Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Литературный обзор 9
1.1. Биологически активные вещества в индустриальной аквакультуре...9
1.2. Использование витамина Ві2 (цианокобаламина) для улучшения физиологического состояния животных и рыб 23
Глава II. Материал и методы исследований 40
Глава III. Повышение эффективности нереста осетровых рыб с использованием цианокобаламина при искусственном воспроизводстве 49
3.1. Эффективность использования витамина Bt2 для подготовки производителей осетровых рыб к нересту в искусственных условиях 50
3.2. Использование витамина Ві2 для повышения резистентности осетровых рыб на ранних этапах онтогенеза 57
Глава IV. Результаты применения цианокобаламина в комплексе с витаминами С и Е для повышения репродуктивного качества производителей осетровых рыб 68
Глава V. Эффективность сохранения половых клеток рыб при криоконсервации с использованием витамина Ві2 77
5.1. Оценка эффективности использования различных криорастворов при замораживании спермы рыб 80
5.2. Применение цианокобаламина на начальных этапах криоконсервации спермы рыб 82
5.3. Применение цианокобаламина на этапах глубокого замораживания и хранения спермы осетровых рыб 89
Заключение 96
Выводы 101
- Использование витамина Ві2 (цианокобаламина) для улучшения физиологического состояния животных и рыб
- Эффективность использования витамина Bt2 для подготовки производителей осетровых рыб к нересту в искусственных условиях
- Использование витамина Ві2 для повышения резистентности осетровых рыб на ранних этапах онтогенеза
- Оценка эффективности использования различных криорастворов при замораживании спермы рыб
Введение к работе
Актуальность проблемы. Интенсивное развитие промышленности и сельского хозяйства в прошлом столетии существенно увеличило экологический прессинг на растительные и животные организмы, что возможно характеризовать как «антропогенная катастрофа» (Карнаухов, 1994). Экологическое состояние водных ресурсов планеты близко к критическому или таковым уже является. Последнее относится также к Каспийскому и Азовскому бассейнам. Уникальные запасы ценных видов рыб находятся здесь под влиянием широкого спектра разносторонних воздействий (Иванов и др., 1995 а, б). Особенно в этом плане страдают осетровые рыбы, как наиболее ранимые, легко подверженные действию токсических веществ и мутагенных комплексов. Необходимо отметить, что на фоне общего антропогенного пресса действие токсических веществ занимает ведущее положение, снижая качество производителей и их половых продуктов, вызывая различные отклонения в развитии эмбрионов, личинок и молоди на разных стадиях онтогенеза (Баранникова, 1989,1992; Vlasenko, 1996; Ходоревская и др., 1997).
Ресурсы морей и океанов не безграничны. Поэтому в последние десятилетия в мире активно развивается аквакультура, т.е. выращивание рыб и других гидробионтов в управляемых условиях (Остроумова, 2001).
Одним из перспективных направлений повышения качества производителей и их потомства на рыбоводных предприятиях является использование биологически активных веществ как естественного, так и искусственного происхождения, обладающих токсикопротекторным и иммуномодулирующим действием на животные организмы, в частности на рыб на различных стадиях развития (Егоров, 1997). В настоящее время применяется несколько групп веществ, повышающих жизнестойкость рыб. Существует метод повышения жизнестойкости лососевых рыб за счет выдерживания их оплодотворенной икры в нарастающих концентрациях хлорида натрия (Павлов,
5 1980). Другой способ основан на применении смеси антиоксидантов для сохранения в норме окислительно-восстановительного состояния живой ткани ослабленных особей (Чернышев, Тамбиев, 1980). К третьей группе биологически активных веществ можно отнести нейропептиды, повышающие жизнестойкость организма посредством воздействия на нервную систему (Способ стимуляции..., 1987). Четвертая группа веществ включает витамины.
Витамины группы В определяют общее состояние здоровья. Если они поступают в достаточном количестве, то организм может жить без животных белков. Когда же их не хватает, остальные витамины теряют большую часть своего значения и действия.
Некоторые витамины не синтезируются в организме или синтезируются в недостаточных количествах и должны поступать извне. Таким витамином является цианокобаламин, или витамин Bi2. Его основное значение - в антианемическом действии, к тому же он оказывает влияние на процессы обмена веществ. Ранее проводились опыты по использованию цианокобаламина для повышения жизнеспособности эмбрионов и молоди лососевых и карповых рыб, повышения их токсикорезистентности (Глубоков, 1986, 1988; Духовенко, Сергеева, 1996). Его растворимость в воде упрощает приготовление растворов, которые в дальнейшем применяются для обработки икры.
Применение витаминных инъекций цианокобаламина в качестве сильного биологического стимулятора развития позволит улучшить физиологические и рыбоводно-биологические показатели производителей рыб и существенно повысить устойчивость их потомства к неблагоприятным факторам среды на ранних этапах онтогенеза.
Цель и задачи исследований. Целью данной работы явилась оценка действия цианокобаламина на репродуктивные качества производителей осетровых рыб в период нереста, его влияния на жизнестойкость потомства, а также на усиление криопротекторного действия при криоконсервации половых клеток различных видов рыб.
Поставленная цель определила следующие задачи: - определить оптимальную норму введения цианокобаламина в виде инъекций самкам осетровых рыб в преднерестовый период; определить концентрации цианокобаламина для повышения жизнеспособности эмбрионов при обработке икры осетровых рыб; - исследовать влияние цианокобаламина на резистентность осетровых рыб в период эмбрионального развития; - оценить физиологическое состояние молоди осетровых рыб, полученной от икры, обработанной витамином; изучить влияние комплек оценить криопротекторный эффект при добавлении цианокобаламина в среды для криоконсервации половых клеток различных видов рыб.
Научная новизна. Впервые научно обоснована целесообразность и эффективность использования цианокобаламина для инъецирования осетровых рыб в преднерестовый период, повышения жизнеспособности икры осетровых при ее обработке, а также в качестве криопротектора в средах при криоконсервации спермы различных видов рыб. В результате проведенных исследований впервые определены нормы введения цианокобаламина в виде инъекций в период преднерестового содержания производителей русского осетра, севрюги и стерляди, Установлено, что введение витамина позволяет повысить процент созревания самок, оплодотворения икры, выход свободных эмбрионов. Впервые показано положительное влияние обработки икры цианокобаламином на резистентность личинок и молоди осетровых рыб.
Практическая значимость. Предложено использовать препарат цианокобаламина в рыбоводстве при инъецировании производителей во время подготовки к нересту. Кроме того, даны рекомендации по обработке икры осетровых рыб с целью повышения выживаемости потомства на ранних этапах развития. Разработана методика использования цианокобаламина для усиления
7 криопротекторного действия криосред при криоконсервации половых клеток осетровых, карповых и окуневых рыб.
Основные положения, выносимые на защиту.
Нормы введения витамина Ві2 для производителей осетровых рыб.
Методы обработки икры осетровых рыб цианокобаламином.
Нормы введения В|2 для усиления криопротекторного действия. Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы докладывались на научно-технической конференции профессорско-преподавательского состава АГТУ, 2004; Международной научной конференции АГТУ-75, 2005; Международном Семинаре «Современные технологии мониторинга и освоение природных ресурсов южных морей России», г. Ростов-на-Дону, 2005; Международной научно-практической конференции, посвященной 60-летию Московской рыбоводно-мелиоративной опытной станции и 25-летию ее реорганизации в ГНУ ВНИИР, Москва, 2005; Международной научно-практической конференции «Повышение эффективности использования водных биологических ресурсов Мирового океана», Москва, 2005; Первой научной конференции студентов и аспирантов базовых кафедр Южного научного центра РАН, Ростов-на-Дону, 2005; Второй ежегодной научной конференции студентов и аспирантов базовых кафедр Южного научного центра РАН, Ростов-на-Дону, 2006; Международной научной конференции «Состояние и перспективы развития фермерского рыбоводства аридной зоны», г. Азов, 2006.
Диссертационная работа выполнена в рамках Программы фундаментальных исследований ОНЗ РАН «Развитие технологий мониторинга, экосистемное моделирование и прогнозирование при изучении природных ресурсов в условиях аридного климата», темы управления «Севкаспрыбвод» «Разработка методов длительного хранения половых продуктов ценных видов осетровых рыб для дальнейшего применения с целью воспроизводства и формирования маточных стад на осетровых заводах Нижней Волги».
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ.
8 Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 132 страницах машинописного текста. Состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, приложения. Список литературы содержит 242 источника, из них 50 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 13 рисунками и 35 таблицами.
Выражаю глубокую благодарность и признательность научному руководителю доктору биологических наук, профессору Пономаревой Елене Николаевне за внимание, советы и помощь при выполнении диссертационной работы. Также благодарю всех коллег, внесших вклад в настоящую работу, особенно сотрудников лаборатории «Аквакультура и биологические ресурсы» Южного научного центра РАН, сотрудников кафедры «Аквакультура и водные биоресурсы» Астраханского государственного технического университета под руководством д.б.н., профессора Пономарева СВ. Благодарю специалистов Волгоградского, Донского, Бертюльского и Сергиевского осетровых рыбоводных заводов, Чаганского рыбопитомника за практическую помощь в проведении работ по теме диссертации.
Использование витамина Ві2 (цианокобаламина) для улучшения физиологического состояния животных и рыб
Ретинол (витамин А) принимает участие в обмене белков и минеральных веществ. Регулирует обмен веществ, обеспечивает функциональное состояние эпителиальных тканей. Отсутствие ретинола в пище тормозит рост рыб. Устранить это явление возможно лишь путем введения данного витамина в корм. Как правило, ретинол входит в состав витаминных премиксов для форели (ПФ-1В, ПФ-1М и др.), которые используются в составе полноценных сбалансированных рыбных кормов (Пономарев и др., 2002). Витамин Д (кальциферол) - один из немногих витаминов, который не вырабатывается растениями и не содержится в растительных продуктах. Он необходим для индукции синтеза кальцийсвязующего белка, активации обмена скелетного кальция, стимуляции всасывания кальция в пищеварительном тракте. Дефицит витамина Д вызывает патологические изменения в мышечной и костной тканях.
Источниками витамина Д являются рыбий жир, дрожжи, масляный и спиртовой растворы эргокальциферола. Витамин Д входит в состав премиксов для форели и используется в качестве витаминной добавки во все корма для рыб (Скляров и др., 1984; Пономарев и др., 2002).
Витамин Е (токоферол) обладает весьма широким действием в организме рыб. Он обеспечивает нормальную деятельность репродуктивных органов, а также нервной и мышечной тканей, способствует нормальному развитию эмбрионов, улучшает использование в организме других жирорастворимых витаминов. Дефицит витамина Е приводит к дегенеративным и дистрофическим изменениям в мышцах, в нервных клетках, жировой и цероидной дегенерации печени. Одним из первых симптомов недостаточности этого витамина может служить нарушение структуры мембран эритроцитов и увеличения их гемолиза под влиянием перекисей (Емелина и др., 1970; Hung, Cho etal, 1981; Cowey etal., 1983).
Витамин К (филохинон и менанхиноп) объединяет группу витаминов, природные его соединения в практике обычно не используются. Эти витамины повышают свертываемость крови, участвуют в образовании протромбина, стимулируют образование фибриногена и способствуют регенерации тканей. У рыб недостаток витамина К приводит к снижению свертываемости крови.
Витамин К в чистом виде не используется. Широко распространен викасол - бисульфитное производное метилнафтиохинона, представляющий собой мелкокристаллический порошок горького вкуса, растворимый в воде. (Скляров и др., 1984; Пономарев и др., 2002; Пономарева, 2002). К водорастворимым витаминам, которые необходимы для нормального роста и развития рыб, относят витамины группы В, а также С и Н. Тиамин (В]) входит в состав ферментов, необходимых для осуществления процессов декарбоксилирования. Тиамин участвует в регулировании углеводного обмена, поддерживает работу нервной системы (Чаговец и др., 1968).
Одной из важнейших областей применения витаминов является направленное воздействие на гаметогенез, что необходимо для любой биотехнологии разведения рыб. Особенно важны завершающие этапы гаметогенеза, в ходе которых управление позволяет получить качественные половые продукты. Так, у балтийского лосося установлена строгая корреляция между низким содержанием тиамина (Ві) у самок-производителей и развитием синдрома М74 у их потомства. Это подтверждает передачу дефицита витамина Ві от самок отложенной икре, а затем вылупившимся личинкам. Инъекции раствора тиамина внутрибрюшинно текучим самкам эффективно снижают смертность от М74-синдрома самок и их потомства (Долгачева и др., 2000; Amkoff, 2000).
У рыб, страдающих недостатком Bi, наблюдается нарушение равновесия, снижение потребления корма. Большое количество тиамина содержат кормовые дрожжи.
Рибофлавин (витамин BJ осуществляет реакции дегидрирования, входит в состав ферментов, которые влияют на обмен белка, некоторых витаминов (В3, В4. В6, оротовой кислоты). Вг участвует в углеводном обмене. Способствует образованию гликогена в печени. Связан с белковым обменом, поддерживает нормальную функцию половых желез и нервной системы.
Пантотеновая кислота (Вд) имеет большое значение в клеточном обмене. Это незаменимая составная часть кофермента А, который играет важную роль в белковом, углеводном, липидном обмене, участвует в синтезе ацетилхолина и стероидных гормонов. Как правило, используют не пантотеновую кислоту, а ее соли - пантотенат кальция и натрия (Витамины, 1974). Холин (витамин В4) необходим организму для осуществления жирового обмена. Холин входит в клеточные структуры как составная часть фосфолипидов. Основное значение этого витамина состоит в его липотропном действии, он служит для образования ацетилхолина, способствует синтезу в организме некоторых аминокислот (Колотилова, Глушанков, 1976).
Витамин В5 (РР, никотиновая кислота) входит в состав коферментов, поддерживающих тканевое дыхание. Участвует в углеводном, белковом и жировом обмене. Пиридоксин (витамин В$) участвует в белковом обмене, в частности, в переаминировании, декарбоксилировании и метилировании аминокислот. Участвует в обмене триптофана, метионина, цистина. Принимает участие в углеводном и жировом обмене, улучшает использование незаменимых жирных кислот (Ребров, Громова, 2003).
Цианокобаламин (витамин В12) вместе с фолиевой кислотой участвует в синтезе гемоглобина, а совместно с холином и метионином обладает липотропным действием. В2 принимает участие в синтезе нуклеиновых кислот, в обмене жира, углеводов, аминокислот. Недостаток в комбикормах вызывает замедление роста, снижает потребление пищи, содержание гемоглобина в крови и оказывает разрушающее действие на эритроциты (Осетров, 1989).
Витамин С (аскорбиновая кислота) участвует в окислительно-восстановительных процессах, в превращении нуклеиновых кислот, в синтезе стероидных гормонов, образовании коллагена, влияет на обмен серы, на уровень и накопление пировиноградной кислоты, инактивирует яды и токсины, обладает антиоксидантним действием (Раденко, 1997).
Витамин Н (биотин) входит в состав ферментов, участвующих в карбоксилировании, синтезе жирных кислот и некоторых белков. Современные комбикорма содержат много биотина, однако в связи с его низкой доступностью в кормосмесь следует вводить синтетические препараты биотина. Фолиевая кислота (витамин Вс) участвует в синтезе и обмене холина, катализирует синтез аминокислот, стимулирует синтез гемоглобина, влияет на использование витамина В12. Ее дефицит замедляет рост рыб, увеличивает их смертность. Фолиевая кислота особенно необходима для развития эмбрионов и молоди (Скляров и др., 1984; Пономарев и др., 2002).
Таким образом, использование биологически активных веществ в индустриальном рыбоводстве повышает адаптацию организма рыб к воздействию неблагоприятных факторов среды, ускоряет рост, а также способствует улучшению репродуктивных качеств производителей.
Эффективность использования витамина Bt2 для подготовки производителей осетровых рыб к нересту в искусственных условиях
Возможность применения данного препарата для повышения жизнестойкости и токсикорезистентности рыб требует выявления роли концентрации в растворе и длительности экспозиции в развитии искомого эффекта. Если принять гипотезу об определяющем влиянии общей дозы витамина, полученной организмом за время обработки, на эффективность повышения токсикорезистентности и жизнестойкости, можно ожидать, что витаминная обработка в режиме 0,4 мг/л - 6 ч. и 0,7 мг/л -4 ч. даст приблизительно одинаковые результаты, так как общая полученная доза в первом случае равна 0,4 х 6 = 2,4 мг/л х ч, во втором - 0,7 х 4 = 2,8 мг/л х ч, т.е. можно говорить о приблизительном равенстве доз в обоих случаях. Однако увеличенная концентрация витамина в течение меньшего времени больше повышает жизнестойкость и токсикорезистентность, чем обработка 0,4 мг/л цианокобаламина в течение 6 ч. так, в первом случае в течение 14 суток не наблюдается гибели обработанных витамином особей в растворе меди концентрацией 1,0 мг/л при гибели в той же концентрации 80 % необработанных особей. Гибель обработанных особей из контрольной группы в 1,5 раза ниже, чем необработанных. В то время, как во втором случае уменьшается процент гибели балтийского лосося в растворе меди концентрацией 1,0 мг/л всего на 3 % по сравнению с необработанными особями. Гибель обработанных и необработанных особей из контрольной группы практически одинакова (15 и 16 % соответственно). Следовательно, витамин Ві2 не вызывает дозозависимых различий в токсикорезистентности рыб в периоды раннего онтогенеза. При воздействии витамина В]2 на рыб определяющую роль играет не общая полученная доза, а концентрация препарата в растворе (Глубокое, 1986).
По-видимому, обработка витамином Ві2 приводит не к материальной кумуляции препарата, а посредством воздействия на рецепторы вызывает в дальнейшем повышение эффективности его усвоения при поступлении в организм с кормом и интенсификацию биосинтеза. Следовательно, можно сделать вывод о триггерном типе действия цианокобаламина в повышении жизнестойкости и токсикорезистентности рыб в ранние периоды онтогенеза (Глубоков, 1988).
Для оценки возможных отрицательных последствий влияния витамина Ві2 на рыб проведено сравнение обработанных и необработанных особей на организменном (рост), тканевом и клеточном (гематология) уровне.
В ходе исследования не отмечено нарушений скорости эмбриогенеза, массовости вылупления, процессов роста, возникновение конформационных переходов белковых молекул под влиянием витамина В12, как в контрольной группе особей, так и на фоне токсического действия фенола и меди.
Морфология клеток красной и белой крови также не изменялась после витаминной обработки; нарушений в лейкоцитарной формуле не отмечено. Однако по скорости созревания красной крови симы получены некоторые различия у обработанных и необработанных витамином особей (у остальных исследованных видов гематологические показатели не изучали). При фенольной интоксикации до 34 суток с момента вылупления соотношения зрелых форм клеток первичного и вторичного эритропоэза приблизительно одинаково у обработанных витамином особей и у необработанных. Однако, начиная с 34 суток после вылупления, у обработанных цианокобаламином особей скорость замены первичной красной крови на вторичную возрастает и достигает в некоторых опытах статистически достоверных различий по сравнению с необработанными особями. Так при интоксикации фенолом в концентрации 0,001 мг/л на 34 сутки с момента вылупления содержание вторичных зрелых эритроцитов у обработанных особей составляет 71,8 %, у необработанных 65,1 %. При воздействии фенола в концентрации 0,1 мг/л в этот же момент времени содержание вторичных зрелых эритроцитов у обработанных рыб составляет 72,3 % у необработанных - 65,8 %, у контрольных особей на 34 сутки с момента вылупления вторичные зрелые эритроциты составляют 64,7% от общего количества клеток красной крови. Различия по этому показателю у обработанных и необработанных особей статистически достоверны (уровень значимости - 0,9 %). Далее первичная кровь почти полностью сменяется вторичной, в результате чего необработанные особи нагоняют и почти выравниваются по содержанию элементов вторичной крови с обработанными особями, у которых эта смена происходит несколько раньше.
При интоксикации медью у обработанных витамином Bi2 особей скорость смены первичного эритропоэза вторичным еще выше, чем при фенольной интоксикации. Вначале, на 9- и 16-е сутки с момента вылупления, у обработанных особей несколько отставала смена первичной крови на вторичную, что выражалось в повышенном по сравнению с необработанными особями относительном содержании первичных зрелых эритроцитов и пониженном - вторичных. Причем на 16-е сутки эти различия становятся статистически достоверными.
Затем за 9 суток развития (с 25 по 34) у обработанных витамином особей резко интенсифицируется смена первичной красной крови на вторичную, в результате чего эта группа рыб на 34-е сутки с момента вылупления по относительному содержанию вторичных зрелых эритроцитов в крови достоверно опережает необработанных особей. Еще через 7 суток, как и в опытах с фенолом, завершается смена первичной крови на вторичную и характеризующие его показатели выравниваются у обработанных и необработанных особей (Глубоков, 1988).
Стимуляция кроветворения, отражающего физиологическое состояние развивающегося организма, свидетельствует о значительном повышении жизнестойкости подопытных особей под влиянием витамина Вп- Характерно, что ускорение смены первичной крови на вторичную наблюдали даже в отсутствии токсического действия. Действительно, цианокобаламин - сильный кроветворный фактор. Существуют данные о стимуляции им процесса кроветворения после лучевого поражения (Хохлов, Овчинников, 1969), что хорошо согласуется с результатами данного исследования.
Полученные результаты, дешевизна производства, возможность длительного хранения: в кристаллическом виде при комнатной температуре в темноте (цианокобаламин сохраняет свою активность в течение нескольких лет) (Витамины, 1974), растворимость в воде делают перспективным использование витамина В]2 в рыбоводстве в качестве сильного биологического стимулятора развития, повышающего жизнестойкость и токсикорезистентность рыб на ранних стадиях онтогенеза к действию токсикантов как органической, так и неорганической природы.
Однако, отсутствуют данные по влиянию циаиокобаламина на осетровых рыб, на повышение репродуктивных качеств производителей, а также использованию его для усиления криопротекторпого действия. Требуется проведение дополнительных исследований в этих направлениях.
Использование витамина Ві2 для повышения резистентности осетровых рыб на ранних этапах онтогенеза
Другой вид нарушения в развитии - недоразвитие борозд дробления, появление лишних борозд. Например, эмбрионы, у которых пять бластомеров вместо четырех. Встречались также яйца с выделившимся в центре бластомером. Кроме того, некоторые борозды дробления на концах имели раздвоения в виде вилочек. Это, в свою очередь, приводит к тому, что бластомери не участвуют в дальнейшем развитии. По данным Т.А. Детлаф и др. (1981), такие нарушения дробления происходят при резких перепадах температуры во время инкубации. Процент нарушений процесса дробления в опытной группе составил 2,4 %, что в 2 раза ниже, чем в контрольной.
В конце гаструляции чаще всего встречались аномалии, возникающие в результате нарушения клеточных перемещений в процессе гаструляции (Щепковски, Кольман, 2002). Во время инкубации икры русского осетра нарушения процесса гаструляции выражались в увеличении размера желточной пробки по сравнению с нормально развивающимися икринками (в опыте - 1,0 %, в контроле - 1,8 %), т.е. обрастание темных вегетативных клеток задерживается и зародыш переходит к следующему периоду, сохраняя желточную пробку значительного размера. В дальнейшем у него будут наблюдаться те или иные нарушения строения.
При исследовании проб икры на стадиях после гаструляции наблюдали неправильное строение головы (в опыте - 2,5 %, в контроле - 5,8 %), отмечали неправильную форму желточного мешка и отсутствие переднего отдела тела (единичные эмбрионы).
На стадии предличинки были обнаружены нарушения в строении тела. Среди них нарушения пропорций тела, развитие искривлений, укорачивание усиков, жаберных крышек. В основном встречались предличинки с искривленным телом (в опыте - 3,0 %, в контроле - 5,3 %). Все выше описанные нарушения могут быть последствием неправильного созревания ооцитов, приводящего к снижению качества икры и в последствии к развитию аномалий у эмбриона (Детлаф и др., 1981).
Таким образом, результаты исследований развития осетровых рыб в эмбриональном периоде свидетельствуют о повышении резистентности развивающихся эмбрионов и эффективности применения обработки витамином Біг в период подготовки икры к инкубации. Для более полной оценки эффективности использования витамина B[2 при обработке икры провели исследование состояния предличинок русского осетра в период подращивания. Анализ морфометрических показателей выявил некоторое преимущество тех из них, которые были получены от икры, обработанной витамином В]2 в концентрации 1,0 мг/л. Так, предличинки опытной группы отличались большей массой (на 2,7 мг) и длиной (на 1,0 мм), т.е. имели высокие потенции к росту (табл. 10).
У предличинок, полученных от икры, не обработанной витамином, отмечен значительный процент нарушений в развитии: у 5 % предличинок обнаружено искривление позвоночника, у 7 % - недоразвитие передних отделов головы. В опытном варианте таких нарушений было значительно меньше - 5,5 %. Предличинки опытной группы своевременно переходили на смешанное питание, следствием чего явилась их высокая выживаемость в опытной группе 88 %, в контроле - 80 %. В дальнейшем при изучении биохимического состава личинок русского осетра было выявлено, что рыба в опытном варианте отличалась хорошим физиологическим состоянием, о чем свидетельствовало высокое содержание протеина - 59,9 %, в контрольной группе этот показатель был ниже на 2,5 % (табл. 11). Содержание липидов в теле личинок опытной группы в сравнении с контрольной было выше на 1,4 %. Липидный статус рыб может характеризовать их способность преодолевать неблагоприятные условия, стрессы, действия низких температур, отсутствие достаточного количества пищи, влияние состава отдельных компонентов потребляемых кормов (Яржомбек и др., 1981;Катасковаи др., 1998). Было замечено, что в опытной группе личинки отличались активным поведением, лучше потребляли комбикорм и опережали в росте личинок контрольной группы. При выращивании молоди русского осетра лучшие показатели роста и выживаемости были отмечены в опытном варианте (табл. 12). Через 40 суток масса молоди составила 4,2 г и была выше на 14 %, чем в контроле. При оценке физиологического состояния рыб, особенно молоди, достаточно хорошим показателем является состав крови (Головина, Тромбицкий, 1989; Головина, 1998), поскольку именно эта ткань наиболее чувствительна к изменениям состояния организма. Результаты гематологического анализа крови молоди русского осетра представлены в таблице 13. Показатели крови молоди русского осетра, полученной от икры, обработанной цианокобаламином, характеризовались более высокой концентрацией гемоглобина (74 г/л), что свидетельствует об улучшении обмена веществ в организме рыб (Шестеренко, Стецюк, 1978). Число эритроцитов зависит, в основном, от возраста молоди и условий ее содержания. В крови молоди русского осетра опытной группы количество эритроцитов было несколько выше и составило 0,660 млн/мм3, тогда как у рыб контрольного варианта этот показатель был равен 0,653 млн/мм3. Анализ полученных и литературных данных позволил установить, что показатели крови рыб в опыте и в контроле в целом находятся в пределах принятых физиологических норм для осетровых рыб (Яржомбек и др., 1986). Исследования общего биохимического состава молоди русского осетра показали более высокое количество белка в теле рыб опытной группы (табл. 14). В этом варианте содержание белка в теле составило 67,7 % (на 2,7 % выше, чем в контроле), что свидетельствует о хорошем физиологическом состоянии выращенной молоди.
Оценка эффективности использования различных криорастворов при замораживании спермы рыб
Сохранение генетического разнообразия рыб, многие из которых или уже утеряны, или находятся на грани исчезновения, является острейшей проблемой охраны природы, а также современного рыбоводства (Ананьев и др., 2000). В Красную книгу Международного союза охраны природы и природных ресурсов занесено около 300 видов рыб и рыбообразных, а в Красную книгу России -более 50 видов, находящихся под угрозой исчезновения и требующих немедленного участия в их сохранении. Проблема сохранения, находящихся в угрожающем состоянии рыб, актуальна как для морских, так и для пресноводных объектов (Цветкова и др., 2004).
Одним из направлений в области сохранения популяций исчезающих видов рыб является криоконсервирование их половых продуктов. На протяжении последних пятнадцати лет отрабатывались методы низкотемпературной консервации спермы путем подбора оптимальных разбавителей, стабилизаторов, криопротекторов, режимов охлаждения-оттаивания на рыбах - объектах аквакультуры: осетровые - осетры сибирские (байкальская и ленская популяции), русский, сахалинский, амурский, каспийский, стерлядь окская и каспийская, севрюга кубанская, калуга, белуга, веслонос (Ананьев и др., 1998 а, б; Цветкова, 1998; Тихомиров и др., 1998; Багров и др., 2000 б; Billard et al., 2004); карповые - разные породные группы карпа, толстолобики белый и пестрый, амуры белый и черный, буффало черный и большеротый, амурский сазан (Каранова и др., 1994; Демкина и др., 1997); лососевые - форель радужная, озерная, камлоопс, Дональдсона, лососи -стальноголовый, балтийский, озерный, шуйский, сиг, ряпушка, кета сахалинская, пелядь, белорыбица (Каранова и др., 1994; Цветкова, 1998). К настоящему времени разработаны основные приемы и методы замораживания спермы осетровых, карповых, лососевых рыб (Копейка, 1986; Катасонов и др., 1988, 1994 а, б; Желтоножко, 1997; Цветкова и др., 1997; Ананьев и др., 1998 а; Ананьев и др., 1999; Андреев, 1996; Егоров, 2004, 2005; Савушкина, 2005). Криоконсервация спермы может оказаться удобным, надежным и единственно возможным способом искусственного воспроизводства и генетического улучшения некоторых видов рыб при определенных условиях: резком сокращении численности, уменьшении ареалов обитания, нарушении процессов воспроизводства (отсутствие самцов, разное время созревания самок и самцов и т.п.), деградации популяционной и генетической структуры, гибридизации территориально удаленных пород (групп, видов), необходимости сохранения уникальных объектов, полученных специальными генно-инженерными и другими специфическими методами (Ананьев и др., 1998; Цветкова и др., 2004).
Общая схема криоконсервации спермы одинакова для всех видов рыб. При температуре жидкого азота (-196С) большинство химических процессов прекращается. Замороженные клетки могли бы оставаться жизнеспособными многие сотни лет в отсутствие воздействия ионизирующей радиации (Цветкова, Каранова, 1994). Однако абсолютное большинство живых объектов гибнет, не достигнув при охлаждении таких температур. Это происходит, как показано криобиологами, еще в интервале температур от 0 до -50 С, если до замораживания не были приняты меры по их защите (Цветкова и др., 1997). Для защиты клеток от криоповреждений наиболее важны оптимальный выбор криопротекторов и режимы самого охлаждения.
К веществам, при замораживании защищающим клетки от повреждения и поэтому называемым криопротекторами, относят различные по химической природе соединения (простые и сложные сахара, лолигидроалкоголи (глицерин, этиленгликоль, пропандиол и др.), пептиды, полипептиды, гликопротеины и т.п.) со свойствами леднуклеирующих агентов, или антифризов, способствующих также частичной дегидратации клеток. Криобиологи причисляют к ним и вещества несколько иного плана: в молекулярной и клеточной биологии - это стабилизаторы клеточных мембран (фосфолипиды и т.п.), антиоксиданты (каротиноиды, витамин Е и т.п.), осмотически активные агенты. Они смягчают осмотический стресс, предотвращают свободноради-кальные повреждения клеточных мембран, стабилизируют их структуру (Вепринцев, Ротт, 1984; Манохина, Ананьев, 1996; Harvey 1996; Maisse, 1996).
Для всех видов рыб общим является включение в криозащитную среду проникающих криопротекторов: ДМСО (для осетровых, лососевых и некоторых карповых) и этиленгликоля (для карповых), а также непроникающих, таких как сахароза. Кроме того, для уменьшения количества поврежденных при замораживании клеток в разбавители вводится желток куриного яйца, лецитин которого имеет сродство с липопротеиновой мембраной спермиев и улучшает клеточный метаболизм (Копейка, 1986).
Не последнюю роль играет оптимизация температурных режимов охлаждения. Они так же, как и криопротекторы, влияют на процессы кристаллизации воды, дегидратацию клеток, развитие осмотического шока. Физико-химические процессы при этом довольно сложны (Вепринцев, Ротт, 1984; Вепринцев, Пилиев, 1989; Юрченко, 1989; Farrant, 1980; Polge, 1980; Erdahl et al., 1984; Fredrich, 1984; Rana, 1995; Harvey, 1996). Понимание их позволяет подбирать режимы криоконсервации для биологических объектов, часто не обладающих высокой криоустойчивостыо. Оно дает возможность также прогнозировать направления корректировки базовых режимов в связи с особенностями цитофизиологических характеристик новых объектов.
Не меньшее значение для успеха криоконсервации имеет способ размораживания и последующего манипулирования дефростированной спермой. Скорость оттаивания должна выбираться такой, чтобы свести до минимума рекристаллизацию остаточной внутриклеточной жидкости, образующейся при отогреве клеток.
Большое значение для успеха замораживания имеют физиологическое состояние и возраст рыб, взяты ли спермин в пик нереста, как бралась сперма 80 с помощью катетера или без него. Во время этой процедуры следует избегать попадания мочи, крови, воды в сперму во избежание активации спермиев и изменения осмотических характеристик семенной плазмы (Billard et al.,1980; 1995). Все это означает, что на результаты криоконсервации воздействует много факторов, учесть которые и свести к минимуму их негативное действие не всегда представляется возможным.
При цитологическом и биохимическом контроле качества дефростированной спермы выясняется, что в среднем только 10 - 20 % размороженных спермиев не обладают явными субклеточными и молекулярными признаками криоповреждений (Lahnsteiner et al., 1996). Выявлен примерно такой же процент спермиев, способных к оплодотворению.
Исследованиями установлено, что потомство, полученное в результате искусственного осеменения икры заморожено-оттаянной спермой, физиологически полноценно (Цветкова и др., 1997; Юрченко, 1989; Billard et al, 1980).
