Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Современный взгляд на метаболизм железа в организме 10
1.2. Наследственный гемохроматоз
1.2.1. Определение и генетическое представление о заболевании 17
1.2.2. Патогенетические и клинические аспекты наследственного гемохроматоза 22
1.2.3. Биохимические признаки перегрузки железом и дополнительные методы обследования при наследственном гемохроматозе 28
1.2.4. Ведение больных наследственным гемохроматозом 31
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования. характеристика исследуемых групп 34
2.1. Характеристика параклинических исследований 36
2.2. Дизайн исследования 39
2.4. Статистическая обработка результатов 41
2.3. Характеристика социально-анамнестических данных исследуемых групп 41
ГЛАВА 3. Распространённость мутации C282Y гена наследственного гемохроматоза у детей кемеровской области и клиническая характеристика исследуемых групп 50
3.1. Распространённость мутации C282Y гена наследственного гемохроматоза у детей Кузбасса и сравнительный анализ с другими популяциями 50
3.2. Клиническая характеристика исследуемых групп 56
ГЛАВА 4. Обмен железа у детей гетерозиготных носителей мутации C282Y гена наследственного гнмохроматоза 61
4.1. Сравнительная характеристика показателей эритроцитов в анализе крови и обмена железа у детей изучаемых групп 61
4.2. Особенности метаболизма железа у детей с высокими показателями общего гемоглобина 74
Заключение 84
Выводы 101
Практические рекомендации 102
Список литературы 103
- Патогенетические и клинические аспекты наследственного гемохроматоза
- Характеристика параклинических исследований
- Распространённость мутации C282Y гена наследственного гемохроматоза у детей Кузбасса и сравнительный анализ с другими популяциями
- Сравнительная характеристика показателей эритроцитов в анализе крови и обмена железа у детей изучаемых групп
Введение к работе
Железо относится к числу незаменимых микроэлементов, крайне важных для функционирования практически любых биологических систем [12, 17, 28, 33, 56, 114, 116]. В связи с этим, в процессе эволюционного развития в организме человека были созданы механизмы, направленные на удержание микроэлемента. Регуляция гомеостаза железа является высоко организованным процессом, и направлена с одной стороны на предотвращение развития дефицита микроэлемента, а с другой стороны — на невозможность токсического действия свободного железа на клетки организма [28, 144]. Данный процесс осуществляется благодаря большому количеству белков, обеспечивающих всасывание, транспорт и депонирование железа.
Нарушения обмена железа являются распространенными заболеваниями у детей. Чаще всего встречается железодефицитная анемия. Согласно данным ВОЗ у 20 - 43% детей во всём мире определяется дефицит железа [11, 31, 56]. Следует отметить, что при одинаковых условиях (течение беременности, вскармливание) проявление тяжести анемии разное, что указывает на возможные генетически обусловленные механизмы нарушения обмена железа. Это связано с особенностями абсорбции микроэлемента в кишечнике, в результате нарушения синтеза белков-регуляторов всасывания.
Наряду с этим, в популяции встречаются субъекты с избыточным накоплением железа - страдающие наследственным гемохроматозом (НГХ). В данной ситуации, имеет место, аномалия регуляции захвата микроэлемента клетками желудочно-кишечного тракта из-за отсутствия или слабой экспрессии ограничителя всасывания - трансмембранного белка, в литературе называемого белком наследственного гемохроматоза - HFE [25, 26, 37, 40, 46, 53, 128]. Нарушение синтеза белка HFE связано с мутациями в гене HFE, которые приводят к изменению его экспрессии или снижению функциональной активности. Исход гемохроматоза, при гомозиготном носительстве аномального гена, чаще неблагоприятный из-за прогрессирующей органной недостаточности, которая начинает появляться не раннее 30 - 40 лет [40, 53, 58].
К этому времени основные методы лечения уже мало эффективны. Поэтому важным моментом является предупреждение развития клинических признаков заболевания ещё в детском возрасте [37, 40].
Гетерозиготными носителями мутации гена HFE (основной мутации -C282Y HFE) являются в среднем по Западной Европе 10 % здоровых людей в популяции, и клиническая симптоматика гемохроматоза у них развивается крайне редко [25, 38, 40, 46]. Тем не менее, немногочисленные исследования, отражающие обмен железа у гетерозиготных носителей аномального гена HFE показывают, что повышенный запас микроэлемента в организме для этой группы также характерен [4, 105, ПО, 135].
В отечественной и зарубежной литературе имеются единичные публикации, посвященные исследованию показателей обмена железа у детей с наличием мутантного гена HFE [37, 141]. Кроме того, для регионов Сибири нет данных о распространённости носительства мутации C282Y гена HFE у детей. Результаты таких исследований представляют практический интерес, так как в детском возрасте ферропрофилактика и ферротерапия достаточно частая ситуация, и вопрос о целесообразности её назначения у детей, носителей мутации гена HFE, остаётся открытым.
Цель исследования
Установить клинико-лабораторные особенности обмена железа и частоту носительства мутации C282Y гена наследственного гемохроматоза у детей Кемеровской области.
Задачи исследования
Установить частоту носительства мутации C282Y гена наследственного гемохроматоза у детей Кемеровской области.
Выявить клинические особенности у детей - носителей мутации C282Y гена наследственного гемохроматоза.
Изучить особенности эритроидного ростка периферической крови и показателей обмена железа у детей - носителей мутации C282Y гена наследственного гемохроматоза.
9 высокая обратная зависимость между уровнем общего гемоглобина и ретикулоцитами и достоверно более высокое содержание сывороточного железа, ферритина сыворотки и коэффициента насыщения трансферрина железом по сравнению с детьми с отсутствием данной мутацией.
2. У детей и подростков с высоким уровнем общего гемоглобина и количества эритроцитов без мутации C282Y гена наследственного гемохроматоза отсутствуют высокие значения сывороточного железа, ферритина сыворотки и у каждого третьего выявлен латентный дефицит железа, а также установлена ассоциативная связь с гиперурикемией.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 123 страницах компьютерного текста, состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. В список литературы включены 62 отечественных и 95 иностранных источников. Работа содержит 20 таблиц и 10 рисунков.
Апробация материалов диссертации
Материалы диссертации доложены на научно-практической конференции посвященной 70-летнему юбилею МУЗ ДКБ №1 г.Кемерово (Кемерово 2007), на Межрегиональной научно-практической конференции «Экспо-Сибирь» -Актуальные вопросы подростковой медицины (Кемерово 2006), на научно-практической конференции молодых ученых «Проблемы медицины и биологии» (Кемерово 2006), на сертификационном цикле (Кемерово 2008), на заседании кафедры госпитальной педиатрии Кем ГМА (Кемерово, 2008), на межкафедральном совете Кем ГМА (Кемерово, 2008).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ (из них 3 статьи — в рецензируемых журналах из списка ВАК), в которых отражены основные положения исследования.
7 4. Выявить клинико-метаболические особенности, ассоциированные с высокими показателями эритроидного ростка у детей и подростков с повышенным уровнем общего гемоглобина.
Научная новизна
Впервые выявлена частота гетерозиготного носительства мутации C282Y гена HFE среди детей и подростков Кемеровской области.
Выявлены дополнительные факторы по формированию группы риска по НГХ у детей (сочетание отягощенной наследственности по ассоциированным с НГХ заболеваниям с определенными стигмами дисэмбриогенеза).
Группа детей - гетерозиготных носителей мутации C282Y гена HFE по показаниям эритроидного ростка и обмена железа являлась гетерогенной, а именно выявлены разнонаправленный уровень общего НЪ (анемия, нормальные показатели, высокие значения), высокая обратная зависимость между уровнем общего НЬ и ретикулоцитами и достоверно более высокое содержание СЖ, ФС иКНТ.
У детей и подростков с высоким уровнем общего НЬ и количества эритроцитов изучены метаболические особенности, включающие обмен железа (отсутствие высоких значений СЖ, ФС и у каждого третьего - низкие показатели ФС), а также установлена ассоциативная связь с гиперурикемией.
Практическая значимость исследования
Обоснована необходимость включения в группу риска по НГХ детей и подростков с наличием сочетания отягощенной наследственности по ассоциированным с НГХ заболеваниям (гепатиты, цирроз и рак печени, артропатии, кардиомиопатии, сахарный диабет) с определенными стигмами дисэмбриогенеза (особенно дисморфизм глаз, ушных раковин и гиперэластоз), с последующим исследованием уровня ФС и выявления мутации C282Y гена HFE.
Учитывая полученные особенности состояния депо железа (достоверно более высокий ФС) у детей - гетерозиготных носителей мутации C282Y гена HFE, при условии наличия в анамнезе традиционных факторов риска развития ЖДА, с целью решения вопроса о целесообразности проведения ферропрофилактики необходимо исследовать у них уровень ФС.
С целью диагностики дефицита железа в клинической практике изолированное определение уровня ТфС не целесообразно, вследствие отсутствия его корреляционной связи с уровнем общего НЬ и ФС.
На основе полученных результатов исследования детей и подростков с высокими параметрами общего НЬ, количества эритроцитов и мочевой кислоты необходимо включать в группу риска по раннему формированию ассоциированных с гиперурикемией заболеваниям (артериальная гипертензия, уратная нефропатия, сердечно-сосудистые осложнения).
Внедрение в практику
Данные о частоте гетерозиготного носительства C282Y гена HFE среди детей Кемеровской области, и выявленные дополнительные факторы по формированию группы риска по НГХ у детей включены в тематические планы лекций, семинаров и практических занятий для студентов 5-6 курсов, интернов, клинических ординаторов ГОУ ВПО КемГМА и сертификационного цикла усовершенствования врачей.
Практические рекомендации по включению детей и подростков с высокими параметрами общего НЬ и количества эритроцитов в сочетании с гиперурикемией в группу риска развития ассоциированных с гиперурикемией заболеваниям используются в практике врачей Кемеровской областной клинической больницы.
Положения, выносимые на защиту
1. Для детей — гетерозиготных носителей мутации C282Y гена наследственного гемохроматоза характерны разнонаправленный уровень общего гемоглобина (анемия, нормальные значения и высокие показатели),
9 высокая обратная зависимость между уровнем общего гемоглобина и ретикулоцитами и достоверно более высокое содержание сывороточного железа, ферритина сыворотки и коэффициента насыщения трансферрина железом по сравнению с детьми с отсутствием данной мутацией.
2. У детей и подростков с высоким уровнем общего гемоглобина и количества эритроцитов без мутации C282Y гена наследственного гемохроматоза отсутствуют высокие значения сывороточного железа, ферритина сыворотки и у каждого третьего выявлен латентный дефицит железа, а также установлена ассоциативная связь с гиперурикемией.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 123 страницах компьютерного текста, состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. В список литературы включены 62 отечественных и 95 иностранных источников. Работа содержит 20 таблиц и 10 рисунков.
Апробация материалов диссертации
Материалы диссертации доложены на научно-практической конференции посвященной 70-летнему юбилею МУЗ ДКБ №1 г.Кемерово (Кемерово 2007), на Межрегиональной научно-практической конференции «Экспо-Сибирь» -Актуальные вопросы подростковой медицины (Кемерово 2006), на научно-практической конференции молодых ученых «Проблемы медицины и биологии» (Кемерово 2006), на сертификационном цикле (Кемерово 2008), на заседании кафедры госпитальной педиатрии Кем ГМА (Кемерово, 2008), на межкафедральном совете Кем ГМА (Кемерово, 2008).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ (из них 3 статьи - в рецензируемых журналах из списка ВАК), в которых отражены основные положения исследования.
Патогенетические и клинические аспекты наследственного гемохроматоза
Замещение нуклеотида гуанин в позиции 845 на аденин (мутация C282Y гена HFE) вызывает замену аминокислоты цистеина в позиции 282 на тирозин в белке HFE. Потерянный цистеин должен образовывать со вторым цистеином дисульфидную связь, посредством которой в свою очередь образовывается белковая петля альфа-3. В мутантном белке петля не образуется, а значит и отсутствует способность HFE к ассоциации с р2-микроглобулином. Последний необходим для транспорта HFE, так же как и для транспорта всех белков главного комплекса гистосовместимости 1 класса [46, 151]. Без этого фактора HFE не может быть доставлен из аппарата Гольджи на клеточную мембрану и быстро разрушается.
Вопрос, каким образом белок HFE может влиять на метаболизм железа, в настоящее время остаётся до конца неясным. По этому поводу существует две точки зрения. Авторы первой гипотезы считают, что белок HFE связывается с ТфР и не даёт ТФ с железом попасть в клетку [128, 151]. В результате, увеличенная фракция связанного с железом Фр выходит из клетки. В отсутствии HFE клетки становятся перегруженными железом. Эта точка зрения объясняет накопление микроэлемента в паренхиматозных органах больных НГХ, и не разрешает проблему, каким образом участвует белок HFE в регуляции интестинального усвоения железа. В связи с этим, сторонники второй гипотезы авторы выводов, указывающих на прямо противоположную функцию белка HFE в энтероцитах. Они утверждают, что белок HFE контролирует поглощение клетками предшественниками энтероцитов в криптах полученного из плазмы связанного с Тф железа [79, 117]. А именно, он ускоряет ТфР-опосредованный транспорт и катализирует высвобождение железа из эндосом. Таким образом, в условиях мутантного белка HFE, создаётся низкая концентрация «лабильного» железа в энтероцитах крипт, что, в свою очередь, ведёт к созреванию энтероцита и экспрессии белков, активно участвующих во всасывании алиментарного железа. В пользу этой гипотезы D. Trinder et al (2002) в эксперименте на мышах с мутантным белком HFE обнаружили увеличение экспрессии ДМТ1 и IRF, несмотря на высокую концентрацию сывороточного железа, которая обычно характерна для железо-дефицитных состояний [117].
Замены H63D и S65C находятся в петле альфа-1 (рис.1). Известно, что мутации H63D и S65C не влияют на связь белка HFE с р2-микроглобулином или на экспрессию его на мембране клетки [46, 128]. Однако, в результате этих мутаций, белок HFE способен менее эффективно регулировать взаимодействие ТфР с ТФ.
Несмотря на неясность механизмов накопления избытка железа в организме, можно определённо говорить о механизмах повреждающего действия микроэлемента. Токсическое действие железа обусловлено образованием свободных радикалов, которые приводят к перекисному окислению липидов клеточных мембран, лизосом, митохондрий. В результате клетки гибнут, а стимулированный железом синтез коллагена способствует развитию соединительной ткани в печени, сердце, эндокринных железах [2, 35, 41, 53, 104]. Склероз - явление необратимое и приводит к органной недостаточности. Появление клинических признаков НГХ зависит от уровня накопления железа в тканях [40, 53, 60]. Предел обычно наступает, когда количество железа в организме превышает норму более чем в 10-20 раз. Это происходит чаще всего после 30-40 лет. У мужчин заболевание проявляется в более молодом возрасте, чем у женщин [33, 60, 103]. Это связано с физиологическими потерями железа у молодых женщин (менструальные кровопотери, беременность, роды, лактация). В литературе описаны случаи диагностирования наследственного гемохроматоза и у детей. М.В. Красильникова и соавт. (1999) обследовали детей из семей больных гемохроматозом [37]. В результате исследований выявлено 14 детей (4 — гомозиготных носителей, 10 — гетерозиготных носителей гена гемохроматоза), в возрасте 7 — 15 лет с клинико-лабораторными признаками перегрузки организма железом. Авторы отметили, что у детей с гетерозиготной формой НГХ клинические симптомы заболевания отсутствовали, в отличие от гомозиготных носителей гена гемохроматоза. Однако при исследовании обмена железа у гетерозигот также были обнаружены существенные отклонения от нормы, но менее выраженные, чем у гомозигот.
Клинические проявления гемохроматоза полиморфны, но в 100% случаев происходят изменения в печени, которая резко увеличивается, при пальпации ее край плотный, а иногда и болезненный [10, 40, 53, 103, 152]. В дальнейшем при прогрессировании отложения железа в гепатоцитах и развитии цирроза появляются портальная гипертензия, телеангиоэктазии, пальмарная эритема, нередко желтушность кожных покровов и слизистых оболочек. Появление печеночной недостаточности говорит о развитии цирроза печени и терминальной стадии гемохроматоза [10, 40, 85, 152]. Биопсия печени выявляет повышение концентрации железа, признаки фиброза и цирроза органа. При исследовании секционного материала отмечались изменения по типу мелкоузлового или анулярного цирроза [30, 58]. Значительное количество гемосидерина выявлялось практически во всех гепатоцитах, в макрофагах соединительнотканных прослоек и эпителии желчных протоков. В 30% случаев у больных с циррозом печени развивается гепатоцеллюлярный рак [58, 108].
У преобладающего большинства больных обнаруживается гиперпигментация кожи - меланодермия [10, 30, 40, 58]. Цвет кожных покровов может быть серовато-коричневым, бурым, серым. Это обусловлено отложением в коже пигмента меланина и гемосидерина в результате усиления активности меланоцитов, увеличения количества секреторных меланоцитов, числа меланосом и их размеров [40, 69]. Максимально меланодермия выражена на открытых участках кожи, в подмышечных, паховых областях и в области промежности. Кожные покровы блестящие, сухие, иногда беспокоит зуд.
Также для гемохроматоза характерно вовлечение в патологический процесс желез внутренней секреции. В первую очередь это сахарный диабет, который развивается в результате фиброза поджелудочной железы [53, 91, 126]. Предвестником сахарного диабета часто бывает нарушение толерантности к глюкозе [58, 91]. Экзокринная функция поджелудочной железы тоже нарушена, и проявляется синдромом мальабсорбции (потеря массы тела, диарея, стеаторея) [126] . Примерно у 50% больных НГХ железо накапливается в передней доле гипофиза с последующим развитием фиброза [85, 152].
Характеристика параклинических исследований
Для достижения поставленной цели и задач на первом этапе исследования методом случайной выборки обследованы 355 детей и подростков Кемеровской области в возрасте от 4 месяцев до 16 лет на носительство мутации C282Y гена HFE. Наряду с этим у каждого ребёнка оценивался развёрнутый анализ периферической крови. Основной акцент был сделан на показатели эритроцитарного ростка, который отражает обмен железа в организме, и наиболее доступен при первичном обследовании детей.
Распределение детей по полу среди всех обследуемых достоверных различий не имело (мальчиков - 51,2%, девочек - 48,8%, р 0,05). Половая и возрастная структура детей представлена в таблице 3. На следующем этапе из 355 детей комплексно обследованы 208 детей, включая всех детей носителей мутации C282Y гена HFE. Возраст обследуемых составил от 4 месяцев до 16 лет, из них 106 мальчиков (51%) и 102 девочек (49%). В процессе исследования эти дети были разделены на три группы: первая (основная) - носители мутантного гена HFE (n = 21), вторая (группа сравнения) - дети без мутации с разным уровнем общего Hb (n = 155) и третья (контрольная) - здоровые дети без мутации C282Y гена HFE (n = 32). Критерии включения детей в группы представлены в таблице 4. Обследование проводилось на базе детского гематологического отделения Кемеровской областной клинической больницы и в амбулаторно-поликлинических условиях за период 2003 — 2007 гг. На каждого ребёнка заполнялась специально разработанная индивидуальная карта, где регистрировались данные анамнеза жизни и заболевания, клиническая симптоматика, инструментальные и лабораторные методы исследования. Физическое развитие мальчиков и девочек оценивали по центильным таблицам оценки физического развития Dr. Michel Sempe et al. (1997), под редакцией проф. Н.П. Шабалова (2003) [18]. Измерение АД проводилось методом Короткова, уровень которого оценивался по перцентильным таблицам с учетом возраста, пола и роста, согласно рекомендациям ВОЗ (1999) по критериям артериальной гипертонии у детей и подростков рекомендаций Всероссийского научного общества кардиологов и ассоциации кардиологов России (2003) [49]. В комплексе обследования детей использовались лабораторные и инструментальные методы исследования, выполненные на базе клинической, биохимической, радиоизотопной лабораторий Кемеровской областной клинической больницы и лаборатории молекулярной иммунохимии и канцерогенеза Института экологии человека СО РАН, г. Кемерово. Основные методы исследования включали: развёрнутый анализ периферической крови, изучение параметров метаболизма железа и пуринового обмена, ПЦР-диагностика мутации C282Y гена HFE. УЗИ органов брюшной полости выполнялось аппаратом "Aloka SSD-630" фирмы "Aloka Co., Ltd". Клинический анализ крови с определением числа эритроцитов, содержания общего НЬ, среднего содержания НЬ в 1 эритроците (СГЭ) и числа ретикулоцитов проводился на гематологическом анализаторе "Coulter" (Германия). Цветовой показатель (ЦП) рассчитывался по формуле ЦП = СГЭ 0,03. Визуально исследовалась морфология эритроцитов (гипохромия, анизоцитоз, пойкилоцитоз, микроцитоз). Согласно рекомендациям ВОЗ (2005), уровень НЬ ниже 110 г/л у детей до 5 лет и ниже 120 г/л у детей старше 5 лет расценивался как анемия. За нормальные значения уровня НЬ принимались следующие цифры в зависимости от возраста: от Змесяцев до 5-6 лет — 111-133 г/л, дети 5-12 лет и девочки-подростки - 121-142 г/л, мальчики-подростки - 133-148 г/л [согласно таблицам А.Ф. Тура, Н.П. Шабалова (1970) и Г.А. Самсыгиной, Т.В. Казюковой (2006)]. Уровень НЬ выше приведённых значений расценивался как высокий. С этой целью обмен железа изучался по определению СЖ, ОЖСС, КНТ, ФС и ТфС. СЖ и ОЖСС определялись колориметрическим методом с помощью стандартных наборов "ЭКОлаб-СЖ" и "ЭКОлаб-ОЖСС" (Россия). Уровень ФС определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием набора реагентов "ИФА-ферритин" на аппарате "Униплан" (Россия), ТфС - иммунохимическим методом на аппарате "Aray-360-System" (Франция). КНТ рассчитывался по формуле: КНТ = СЖ/ОЖСС 100%. За диапазон нормативов были приняты следующие показатели: СЖ —18-25 мкмоль/л, ОЖСС - 45-54 мкмоль/л, КНТ - 30-50%, ФС - 20-300 нг/мл и ТфС - 130-275 мг/дл[11,43]. С этой целью определяли уровень мочевой кислоты в сыворотке крови спектрофотометрическим методом. За диапазон нормативов были приняты разработанные Ю.И. Ровда и соавт. (2002) показатели мочевой кислоты у детей и подростков Кузбасса [47, 52]. 0-7 лет - 300 мкмоль/л - у мальчиков и 270 мкмоль/л — у девочек; 8-11 лет — 305 мкмоль/л — у мальчиков и девочек; 12-16 лет — 330 мкмоль/л - у мальчиков и 320 мкмоль/л — у девочек. При оценке уровня мочевой кислоты крови исключались все возможные причины экзогенно-индуцированной гиперурикемии (приём аскорбиновой кислоты, продуктов богатых пуринами, медикаментов и заболеваний, влияющих на почечную экскрецию мочевой кислоты, наличие гемолиза сыворотки крови и др.).
Диагностику мутации C282Y гена HFE проводили на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Тест - системы для молекулярно-генетического анализа полиморфизма HFE разработаны совместно с Институтом химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН. Выделение ДНК проводили с использованием фенол — хлороформной экстракции из лейкоцитов крови. Полиморфизм HFE связан с точковой заменой C282Y, которую можно детектировать сайт-специфической рестрикцией ферментом Rsal. Предварительным этапом перед проведением полиморфизма длин рестрикционных фрагментов являлась амплификация специфического района 1-го интрона, содержащего данную нуклеотидную замену. Праймеры фланкирующие этот участок гена, выравнены с помощью программы "Blast". Амплифицированные фрагменты ДНК были смешаны с ферментом Rsal с использованием специфического буфера (ООО «Сибэнзим», г. Новосибирск). Продукты рестрикции анализировали в 6% полиакриламидном геле с последующей окраской бромистым этидием и визуализацией фрагментов в проходящем УФ-свете (рисунок 2).
Распространённость мутации C282Y гена наследственного гемохроматоза у детей Кузбасса и сравнительный анализ с другими популяциями
Как уже говорилось выше, из 355 обследуемых детей у 21 ребёнка выявлена мутация C282Y гена HFE, что составило 5,9%. Все дети оказались гетерозиготными носителями данной мутации.
На первом этапе исследования для оценки популяционных характеристик распределения мутации C282Y среди детей Кемеровской области, проведено исследование закона Харди-Вайнберга. Математическое выражение данного правила позволяет количественно оценивать не столько неизменность (стабильность) генетического материала, сколько, напротив, те изменения, которые происходят в популяциях и определить их направление [21].
Для оценки равновесия популяции провели сравнение расчётных (ожидаемых) частот генотипов исследуемых генов, и наблюдаемых, с учетом правила Харди-Вайнберга. В таблице 9 приведены полученные нами данные о распределении наблюдаемых и ожидаемых частот встречаемости мутации C282YreHaHFE. Из таблицы видно, что по мутации C282Y в исследуемой группе детей достоверно значимых отклонений от ожидаемых частот в соответствии с правилом Харди-Вайнберга не выявлено (р 0,05).
Полученные данные послужили основанием для сравнительного анализа частоты мутации C282Y гена HFE у детей в Кемеровской области с другими популяциями европеоидного, монголоидного и африканского происхождения [98].
С 1996 года, когда J. N. Feder и соавт. обнаружили мутацию C282Y гена НГХ, ведётся генетическое тестирование на носительство данной мутации не только у больных гемохроматозом, но и в общей популяции во многих странах Мира. Среди больных НГХ гомозиготное носительство обнаруживается в 80-90% случаев. В связи с этим появляется всё больше работ, посвященных исследованиям на носительство мутации C282Y гена HFE в общих популяциях, что необходимо для ранней диагностики и прогнозирования избыточного накопления железа в организме [46, 62, 65, 72, 105, 135, 139, 145]. Частотное распределение гетерозиготного (wild/C282Y) и гомозиготного (C282Y/C282Y) носительства мутантного гена HFE в разных популяциях Мира, включая собственное исследование, представлено в таблице 10. Как видно из таблицы, распространённость гетерозиготного носительства мутации C282Y гена HFE максимальна в Ирландии (28,4%), что в 4,8 раза выше, чем в Кузбассе. В тоже время, несмотря на такую высокую частоту гетерозиготного носительства, гомозигот по мутации C282Y гена HFE, среди обследуемых в общей популяции Ирландии, не выявлено. Возможно, это связано с относительно небольшим количеством исследуемых пациентов (гг=109). В остальных странах северной и центральной Европы (Франция, Норвегия, Швеция, Дания, Англия, Исландия) носительство wild/C282Y гена HFE составило от 6,5 до 12,7% (в среднем — 9,6+1,1%). По мере продвижения к югу Европы (Германия, Италия, Греция, Испания) носительство данной мутации снижается, составляет в среднем 3,5+0,5%, и достоверно отличается от северной Европы (р 0,01). Что касается белого населения северной Америки, Австралии и Новой Зеландии, то распространённость мутантного гена у них достоверно не отличается от жителей северной Европы, и составляет в среднем 10,2+1,3% (р 0,05). Это обусловлено заселением этих материков выходцами из Великобритании, Ирландии, Франции, Дании и других стран северной Европы. Обращает на себя внимание, что у коренных жителей Африки, Азии и Австралии мутация C282Y гена HFE практически не встречается (0,0-0,9%). На основании результатов этих исследований существует гипотеза, что данная мутация возникла в популяции, проживающей на севере Европы, в связи с этим в литературе её стали называть "кельтской мутацией". В нашем регионе частота мутации C282Y гена HFE не имеет достоверного различия (р 0,05) с такими странами как Швеция (7,7%), Исландия (6,5%), Англия (7,6%), Испания (4,5%) и США (штат Коннектикут, 8,0%). Среди популяций России мы располагаем данными С. П. Щербининой и соавт. (г. Москва, 2005) и С. В. Михайловой и соавт.(г. Новосибирск, 2001) [46, 62]. Частота встречаемости гетерозиготного носительства мутантного гена HFE в г. Москва в 1,9 раза выше и достоверно отличается от исследуемой группы Кузбасса (11,2% против 5,9%, р 0,05). В г. Новосибирск этот показатель оказался в 1,7 раза ниже (3,5% против 5,9%, р 0,05). В 2001 году С. В. Михайлова и соавт. исследовали носительство основных мутаций гена HFE в некоторых этнических группах Западной и Восточной Сибири [46]. У алтайцев, тувинцев, нивхов, чукчей, относящихся к монголоидной расе, и у финно-угров, имеющих промежуточные антропологические признаки между европеоидами и монголоидами, мутация C282Y регистрировалась с достаточно низкой частотой - не более 1%, что почти в 6 раз ниже, чем в Кемеровской области (р 0,01). При проведении кластерного анализа по частоте мутации C282Y гена HFE в разных популяциях, включая наши исследования, мы обнаружили, что Кемеровская область находится в одном кластере с Исландией. Результат кластерного анализа по частоте мутации C282Y гена HFE в разных популяциях Мира представлен на рисунке 6.
Сравнительная характеристика показателей эритроцитов в анализе крови и обмена железа у детей изучаемых групп
В современной литературе имеются немногочисленные источники по оценке результатов показателей красного ростка периферической крови у гомозиготных и гетерозиготных носителей мутантного гена HFE. В некоторых работах показано, что у каждого четвёртого пациента, страдающего НГ, выявляется анемия (в большинстве случаях умеренная), по поводу которой он получает препараты железа, что, в конечном счёте, приводит к усугублению состояния, за счет токсического действия микроэлемента на организм [8, 103].
По данным исследований Е.М. Володичевой и соавт. (2003) среди гетерозиготных носителей гена HFE у 72% пациентов показатели НЬ были в пределах физиологической нормы при явном снижении СГЭ и гематокрита (Ht) у половины пациентов [8]. Высокое содержание НЬ было отмечено только у 11% пациентов. Ретикулоциты находились в пределах физиологической нормы у большинства обследуемых. Авторы, в результате своих исследований, патологически значимых изменений, характерных лишь для данного заболевания не выявили. Но к особенностям периферической крови отнесли отсутствие корреляции между количеством общего НЬ и значением СГЭ.
М.В. Красильникова и соавт. (1999) в результате обследования 10 детей в возрасте 7—15 лет с гетерозиготным носительством НГХ, патологических изменений в показателях периферической крови не обнаружили [37]. На данном этапе целью нашего исследования являлся анализ показателей красного ростка периферической крови у детей - гетерозиготных носителей мутации C282Y гена HFE. Результаты исследования показателей средних величин эритроидного ростка периферической крови у детей исследуемых групп представлены в таблице 12. Средние значения общего НЬ, эритроцитов и Ht у детей носителей мутантного гена HFE не выходили за пределы физиологической нормы. Однако у 19,0% детей 1 группы содержание НЬ было снижено до 88-113 г/л, при этом отмечалось снижение количества эритроцитов до 3,8-4,Ы012/л, СГЭ максимально до 23,1 пг, ЦП - до 0,7-0,8, Ht - до 32-35%, и повышение ретикулоцитов до 15-20%о, что характерно для железодефицитной анемии. Кроме того, у 14,3% детей 1 группы выявлены высокие показатели НЬ (148-178 г/л) и эритроцитов (5,2-5,5 10 /л). В данном случае Ht и СГЭ имели тенденцию к увеличению максимально до 48% и 32,3 пг соответственно, ретикулоциты были в пределах нормы (8-11%о), СОЭ снижалась до 2-4 мм/ч. Данные результаты свидетельствуют о гетерогенности группы детей носителей C282Y гена HFE по эритроидным показателям. Средние значения эритроцитов, Hb, Ht, СГЭ, ЦП, и СОЭ у детей 1 и 2 группы были в пределах физиологической нормы, и не имели межгрупповых достоверных различий (р 0,05). Средние значения ретикулоцитов в исследуемых группах также были в физиологических пределах, но в 1 группе этот показатель оказался достоверно выше (11,9+0,7%о против 8,7+0,3%о второй группы, р 0,001). Применив корреляционный анализ, мы изучили связь концентрации общего НЬ с другими показателями анализа крови. Для определения плотности (силы) корреляционной связи мы ориентировались на распределение значений линейной корреляции Пирсона [22]. Коэффициенты корреляции между уровнем НЬ и другими показателями красного ростка периферической крови в обеих исследуемых группах представлены в таблице 13. У детей 1 группы выявлена высокая прямая связь между уровнем НЬ и эритроцитами, Ht, СГЭ, ЦП, и высокая обратная связь между уровнем НЬ и ретикулоцитами, СОЭ. Такая же корреляционная связь прослеживалась в группе детей с отсутствием мутантного гена HFE. При анемии закономерно количество эритроцитов, Ht, СГЭ и ЦП снижались, показатели ретикулоцитов и СОЭ незначительно повышались, а при высоком НЬ отмечалась обратная ситуация - чем выше уровень НЬ тем больше показатель эритроцитов, Ht, СГЭ, ЦП и меньше значения ретикулоцитов, СОЭ. Обращало внимание то, что в 1 группе между уровнем НЬ и количеством ретикулоцитов отмечалась высокая обратная степень зависимости, в то время как во 2 группе данная связь оказалась средней силы (р 0,01), что может свидетельствовать о меньшей регенераторной способности костного мозга у детей носителей гена HFE. Таким образом, по результатам оценки полученных нами средних значений и корреляционного анализа исследованных параметров клинического анализа крови у детей гетерозиготных носителей мутации C282Y гена HFE изменений характерных только для НГХ не выявлено, и данные дети от группы сравнения не отличались. Следующим этапом нашего исследования явилась оценка состояния показателей обмена железа у детей носителей мутантного гена HFE и сравнительный анализ с детьми 2 группы. С клинико-диагностической точки зрения важно изучение изменений биохимических показателей обмена железа, что позволяет в полном объёме получить более достоверные данные о характере и степени нарушений его метаболизма. Исследования СП. Щербининой и соавт. (2006) показали, что у гетерозиготных носителей гена НГХ также были обнаружены существенные отклонения от нормы в показателях обмена железа, но менее выраженные, чем у гомозигот [4]. Данные изменения оказались сопоставимы с результатами исследований P.J. Gerry и соавт. (1997) и М.В. Красильниковой и соавт. (1999) [37,110]. Средние значения показателей метаболизма железа у детей исследуемых групп представлены в таблице 14. Как видно из табл. 10, среднее значение СЖ у детей первой группы в пределах нормы, и составило 20,8+1,9 мкмоль/л, но внутри группы данный показатель оказался гетерогенным. Так у каждого третьего ребёнка документирована сидеропения - СЖ находилось в пределах 4,2 — 16,4 мкмоль/л. При этом дети с низкой концентрацией СЖ были преимущественно раннего возраста (средний возраст 4,5+1,2 года), когда происходят интенсивные темпы роста, и часто имеет место алиментарный дефицит железа. У 19% детей (4 чел.) гетерозиготных носителей гена HFE, напротив, выявлены высокие показатели СЖ (28,1 — 43,7 мкмоль/л). И средний возраст данных детей составил 11,5+2,7 лет (т.е. до наступления развёрнутого пубертата и связанного с ним максимального линейного вытяжения). Это ещё раз доказывает, что потребности организма в железе у детей, в первую очередь, зависят от темпов линейного роста и физического развития. Во второй группе среднее значение СЖ оказалось ниже нормы, и с достоверной разницей по сравнению с первой группой (16,4+0,7 против 20,8+1,9 мкмоль/л соответственно, р 0,05). ОЖСС как в первой так и во второй группах оказалась повышена, и не имела достоверного различия (63,1+1,6 мкмоль/л и 63,8+1,1 мкмоль/л соответственно, р 0,05).
