Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы/ 9
1.1 Роль респираторных вирусов в формировании бронхообструктивного синдрома 9
1.2 Иммунологические аспекты влияния респираторных вирусов на формирование бронхообструктивного синдрома
1.2.1 респирлторно-синцитиальньїрївирус. 15
1.2.2 Метапневмовирус 17
1.2.3 Аденовирус 18
1.2.4 Ршювирус 20
1.2.5 Респира торные вир усы и ремоделріроваріие трахеобронхиального дерева 21
1.3 Возможности коррекции иммунологических изменений при
бронхообструктивном синдроме 23
глава 2 28
Материал и методы исследования 28
2.1 Общая характеристика обследованных детей 28
2.2 Иммунологические исследования 32
2.3 Статистический анализ результатов исследования 33
глава 3 36
Результаты собственного исследования 36
3.1 Клинико-лабораторная характеристика детей с острым бронхиолитом и обструктивиым бронхитом на фоне респираторно-синцитиальной и аденовирусной инфекций 36
3.2 Цитокиновый профиль при респираторно-синцитиальной и аденовирусной инфекциях 48
3.3 Катамнестическое наблюдение 56
глава 4 62
Обсуждение результатов исследования 62
Выводы 71
Практические рекомендации 72
Указатель литературы
- Иммунологические аспекты влияния респираторных вирусов на формирование бронхообструктивного синдрома
- Респира торные вир усы и ремоделріроваріие трахеобронхиального дерева
- Иммунологические исследования
- Цитокиновый профиль при респираторно-синцитиальной и аденовирусной инфекциях
Иммунологические аспекты влияния респираторных вирусов на формирование бронхообструктивного синдрома
При латентной аденовирусной инфекции в инфицированной клетке экс-прессируются только вирусные протеины (Е1А, ЕЗ/19К, Gpl9K) без репликации целой вирусной частицы, что может поддерживать воспалительный процесс в легочной ткани и приводить к развитию гормон-резистентной бронхиальной астмы и хронической обструктивной болезни легких [158]. Протеин ЕЗ/19К, свя 19 зывая МНС I класса, блокирует выход из эндоплазматического ретикулума на поверхность клетки комплекса МНС I класса и антигена вируса, что ведет к нарушению лизиса инфицированных клеток цитотоксическими лимфоцитами [52, 84]. Аденовирусный трансактиваторный протеин Е1А способен взаимодействовать с определенными протеинами инфицированной клетки, отвечающими за транскрипцию генов, тем самым влиять на повышение транскрипции, как своих генов, так и генов инфицированной клетки, что определяет латентное течение аденовирусной инфекции [204].
Конкурентное взаимодействие аденовирусного протеина Е1А с иптерфе-рон-регулирующим фактором (IRF) вместо протеина рЗОО/СВР (ко-активатора транскрипции гена рЗОО) ведет к блокированию у-интерферонового сигнального пути в результате инактивации STAT1 гетеродимера и нарушению образования ICAM-1, a/p-lFN, iNOS, МНС [45].
Персистенция аденовирусного Е1А протеина в эпителии трахеобронхи-ального дерева стимулирует образование TNF-a и активацию ядерных факторов транскрипции NF-кВ И JNK/AP1, с последующим синтезом IL-1, IL-6, TNF-a, IL-8 и ICAM-1 эпителиальными клетками и инфильтрацией легочной паренхимы нейтрофилами, моноцитарно-макрофагальными клетками, Т-лимфоцитами, поддерживающими хронический воспалительный процесс [62, 95, 200, 205]. Также протеин Е1А индуцирует экспрессию эпителиальными клетками бронхов соединительнотканного фактора роста (CTGF) и трансформирующего фактора роста (TGF-P), отвечающих за пролиферацию фибробластов и образование соединительной ткани [130, 119].
Таким образом, наличие протеинов Е1А, ЕЗ/19К и Gpl9K определяет возможность длительной персистенции вируса в эпителии бронхов и латентного течения аденовирусной инфекции, блокирование у-интерферонового сигнального пути, повышение образования IL-1, IL-6, TNF-a, IL-8 и ICAM-1, соединительнотканного фактора роста и трансформирующего фактора роста. РИНОВИРУС
Мембрансвязанные межклеточные молекулы адгезии (mICAM-1) экспрес-сироваиные на поверхности эпителиальных клеток респираторного тракта являются рецепторами более чем для 100 серотипов риновируса [157, 211].
Риновирус за счет подавления действия протеолитических ферментов препятствует распаду mICAM-1 на sICAM-1 (растворимые межклеточные молекулы адгезии), что способствует пенетрации вируса в эпителиальные клетки, взаимодействию mICAM-1 с LFA-1 (лейкоцитарным функционально-ассоциированным антигеном), экспрессированным практически на всех клетках иммунной системы и трансэндотелиальному движению иммунокомпетентных клеток в очаг воспаления [113].
Риновирус инициирует синтез эпителиальными клетками респираторного тракта ядерных факторов транскрипции NF-кВ И JNK/AP1 с образованием таких хемокинов и цитокинов как IL-1, IL-6, IL-8, IL-11, TNF-a, GM-CSF, ICAM-1, RANTES, в свою очередь, также повышающих экспрессию mICAM-1, что благоприятствует распространению и персистенции риновируса в эпителии трахеобронхиального дерева с инфильтрацией тканей эозинофилами, нейтро-филами, мононуклеарами и развитием бронхиальной обструкции [122, 139, 188, 189, 194, 237]. Увеличение образования IL-4, IL-5, IL-10 и IL-13 на фоне низкой концентрации y-IFN, при риновирусной инфекции, поддерживает экспрессию на эпителиальных клетках респираторного тракта mICAM-1 и персистирование вируса [214]. Высокий уровень образования сосудисто-эндотелиального фактора роста (VEGF), фибробластного фактора роста - 2 (FGF-2), соединительнотканного фактора роста (CTGF) и TGF-J3 влияющих на пролиферацию фибробла-стов, ангиогенез, образование фибронектина, коллагена I, II, V типа, на фоне риновирусной инфекции, предрасполагает к ремоделированию бронхов [225].
Таким образом, риновирус инициирует синтез IL-1, IL-6, IL-8, IL-11, TNF-a, GM-CSF, ICAM-1, RANTES, нарушает образование y-IFN, что ведет к повышению продукции IL-4, IL-5, IL-10 и IL-13, сосудисто-эндотелиального фактора роста, фибробластного фактора роста - 2, соединительнотканного фактора роста и трансформирующего фактора роста.
Представленные выше данные указывают на то, что респираторные вирусы обладают не только прямым цитопатическим действием на эпителий респираторного тракта, но и инициируют синтез хемокинов, цитокинов, факторов роста, определяющих тип иммунного ответа, формирование бронхиальной и альвеолярной ткани, а также возможное развитие ремоделирования трахеоб-ронхиального дерева, т.е. изменения размера, массы или количества структурных компонентов ткани, происходящего, как в процессе нормального роста, так и при длительном воздействии различных факторов вызывающих воспалительные изменения, ассоциирующиеся с аномально измененной структурой ткани или функцией [58, 81, 124, 201].
Респира торные вир усы и ремоделріроваріие трахеобронхиального дерева
Полное, в рамках работы, клиническое и лабораторное обследование проведено у 119 детей, наблюдавшихся с острым бронхиолитом и острым обструк-тивным бронхитом в отделении острых респираторных вирусных инфекций инфекционного стационара МУЗ ГДКБ № 3 г. Омска в период с 2005 по 2009 гг.: 70 мальчиков (58,8%) и 49 девочек (41,2%). Средний возраст детей составил 17,7 (15,74; 19,75) месяцев. Дизайн исследования представлен на рис. 3.
Критерии включения больных в исследование: добровольное информированное согласие родителей на проведение исследования; наличие острого брон-хиолита или острого обструктивного бронхита, вызванных респираторно-синцитиальным вирусом, аденовирусом или их сочетанием; возраст от 1 мес. до 3-х лет включительно; обращение за медицинской помощью в первые 3 суток от начала заболевания; отсутствие у больных хронической патологии и врожденных пороков развития трахеобронхиалыюго дерева; завершенные случаи заболевания - в результате лечения было зарегистрировано выздоровление.
Критерии исключения больных из исследования: возраст детей старше 3 лет; обращение за медицинской помощью позднее 3 дня от начала заболевания; осложнения, обусловленные наслоением бактериальной флоры; наличие хронической патологии и врожденных пороков развития трахеобронхиального дерева; регулярное применение гормональных лекарственных препаратов, а также применение до поступления в стационар иммунокоррегирующих средств.
На каждого ребенка составлялась информационная карта с оценкой 103 показателей, в том числе: жалоб при поступлении в стационар, анамнеза заболевания, анамнеза жизни, данных клинического осмотра, лабораторных, инструментальных и иммунологических методов исследования, проведенной терапии, продолжительности ведущих клинических симптомов заболевания, данных катамнестического наблюдения.
Участие вспомогательной мускулатуры нет Ретракция яремной ямки Ретракция межреберных промежутков Ретракция межреберных промежутков, эпи-гастрия
При сумме баллов 2 — состояние расценивалось как удовлетворительное; 2-4 балла — легкая степень тяжести; 5-8 баллов —средней тяжести; 9-12 баллов — тяжелое.
Диагностика острого бронхиолита или обструктивного бронхита проводилась на основании клинического осмотра ребенка, степень тяжести оценивалась в соответствии с модифицированной бальной шкалой Е. Kerem et aL (1991), представленной в таблице 2, включающей следующие критерии: наличие или отсутствие цианоза, частота дыхания, характер одышки (смешан 32 ная или преимущественно экспираторная), участие в акте дыхания вспомогательной мускулатуры (ретракция яремной ямки, межреберных промежутков, эпигастрия) [68].
Группу сравнения (контроль) составили 55 человек (с острым бронхиоли-том - 17 человек; с острым обструктивным бронхитом - 38 человека) получающие стандартную терапию, включающую: бронходилятирующие препараты, ингаляции с будесонидом, муколитические препараты, Н1-гистаминоблокаторы, антибактериальные препараты по показаниям.
Исследуемую группу (Ридостин) составили 64 человека (с острым брон-хиолитом - 21 человек; с острым обструктивным бронхитом — 43 человек) получающие, наряду со стандартной терапией, индуктор интерферона Ридостин (ЗАО «Вектор-Медика»). Ридостин вводили внутримышечно в дозе 8 мг в день поступления пациента в отделение и через 48 часов. Побочных реакций на введение препарата не наблюдалось.
Эффективность результатов лечения в группе сравнения и исследуемой группе оценивалась по изменению следующих показателей: динамики клинических проявлений (длительность интоксикации, лихорадки, малопродуктивного кашля, одышки, аускультативных изменений, госпитализации), цитокинового профиля в первые сутки поступления ребенка в стационар до начала проведения терапии и на пятые сутки после введения ридостина, а также катамнестиче-ского наблюдения в течении 2006-2009 гг.
Исследования проводились в иммунологическом отделе (зав. отделом — д.м.н. Т.Ф. Соколова) на базе центральной научно-исследовательской лаборатории ОмГМА (зав. - проф., д.м.н. Т.И. Долгих). Для одновременной регистрации в сыворотке крови, IgM и IgG к основным этиологическим агентам инфекционных заболеваний респираторного тракта (Legionella pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae, Coxiella Burnetti, Adenovirus, Respiratory syncytial virus, Influenza virus А и В, Parainfluenza virus) использовались коммер 33 ческие тест-наборы реактивов для непрямого иммунофлюоресцентного исследования
Определение уровня цитокинов (IL-4, IL-12, спонтанный и стимулированный фитогемагглютинином y-IFN), в сыворотке крови, проводили с использованием наборов реагентов РгоСоп IL-4, РгоСоп IL-12, РгоСоп IFgamma ООО «Протеиновый контур» (СПб), методом твердофазного иммунофермент-ного анализа, согласно прилагаемым к тест-системам инструкциям.
Оценку общего IgE, в сыворотке крови, проводили методом иммунофер-ментного анализа с использованием набора реагентов ЗАО «Алкор Био» (СПб). Для сравнительного анализа применялись допустимые показатели уровня общего IgE в сыворотке крови, согластпо инструкции к тест-системе: дети в возрасте до 6 мес. - 12,0 МЕ/мл, 7-12 мес. - 30,0 МЕ/мл, 1-3 года- 45,0 МЕ/мл.
Для статистического анализа был использован метод случайного отбора больных в соответствии с критериями включения и исключения в исследуемую группу, что определяло репрезентативность выборки. Рандомизированное исследование носило ретроспективный характер по типу «случай-контроль».
При статистическом анализе учитывались тип распределения показателей, мощность использованных критериев (не менее 80%), с определением необходимого числа наблюдений. Вычислялись средние значения параметров (М), стандартная ошибка среднего (т), доверительный интервал (95% ДИ).
Оценка уровня иитерлейкинов в сыворотке крови здоровых детей, сопоставимых по возрасту и полу с исследуемыми группами, была выполнена на основе мета-анализа 12 рандомизированных плацебо-контролируемых исследований [67, 60, 73, 133, 162, 153, 167, 208, 213, 212, 150, 76] с помощью программы Comprehensive Meta-analysis 2.2.027.
Иммунологические исследования
Около одной трети детей первых лет жизни переносит острые респираторные заболевания с явлениями бронхообструкции [6, 26]. Бронхиолит, обструктивний бронхит, рецидивирующий обструктивний бронхит - данные нозологические формы объединяет такое понятие, как вирус-индуцированная одышка у детей раннего возраста [206].
В развитии обструкции бронхов наиболее значимо инфицирование респи-раторно-синцитиальным вирусом у детей всех возрастных групп, но особенно в первые 2 года жизни, аденовирусом у детей раннего и дошкольного возраста [3, 4, 30]. Бронхообструктивный синдром, обусловленный действием респираторных вирусов, развивается у 20-53% детей первого года жизни, при этом доминирующим этиологическим агентом является респираторно-синцитиальный вирус, на долю которого приходится около 64% [163, 195, 196]. Аденовирус регистрируется приблизительно в 6 % случаев при бронхообструктивном синдроме, преимущественно у детей раннего возраста [44].
Респираторно-синцитиальный вирус был выделен в исследуемых группах практически с одинаковой частотой, тогда как аденовирус достоверно чаще регистрировался при остром обструктивном бронхите (р=0,002), а сочетание RSV+AdV при остром бронхиолите (р=0,017). Установлено, что у детей второго полугодия жизни, по сравнению с детьми раннего возраста, преобладала ассоциация респираторно-синцитиального вируса и аденовируса при остром бронхиолите (р=0,0001).
Одновременное выявление респираторно-синцитиального вируса и аде 63 новируса при поражении нижних дыхательных путей у детей первого года жизни наблюдается в 19,6% и характеризуется более тяжелым течением бронхиальной обструкции [202, 224].
Сочетание респираторно-синцитиального вируса и аденовируса определило максимальную продолжительность интоксикационного синдрома — 3,3 (2,8; 3,8) дней, симптомов бронхиальной обструкции - 3,9 (3,4; 4,4) дней, продуктивного кашля - 7,2 (6,6; 7,9) дней, по сравнению с респираторно-синцитиальной и аденовирусной моноинфекциями (р=0,0000 и р=0,005; р=0,0000 и р=0,027; р=0,0000 и р=0,029, соответственно).
Аномалия конституции - свойственное детям первых лет жизни наследуемое, врожденное или приобретенное состояние неустойчивого равновесия нейроэндокринной регуляции, обменных процессов и других функций детского организма, которое может привести к необычным, патологическим реакциям на обычные воздействия. Считается, что около 90% хронических заболеваний человека возникают на фоне того или иного предрасположения (диатеза) [15]. Лимфатико-гипопластическая аномалия конституции сопровождается гипокор-тицизмом, неустойчивым водно-солевым обменом, высокой проницаемостью эндотелия, гиперпродукцией слизи в бронхиальном дереве, ранним развитием бронхообструктивного синдрома, снижением клеточного и гуморального иммунитета [7]. Анализ анамнестических, клинических и лабораторных данных, позволил установить предрасположенность детей с лимфатико-гипопластической аномалией конституции к развитию острого бронхиолита на первом году жизни, что подтверждает наличие прямой корреляционной связи между этими данными (г=0,515, р=0,0000).
Атопическая аномалия конституции характеризуется наследственной или врожденной особенностью иммунного ответа к активации Th2 звена иммунной системы и гиперпродукцией IgE [15]. Атопические заболевания характеризуют такие факторы как, наследственная предрасположенность, повышение в сыворотке крови уровня общего IgE и антиген-специфических IgE, четкая временная зависимость развития клинических симптомов от контакта с аллергеном [23]. По данным О.В. Зайцевой (2007), острая респираторная вирусная инфекция, перенесенная в раннем детском возрасте, может являться отправной точкой в развитии атопии, прежде всего у генетически предрасположенных лиц [13]. Концепция о возможном влиянии респираторио-синцитиального вируса на уровень IgE была предложена еще в 80-х годах, тогда же был обнаружен вирус-специфический IgE после перенесенного острого бронхиолита [215, 233]. По данным R.H. Bui et al. (1987), у пациентов с острым бронхиолитом респиратор-но-синцитиальной этиологии и при обострении бронхиальной астмы вызванном RSV, определялась высокая концентрация гистамина, образовавшегося при взаимодействии вирус-специфических IgE с тучными клетками, в отличии от пациентов с инфекцией верхних дыхательных путей и пневмонией респиратор-но-синцитиальной этиологии [229]. U. Schauer et al. (2002) установили повышение общего IgE у 33% детей перенесших острый бронхиолит вызванный RSV на первом году жизни [198].
По нашим данным, у детей с обструктивным бронхитом, имеющим рецидивирующий характер, концентрация общего IgE в сыворотке была достоверно выше - 89,1+9,12 МЕ/мл, по сравнению с впервые зарегистрированным эпизодом бронхиальной обструкции - 29,2±3,06 МЕ/мл (р=0,0000). Установлена прямая корреляционная связь между перенесенным острым бронхиолитом на первом году жизни в анамнезе и концентрацией общего IgE (r=0,521, р=0,0000), а также рецидивированием бронхообструктивного синдрома (г=0,507, р=0,0000).
Респираторные вирусы тропные к эпителию бронхиального дерева (рес-пираторно-синцитиальный вирус, аденовирус, риновирус) и способные к длительной персистенции в нем, инициируют синтез хемокинов, цитокинов и вторичных липидных медиаторов, которые оказывают влияние на ремоделирование трахеобронхиального дерева, особенно у детей первого года жизни и раннего возраста [59, 169].
Цитокиновый профиль при респираторно-синцитиальной и аденовирусной инфекциях
Корреляционный анализ, между показателями цитокинового профиля через 12 мес. после проведенной терапии и развитием бронхообструктивного синдрома в катамнезе, выявил девиацию иммунного ответа в пользу цитокинов синтезируемых Th2 лимфоцитами, при рецидивирующем течении бронхообструктивного синдрома, что подтверждает нарастание концентраций IL-4 и общего IgE, снижение образования IL-12, спонтанного и стимулированного y-IFN (г- 0,738, р=0,0000; г= 0,751, р=0,0000; г= -0,612, р=0,0000; г= -0,502, р=0,0000; г=-0,716, р=0,0000, соответственно).
Выявленный дисбаланс синтеза цитокинов Thl/Th2 лимфоцитами, при бронхообструктивных проявлениях респираторно-синцитиальной и аденовирусной инфекций у детей раннего возраста, склонность к рецидивирующему течению бронхообструктивного синдрома, а значит формированию риска развития бронхиальной астмы, определил возможность медикаментозной коррекции девиации иммунного ответа индукторами интерферона.
Индукторы эндогенного интерферона - группа высоко- и низкомолекулярных соединений, способствующих вызвать образование интерферона в организме человека и оказывать противовирусное и иммуномодулирующее действие [9, 12]. Применение индукторов эндогенного интерферона имеет ряд преимуществ перед рекомбинантными интерферонами: индукторы интерферона не обладают антигенностью; стимулированный (но естественный) синтез эндогенного интерферона является сбалансированным и не вызывает гиперинтерферо-немии, которая нередко возникает при введении рекомбинантных интерферо-нов; рекомбинантные интерфероны вызывают экспрессию молекул гистосовме-стимости (МНС) в тех популяциях клеток, которые обычно их не экспрессиру-ют, что может быть причиной аутоиммунного ответа; однократное введение ин 69 дукторов эндогенного интерферона обеспечивает длительную циркуляцию эндогенного интерферона на терапевтическом уровне; рекомбинантные интерфе-роны являются препаратами а-2Ь -интерферона, тогда как индукторы эндогенного интерферона вызывают образование а/р- и у-интерферонов, что расширяет спектр противовирусного и иммуномодулирующего эффектов [19].
Включение в базисную терапию бронхообструктивного синдрома, при респираторно-синцитиальной и аденовирусной инфекциях, индуктора эндогенного интерферона Ридостина позволило уменьшить продолжительность интоксикационного и бронхообструктивного синдромов, что в свою очередь привело к сокращению длительности госпитализации с 7,6 (6,9; 8,3) дней до 6,0 (5,6; 6,4) дней при остром бронхиолите и с 7,5 (7,0; 8,1) дней до 5,0(4,8; 5,2) дней при обструктивном бронхите (р=0,0006 и р=0,0000).
Также назначение индуктора интерферона Ридостина привело к уменьшению пребывания детей с острым бронхиолитом в отделении реанимации и интенсивной терапии с 1,6 (1,1; 2,2) дней до 0,8 (0,5; 1,1) дней.
Ридостин являет природным полимером, в среднетерапевтических дозах нетоксичен и не вызывает аллергических реакций, пик концентрации препарата в крови регистрируется через 30 минут после введения, относится к ранним индукторам эндогенного интерферона преимущественно в легких и селезенке, через 2-8 часов после введения [19].
Особенностью биологического действия ридостина является его способность усиливать синтез не только a/(3-IFN, но и в большей степени y-IFN, что определяет не только противовирусный, но и иммунокоррегирующий эффект препарата, тогда как другие индукторы интерферона в терапевтических дозах, индуцируют преимущественно образование a/p-IFN, не обладающего иммуно-модулирующей активностью [2, 8, 16, 41].
При остром бронхиолите и обструктивном бронхите на фоне терапии Ри-достином изменения цитокинового профиля характеризовались достоверным нарастанием уровня IL-12, спонтанного и стимулированного y-IFN и снижением синтеза IL-4 на пятые сутки от начала терапии.
В ходе изучения эффективности назначения индуктора интерферона Ри-достина, при бронхиальной обструкции вызванной респираторно-синцитиальным вирусом и аденовирусом, было установлено, что в половине случаев (51,7%) ранняя коррекция иммунологических изменений вызванных респираторными вирусами позволяет предотвратить развитие бронхообструк-тивного синдрома в катамнезе. В исследуемой группе было зарегистрировано повышение уровня 1L-12, спонтанного y-IFN, стимулированного y-IFN и снижение синтеза IL-4, тогда как в группе сравнения сохранялся дисбаланс цитокино-вого профиля проявляющийся высокой концентрацией IL-4 и нарушением образования IL-12, спонтанного y-IFN, стимулированного y-IFN. Также была отмечена тенденция к повышению синтеза общего IgE в группе сравнения -74,2±7,45 МЕ/мл, тогда как в исследуемой группе уровень общего IgE достоверно не превышал показатели здоровых детей раннего возраста и составил -23,7+4,27 МЕ/мл (р=0,0000).
Использованные в работе подходы к фармакологической коррекции дисбаланса цитокинового профиля при респираторно-синцитиальной и аденовирусной инфекциях, сопровождающихся бронхиальной обструкцией у детей раннего возраста, проведенное катамнестическое наблюдение, позволяют заключить, что ранняя коррекция иммунологических изменений сможет предотвратить развитие гиперреактивности трахеобронхиального дерева, а значит снизить частоту повторных бронхообструктивных состояний в более старшем возрасте и вероятно формирование бронхиальной астмы, у части детей, имеющих предрасположенность к атопии.
