2 терапевтические дозы варфарина в раннем п/о периоде варьировали от 1,25 до 7,5 мг и в среднем составили 4,4±1,7 мг/сутки. У единственного пациента с аллельным вариантом CYP2C9 2/ 3 терапевтическая доза варфарина в раннем п/о периоде составила 3,75 мг/сутки. У носителей аллельного варианта CYP2C9 1/ 3 подобранные в раннем п/о периоде терапевтические дозы варфарина варьировали от 1,25 до 6,25 мг и в среднем составили 3,2±1,8 мг/сутки. Мы сравнили терапевтические дозы варфарина в раннем п/о периоде у пациентов с различными аллельными вариантами CYP2C9 с помощью непараметрического метода Манна-Уитни (диаграмма 3.2.1). Диаграмма 3.2.1. Терапевтические дозы варфарина, подобранные в раннем п/о периоде, у пациентов с различными аллельными вариантами CYP2C9 Терапевтические дозы варфарина, подобранные в раннем п/о периоде, у пациентов-носителей аллельного варианта CYP2C9 1/ 2 достоверно не отличались от доз варфарина, подобранных у носителей аллельного варианта CYP2C9 1/ 1 (4,2±1,7 мг vs 4,8±1,9 мг, р=0,32). Терапевтические дозы варфарина у пациентов-носителей аллельного CYP2C9 1/ 3 были достоверно ниже по сравнению с дозами варфарина носителей CYP2C9 1/ 1 (3,2±1,8 мг vs 4,8±1,9 мг, р=0,05). У пациентов-носителей аллельного варианта CYP2C9 1/ 3 терапевтические дозы варфарина в раннем п/о периоде достоверно не отличались от доз варфарина, подобранных у пациентов с аллельным вариантом CYP2C9 1/ 2 (3,2±1,8 мг vs 4,2±1,7 мг, р=0,24). Учитывая единичный случай выявления носительства аллельного варианта CYP2C9 2/ 3, мы не сравнивали его терапевтическую дозу варфарина с дозами варфарина других аллельных вариантов CYP2C9. Пациенты, не несущие генотип CYP2C9 1/ 1 (генотипы 2C9 1/ 2, 2C9 1/ 3 и 2C9 2/ 3), были объединены в одну группу; при расчете средних терапевтических доз варфарина был получен разброс дозировок от 1,25 до 7,5 мг/сутки, что в среднем составило 3,9±1,7 мг/сутки. В данном случае отмечалась тенденция к более низкой дозе варфарина по сравнению с пациентами, несущими аллельный вариант CYP2C9 1/ 1 (3,9±1,7 мг vs 4,8±1,9 мг, р=0,08) (диаграмма 3.2.2а). Пациенты с генотипами CYP2C9 1/ 3 и CYP2C9 2/ 3 сильнее ассоциированы с низкими дозами варфарина по сравнению с пациентами-носителями генотипов CYP2C9 1/ 1 и CYP2C9 1/ 2, поэтому они были разделены на 2 группы. При сравнительном анализе оказалось, что терапевтические дозы варфарина, подобранные в раннем п/о периоде, у объединенной группы пациентов с аллельными вариантами CYP2C9 1/ 3 и CYP2C9 2/ 3 были достоверно ниже по сравнению с дозами варфарина у пациентов с аллельными вариантами CYP2C9 1/ 1 и CYP2C9 1/ 2 (3,3±1,6 мг vs 4,6±1,9 мг, р=0,07) (диаграмма 3.2.2б). Диаграмма 3.2.2. Терапевтические дозы варфарина, подобранные в раннем п/о периоде, у пациентов-носителей аллельных вариантов: а) CYP2C9 1/ 1 и CYP2C9 не 1/ 1 (генотипы CYP2C9 1/ 2, CYP2C9 1/ 3 и CYP2C9 2/ 3); б) CYP2C9 1/ 1+ 1/ 2 и CYP2C9 1/ 3 + 2/ 3 Мы также проанализировали подобранные дозы варфарина у пациентов с различными генотипами по полиморфному маркеру G3673A гена VKORС1 в раннем п/о периоде. Терапевтические дозы варфарина у пациентов-носителей генотипов GG варьировали от 2,5 мг до 8,75 мг и в среднем составили 5,0±2,0 мг/сутки. У носителей генотипа GА разброс подобранных доз варфарина варьировал от 1,25 мг до 8,125 мг, что в среднем составило 4,7±1,8 мг/сутки. Терапевтический диапазон подобранных доз варфарина у пациентов с генотипом АА варьировал от 1,25 мг до 5 мг и в среднем составил 3,1±1,4 мг/сутки. По результатам сравнительного анализа были выявлены достоверно низкие терапевтические дозы варфарина у пациентов с генотипами АА по сравнению с дозами варфарина пациентов-носителей генотипов GА (3,1±1,4 мг vs 4,7±1,8 мг, р=0,004) и GG (3,1±1,4 мг vs 5,0±2,0 мг, р=0,006) (диаграмма 3.2.3). При этом достоверных различий между подобранными дозами варфарина у пациентов с генотипами GА и GG (4,7±1,8 мг vs 5,0±2,0 мг, р=0,665) выявлено не было. Диаграмма 3.2.3. Терапевтические дозы варфарина пациентов с различными генотипами по полиморфному маркеру G3673A гена VKORC1, подобранные в раннем п/о периоде Учитывая отсутствие статистически значимых различий между терапевтическими дозами варфарина у пациентов с генотипами GА и GG по полиморфному маркеру G3673A гена VKORC1, мы объединили их в одну группу. Средние терапевтические дозы варфарина у объединенной группы пациентов с генотипами GG и GА варьировали от 1,25 мг до 8,75 мг и в среднем составили 4,8±1,8 мг/сутки. В результате сравнительного анализа достоверно низкие дозы варфарина сохранялись у носителей генотипа АА по сравнению с группой пациентов носителей генотипов GG и GА (3,1±1,4 мг vs 4,8±1,8 мг, р=0,002) (диаграмма 3.2.4).
Диаграмма 3.2.4. Терапевтические дозы варфарина пациентов с генотипами VKORC- G3673A(АА) и VKORC-G3673A(GG/GА), подобранные в раннем п/о периоде При изучении влияния носительства аллельных вариантов CYP2C9 и генотипов по полиморфному маркеру G3673A гена VKORС1 на поддерживающие дозы варфарина в позднем п/о периоде было обследовано 59 пациентов из 76 оперированных (с 10 пациентами была потеряна связь, 4 пациента переведены на синкумар, 3 пациента продолжали принимать амиодарон). Пациенты, принимающие ЛС влияющие на биотрансформацию варфарина, в том числе амиодарон, в позднем п/о периоде были исключены из исследования. Анализ подобранных доз варфарина у данной категории больных проводили в период от 6 месяцев до 5 лет после имплантации ИКС. Терапевтические дозы варфарина, подобранные в позднем п/о периоде, у пациентов-носителей аллельного варианта CYP2C9 1/ 1 варьировали от 2,5 мг до 10 мг и в среднем составили 5,8±1,9 мг/сутки. У пациентов с аллельным вариантом CYP2C9 1/ 2 терапевтические дозы варфарина, подобранные в позднем п/о периоде, варьировали от 1,25 мг до 9,375 мг и в среднем составили 6,2±2,5 мг/сутки. Терапевтическая доза варфарина, подобранная в позднем п/о периоде, у единственного пациента с аллельным вариантом CYP2C9 2/ 3 составила 3,125 мг/сутки. Терапевтические дозы варфарина у пациентов-носителей CYP2C9 1/ 3, подобранные в позднем п/о периоде, варьировали от 2,5 мг до 5 мг и в среднем составили 3,6±1,2 мг/сутки.
Диаграмма 3.2.5. Терапевтические дозы варфарина, пациентов с различными аллельными вариантами CYP2C9, подобранные в позднем п/о периоде У пациентов с различными аллельными вариантами CYP2C9 также сравнивали терапевтические дозы варфарина, подобранные в позднем п/о периоде (диаграмма 3.2.5). Дозы варфарина, подобранные в позднем п/о периоде, у пациентов с аллельным вариантом CYP2C9 1/ 3 были достоверно ниже по сравнению с дозами варфарина пациентов-носителей CYP2C9 1/ 2 (3,6±1,2 мг vs 6,2±2,5 мг, р=0,016) и CYP2C9 1/ 1 (3,6±1,2 мг vs 5,8±1,9 мг, р=0,007). При этом достоверных различий между подобранными терапевтическими дозами варфарина у пациентов с аллельными вариантами CYP2C9 1/ 2 и CYP2C9 1/ 1 не наблюдали (6,2±2,5 мг vs 5,8±1,9 мг, р=0,454). Терапевтические дозы варфарина, подобранные в позднем п/о периоде, у объединенной группы пациентов с аллельными вариантами CYP2C9 1/ 2, CYP2C9 1/ 3 и CYP2C9 2/ 3 варьировали от 1,25 мг до 9,375 мг и в среднем составили 5,2±2,4 мг/сутки. При этом терапевтические дозы варфарина, подобранные у этих пациентов, достоверно не отличались от подобранных доз варфарина у пациентов-носителей аллельного варианта CYP2C9 1/ 1 (5,2±2,4 мг vs 5,8±1,9 мг, р=0,367). В то время как у объединенной группы пациентов с аллельными вариантами CYP2C9 1/ 3 и CYP2C9 2/ 3 терапевтические дозы варфарина были достоверно ниже, чем у объединенной группы пациентов-носителей CYP2C9 1/ 1 и CYP2C9 1/ 2 (3,6±1,2 мг vs 5,9±2,0 мг, р=0,005) (диаграмма 3.2.6).
Аналогичным образом мы проанализировали терапевтические дозы варфарина, подобранные в позднем п/о периоде, у пациентов с полиморфизмом гена VKORC1(G3673A), не принимавших ЛС, влияющих на биотрансформацию варфарина. Терапевтические дозы варфарина у пациентов-носителей генотипа GG варьировали от 2,5 мг до 9,375 мг и в среднем составили 6,1±2,2 мг/сутки. У носителей генотипа GА терапевтический диапазон подобранных доз варфарина варьировал от 2,5 мг до 10 мг и в среднем составил 6,0±1,9 мг/сутки.
![Влияние протезирования клапанов сердца на функциональное состояние правого желудочка в ближайшем послеоперационном периоде [Электронный ресурс]](/i/i/4481/206135.png "Влияние протезирования клапанов сердца на функциональное состояние правого желудочка в ближайшем послеоперационном периоде [Электронный ресурс] Айзенберг Леонид Владимирович")
