Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
Глава 2. Материалы и методы 33
2.1. Материал исследования 33
2.2. Методы исследования 34
2.2.1. Клоногенное культивирование стромальных фибробластов 34
2.2.2. Культивирование кроветворных клеток 37
Глава 3. Исследование дифференцировочного потенциала мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в норме 40
3.1. Стандартизация условий клоногенного культивирования стромальных фибробластов 41
3.2. Индукция дифференцировки стромальных предшественников фибробластов 44
3.3. Оценка дифференцировочных потенций клоногенных фибробластов (МСК) в нормальном костном мозге 49
Глава 4. Исследование дифференцировочного потенциала мезенхимальных стволовых клеток при лейкозах 52
4.1. Оценка дифференцировочных потенций клоногенных фибробластов (МСК) в костном мозге при ОМЛ 53
4.2. Оценка дифференцировочных потенций клоногенных фибробластов (МСК) в костном мозге при ОЛЛ 56
4.3. Сравнительная оценка дифференцировочных потенций клоногенных фибробластов (МСК) в костном мозге при ОМЛ и ОЛЛ с нормой 59
4.4. Связь показателей клонирования стромальных фибробластов с длительностью медикаментозной аплазии костного мозга при программной полихимиотерапии первичных лейкозов 65
Глава 5. Связь стромального микроокружения костного мозга с кроветворением 69
5.1. Модель влияния МСК костного мозга на рост гранулоцитарно-макрофагальных предшественников 70
Глава 6. Обсуждение полученных данных 77
Выводы 92
Практические рекомендации 94
Список литературы
- Стандартизация условий клоногенного культивирования стромальных фибробластов
- Оценка дифференцировочных потенций клоногенных фибробластов (МСК) в костном мозге при ОМЛ
- Оценка дифференцировочных потенций клоногенных фибробластов (МСК) в костном мозге при ОЛЛ
- Модель влияния МСК костного мозга на рост гранулоцитарно-макрофагальных предшественников
Введение к работе
Существование в костном мозге, наряду со стволовыми кроветворными клетками, стволовых клеток стромы, образующих в культуре колонии фибробластоподобных клеток, было впервые доказано А.Я.Фриденштейном с соавт. [7,16,18,20,22,23]. Эти клетки получили название колониеобразующих предшественников фибробластов (КОЕ-ф). Стволовая природа этих клеток (способность к самообновлению и дифференцировке в различные мезенхимальные элементы) была подтверждена в многочисленных исследованиях [7,16,18,20,22,44,95,96,104,105,108]. Учитывая способность этих клеток трансформироваться в мезенхимальные элементы различных линий дифференцировки (остеоидные, хондрогенные, адипогенные, иериваскулярные, мышечные и др. клетки-предшественники), они позднее получили название костно-мозговых стромальных стволовых клеток (КМСК) [18,20,22], мезенхимальных стволовых клеток (МСК) [40,95,96] и мезенхимальных клеток предшественников (МІЖ) [39]. В последние годы в литературе чаще всего используется термин МСК. Независимо от используемой терминологии, во всех исследованиях имеются в виду прилипающие костно-мозговые клетки, при культивировании ex vivo образующие колонии веретенообразно-вытянутых клеток, по морфологии напоминающих фибробласты. Это дает основание при характеристике клонального роста МСК использовать термин КОЕф.
Способность КОЕф трансформироваться в остеогенные и хондрогенные
предшественники впервые была показана АЛ.Фриденштейном с соавт.
Ґ Ъ
[11,13,17,21], продемонстрировавшими в части первичных фибробластных колоний, выращенных из костного мозга мыши, наличие фрагментов кости или хряща. Дальнейшие исследования дифференцировочиых потенций МСК позволили Muraglia с соавт. [100] сформулировать «детерминисткую» модель дифференцировки МСК. По этой модели, популяция КОЕф костного мозга человека гетерогенна: около 30% клонов КОЕф являются недифференцированными, дальнейшая их дифференцировка происходит в 2-х направлениях: адипогенном и остео-хондрогенном. Эти данные получены при экспансии в культуре клонов, выделенных из первичной культуры КОЕф. Неясным остается состав и иерархия первичной культуры КОЕф костного мозга человека, что могло бы служить функциональной характеристикой МСК и быть использовано в качестве референтных показателей для оценки стромального микроокружения костного мозга в клинических целях.
Зависимости кроветворения от стромального микроокружения посвящено много исследований, в основном, экспериментальных [7,10,12,15,27], продемонстрирована преимущественная связь отдельных элементов стромы (жировые клетки и остеобласты) с определенными ростками кроветворения [13,23,39,107]. Однако до сих пор отсутствует метод определения стимулирующих гемопоэз свойств костно-мозговой стромы у конкретного пациента и стандартные критерии их оценки.
Исходя из этого, настоящее исследование, посвященное изучению дифференцировочиых потенций мезенхимальных стволовых клеток (МСК)
костного мозга человека и связи их с кроветворением, представляется
весьма актуальным.
Цель исследования:
Стандартизация методов и разработка критериев клинической оценки дифференцировочных потенций мезенхимальных стволовых клеток (МСК) костного мозга и их связей с кроветворением у пациентов.
Задачи исследования:
Стандартизировать условия индукции дифференцировки МСК в первичных культурах клоногенных фибробластов костного мозга человека.
Разработать критерии оценки дифференцировочных потенций МСК костного мозга в первичных культурах и получить референтные значения этих показателей для условно нормального костного мозга детей.
Проанализировать изменения дифференцировочного потенциала МСК при острых лейкозах у детей.
Создать культуральную модель, позволяющую оценивать индуктивную роль МСК в кроветворении у пациента.
5. Оценить колониестимулирующую активность различных видов МСК при культивировании гранулоцитарно-макрофагальных предшественников в агаровой культуре.
Научная новизна.
В настоящей работе впервые были рассмотрены дифференцировочные потенции МСК костного мозга детей в первичной культуре КОЕф и их влияние на кроветворение. С этой целью была разработана культуральная модель, позволяющая оценить индуктивное влияние МСК и их дифференцированных предшественников на пролиферацию гранулоцитарно-макрофагальных предшественников. Впервые предложены новые критерии количественной оценки дифференцировочных возможностей МСК, разработаны референтные значения этих показателей в норме и исследованы их изменения при острых лейкозах у детей.
Данные, полученные при индукции остеогенной и адипогенной дифференцировки клоногенных стромальных фибробластов условно нормального костного мозга позволяют утверждать, что МСК костного мозга не являются сборной группой клеток, состоящей из стромальных элементов различных линий дифференцировки, а построены по иерархическому принципу, характерному для пула стволовых клеток. Основная часть клеточных элементов МСК в стабильном состоянии (около 60%) представлена ранними недифференцированными предшественниками. Этот пул является источником
предшественников адипогенной и остеогенной дифференцировки при действии индуцирующих факторов. Было установлено также, что индукторы дифференцировки включают генетически детерминированную программу дифференцировки, приводящую к стабильному соотношению адипогенных и остеогенных предшественников, независимо от вида индукции. В результате действия индукторов дифференцировки изменяется состав популяции МСК, почти полностью исчезают ранние недифференцированные предшественники, однако, изменения пролиферативного потенциала МСК не происходит.
Научное значение имеют и выявленные впервые особенности качественного состава МСК при острых лейкозах у детей. Так, установлено, что строма костного мозга при ОМЛ у детей до лечения не несет признаков выраженного повреждения, существенно не отличаясь от МСК условно нормального костного мозга, как в количественном, так и в качественном отношениях. При ОЛЛ, напротив, отмечается значительное снижение общего количества клоногенных фибробластов, снижение их способности к дифференцировке с преимущественным подавлением адипогенной трансформации.
В разработанной нами культуральной модели взаимосвязи МСК и
кроветворения показано, что МСК обладает колониестимулирующим
воздействием на пролиферацию гранулоцитарно-макрофагальных
предшественников, близким к таковому стандартного лейкоцитарного фидера. В
данной модели это свойство не зависит от дифференцировочного потенциала МСК.
Практическое значение
Практическое значение работы заключается в разработке стандартных методов и способов оценки дифференцировочного потенциала МСК костного мозга. Разработанные нами индексы трансформации и референтные значения этих показателей дают возможность количественно оценить дифференцировочные потенции стромы костного мозга у больного и использовать эти тесты в клинических целях.
Разработанная в диссертации культуральная модель взаимосвязи МСК и кроветворения может быть полезна в дальнейшем для изучения механизмов поражения гемопоэза при заболеваниях крови и решения клинических задач.
Работа выполнена в лаборатории регуляции кроветворения (зав.-д.б.н. Осипова Е.Ю.) отдела молекулярной гематологии (руководитель-к.м.н. Румянцев С.А.) Федерального научно-клинического центра гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава (директор-член корр. РАМН, д.м.н., профессор Румянцев А.Г.) на базе клинических отделений общей гематологии (зав.- Масчан М.А.), онкогематологии и полиохимиотерапии (зав.-к.м.н. Литвинов Д.В.), онкогематологии (зав.-д.м.н. Мякова Н.В.) Российской детской клинической больницы Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ (гл.врач-д.м.н., профессор Ваганов Н.Н.); отделения гематологии (зав.-к.м.н. Кондратчик К.Л.) Морозовской детской клинической больницы (гл.врач-академик РАЕН, профессор Корнюшин М.А.); отделения гематологии (зав.-к.м.н. Сосков Г.И.) Измайловской детской городской клинической больницы (гл. врач-Жарков А.П.).
Стандартизация условий клоногенного культивирования стромальных фибробластов
На первом этапе исследований мы стандартизировали условия культивирования стромальных предшественников костного мозга детей.
Сравнили эффективность клонирования и ПП КОЕф при различной плотности эксплантации клеток лейковзвеси, либо фракции мононуклеарных клеток (МНК), выделенных на фиколе. Данные представлены в таблице 2. Из таблицы видно, что при одинаковой плотности эксплантации ЭК КОЕф из МНК фракции костного мозга значительно выше, чем при использовании клеток лейковзвеси в той же концентрации.
Так, при эксплантации с плотностью 1 х 104/мл ЭК составило 21,5+3,1 и 4,8+0,8 соответственно. При увеличении плотности эксплантации до 2х104/мл ЭК составило 39,4+6,6 и 6,3+1,0 соответственно. Дальнейшее увеличение плотности эксплантации до 5х104/мл привело к тому, что в большинстве случаев наблюдался сливной рост колоний стромальных фибробластов из МНК фракции костного мозга, что затрудняло количественную оценку результатов. Поэтому во всех дальнейших экспериментах мы использовали плотность эксплантации 2 х 104/мл клеток МНК фракции.
Для оценки эффективности различных видов сывороток для поддержания роста стромальных фибробластов мы использовали: ЭТС, выбранную из 5 серий по наилучшей способности поддержания роста стромальных предшественников, и сыворотку человека АВ (IV) группы крови. Результаты представлены в таблице 3. Таблица 3. Оценка эффективности различных сывороток для поддержания роста стромальных фибробластов in vitro.
Из таблицы видно, что вне зависимости от вида используемой сыворотки более высокая ЭК наблюдалась при концентрации ее 20%, по сравнению с концентрацией 10%. При этом использование сыворотки крови человека АВ (IV) группы имело преимущество перед использованием соответствующих концентраций неинактивированной ЭТС. Инактивирование ЭТС в течение 20 минут при 56С на водяной бане приводило к увеличению показателей роста КОЕф и делало их сравнимыми с таковыми при использовании сыворотки человека АВ (IV) группы крови. ПП вне зависимости от вида и типа используемой сыворотки был достоверно выше при применении 20% сыворотки при сравнении с 10% концентрацией во всех вариантах эксперимента.
На основании проведенных исследований, для стандартизации условий эксперимента мы в дальнейшем использовали инактивированную ЭТС одной серии в концентрации 20%, считая ее колониестимулирующие свойства адекватными таковым сыворотки крови человека.
Для оценки влияния индукторов дифференцировки на количественный и качественный состав колоний стромальных предшественников была поставлена серия экспериментов с добавлением в культуральную среду индукторов адипогенной дифференцировки — дексаметазона и инсулина и индукторов остеогенной дифференцировки - дексаметазона, аскорбиновой кислоты и р глицерофосфата. В контрольные культуры добавлялось соответствующее количество полной питательной среды.
В культурах стромальных предшественников КМ человека при культивировании в стандартных условиях и с применением индукторов дифференцировки выявлена гетерогенность популяции. Клетки в колониях отличались между собой по цитохимическим признакам. Выявляемая в клетках колоний активность щелочной фосфатазы свидетельствовала о принадлежности стромальных предшественников к остеогенной линии дифференцировки (рис. 1 (а, б)). Рис. la. Колония стромального фибробласта остеогенной линии дифференцировки. Рис.16. Колония стромалъного фибробласта остеогенной линии дифференцировки
Колонии, содержащие клетки с адипогенными включениями, выявляемые при окраске Суданом черным или красным, относились к адипогенной линии дифференцировки (рис. 2 (а, б)). Рис. 2а. Колония стромалъного фибробласта адипогеннои линии дифференцировки. Рис. 26. Колония стромалъного фибробласта адипогенной линии дифференцировки. Колонии считались остеогенными или адипогенными при наличии в них более 20% клеток соответственно остеогенной или адипогенной природы. Отсутствие в колониях выраженных признаков адипогенной или остеогенной дифференцировки может свидетельствовать о том, что такие колонии образованы более ранними предшественниками, не коммитированными к соответствующей однолинейной дифференцировке.
Для оценки способности популяции клоногенных фибробластов (МСК) к дифференцировке под влиянием специфических индукторов мы ввели следующие показатели: Индекс адипогенной трансформации (ИАТ) - отношение числа адипогенных колоний после индукции адипогенной дифференцировки к числу адипогенных колоний, образованных спонтанно в контрольных культурах без стимуляции дифференцировки. Индекс остеогенной трансформации (ИОТ) - отношение числа остеогенных колоний после индукции остеогенной дифференцировки к числу остеогенных колоний, образованных спонтанно в контрольных культурах без стимуляции дифференцировки. Отношение остеогенных колоний к адипогенным (О/А).
Оценка дифференцировочных потенций клоногенных фибробластов (МСК) в костном мозге при ОМЛ
Результаты исследований дифференцировочных потенций клоногенных фибробластов (МСК) в костном мозге при ОМЛ приведены в табл. 5. При ОМЛ средние величины ЭК КОЕф без стимуляции и с применением адипогенной и остеогенной индукторов дифференцировки у обследованных групп не имели статистически достоверных различий. Так, ЭК на 1 х 105 эксплантированных клеток при ОМЛ без индукции составила 49,8+1,89, с адипогенной и остеогенной индукцией - 42,73+3,05 и 42,73+1,72 соответственно.
Адипогенная индукция статистически достоверно увеличивала показатели ПП стромальных фибробластов по сравнению с остеостимуляцией и без применения индукторов дифференцировки, который составил 0,35+0,019 сравнительно 0,25+0,018 и 0,24+0,018 соответственно (Р 0,05 ). При спонтанном колониеобразовании без применения индукторов дифференцировки число адипогенных колоний преобладает над числом остеогенных колоний (О/А=0,69+0,05), при этом около 50 % колоний не имели признаков дифференцировки.
Добавление в культуру индукторов адипогенной дифференцировки в большей степени увеличивало долю предшественников с адипогенной направленностью дифференцировки и существенно не влияло на долю предшественников с остеогеннои направленностью дифференцировки. Так, ИАТ составило 2,53+0,07; ИОТ-1,76+0,17 соответственно. Достоверно меняется соотношение остеогснных колоний к адипогенным в пользу адипогенных (О/А=0,44±0,02) (р 0,05).
Использование индукторов остеогеннои дифференцировки статистически значимо увеличивало количество дифференцированных остеогенных колоний и практически не повлияло на число адипогенных колоний. ИОТ составило 3,44+0,39; ИАТ -1,11+0,05. Около 10% колоний не имеет признаков дифференцировки. При остеогеннои стимуляции изменяется и соотношение О/А в пользу остеогенных предшественников. О/А составило 1,95+0,11(р 0,05).
Таким образом, при ОМЛ: применение индукторов дифференцировки не влияет на общее число клоногенных фибробластов, при этом адипогенная стимуляция увеличивает долго предшественников с высоким пролиферативным потенциалом. индукция адипогенной дифференцировки вызывает преимущественное увеличение числа адипогенных предшественников, достоверно изменяет соотношение О/А в пользу адипогенных колоний, но при этом достоверно увеличивает и число остеогенных предшественников фибробластов. остеогенная индукция вызывает избирательную трансформацию клоногенных фибробластов в остеогенные предшественники и практически не увеличивает долю предшественников с адипогенной направленностью дифференцировки. Соотношение О/А достоверно меняется в пользу остеогенных колоний. Около 10% колоний не имеют признаков дифференцировки.
Результаты исследований дифференцировочных потенций клоногенных фибробластов (МСК) в костном мозге при ОЛЛ приведены в табл. 6.
Из таблицы видно, что добавление индукторов адипогенной и остеогенной дифференцировки статистически значимо увеличивало общее количество колоний фибробластов. ЭК при адипогенной стимуляции составила 2,49+0,13; при остеогенной стимуляции - 2,39+0,07 по сравнению с 2,02+0,15 без применения индукторов дифференцировки (р 0,05). При этом отмечается достоверное снижение показателей ПП при адипогенной и остеогенной дифференцировках (ПП при адипогенной стимуляции = 0,24+0,01; при остеогенной стимуляции = 0,26+0,009) по сравнению с ПП без индукции дифференцировки (0,3+0,028) (р 0,05). При спонтанном колониеобразовании преобладает число остеогенных колоний над числом адипогенных колоний (О/А=2,32±0,18).
Индукция адипогенной дифференцировки статистически значимо увеличивало долю дифференцированных адипогенных колоний (ИАТ=2,77+0,27), но не повлияло на долю дифференцированных остеогенных колоний стромальных фибробластов (ИОТ=0,96+0,06).
Соответственно меняется соотношение остеогенных и адипогенных колоний в пользу последних и составляет О/А=0,82+0,05. Однако при ОЛЛ примерно 30% колоний, несмотря на использование индукторов адипогенной дифференцировки, остаются недифференцированными.
При индукции остеогенной дифференцировки примерно в одинаковой степени возрастает доля адипогенных и остеогенных колоний (ИАТ=2,22+0,18; ИОТ=2,32+0,13), при этом соотношение остеогенных и адипогенных колоний остается в пользу остеогенных колоний, что имело место в отсутствии индукции дифференцировки (О/А=2,44+0,15 и 2,32+0,18 соответственно).
Оценка дифференцировочных потенций клоногенных фибробластов (МСК) в костном мозге при ОЛЛ
Как следует из полученных данных, эффективность клонирования стромальных фибробластов и их дифференцировочные потенции различны при исследовании нормального костного мозга детей и в группах пациентов с ОМЛ и ОЛЛ. Результаты исследований количественного и качественного состава предшественников стромальных фибробластов без применения индукторов дифференцировки приведены в табл. 7.
При оценке эффективности клонирования стромальных фибробластов в разных нозологических группах без применения специфических индукторов дифференцировки выявлена статистически значимая низкая эффективность клонирования при ОЛЛ (р 0,05), тогда как эффективность клонирования при норме и ОМЛ практически не различаются. ЭК в норме составляет 47,95+6,98; приОМЛ-49,8±1,89. Показатель ПП находится на одном уровне в норме и в патологии (различия статистически не достоверны). При спонтанном колониеобразовании без применения индукторов дифференцировки в исследуемых группах отмечается разница в процентном содержании как адипогенных, так и остеогенных колоний. Так, при ОЛЛ число остеогенных колоний превосходит число адипогенных колоний (О\А=2,32+0,18), тогда как в норме и при ОМЛ преобладают адипогенные колонии, О/А составляет 0,71+0,07 и 0,67+0,05 соответственно. Соотношение О/А достоверно выше при ОЛЛ, чем при ОМЛ и в нормальном костном мозге (р 0,05).
Результаты исследований количественного и качественного состава предшественников стромальных фибробластов при адипогенной индукции приведены в табл. 8.
Из таблицы видно, что при применении индукторов адипогенной стимуляция показатели эффективности клонирования и пролиферативного потенциала в нормальном костном мозге и при ОМЛ существенно не различаются. Так, ЭК составляет 55,86+8,25 и 42,73+3,05 соответственно, ПП равен 0,34+0,06 и 0,35+0,02 соответственно. При ОЛЛ снижено как общее количество предшественников стромальных фибробластов, так и их пролиферативный потенциал. ЭК составила 2,49+0,13; ПП-0,24±0,01, что статистически достоверно ниже, чем в других группах. Таблица 8. Количественный и качественный состав колоний МСК в нормальном костном мозге, при ОМЛ и ОЛЛ при адипогенной индукции. (М+т) ЭК на 1х105МНК ПП %адипогенныхколоний %остеогенныхколоний О/А ИАТ йот 1.НОРМА(п=11) 55,86+8,25 0,34±0,06 66,8+1,89 41,2+1,46 0,63+0,04 2,8+0,19 2,6±0,28 2,ОМЛ(п=15) 42,73+3,05 0,35±0,02 71,3±1,67 30,8+1,19 0,44±0,02 2,5+0,06 1,7+0,16 З.ОЛЛ(п=15) 2,49+0,13 0,24+0,01 36,3±1,39 29,1±0,91 0,82+0,05 2,7±0,27 0,9+0,06 Достоверность различий Рі-з 0,05 р2-з 0,05 Р2-з 0,05 Pi-з 0,05 Р2-з 0,05 Pi-з 0,05 Р2-з 0,05 Pi-2 0,05 Pi-з 0,05 Р2-з 0,05 р 1.2 0,05 Pi-з 0,05 р2-з 0,05 При оценке способности популяции клоногенных фибробластов к дифференцировке под влиянием адипогенных индукторов, мы выявили, что во всех трех сравниваемых группах нет различия в степени выраженности адипогенной стимуляции. ИАТ составило 2,8+0,19 в норме; 2,5+0,06 при ОМЛ и 2,7+0,27 при ОЛЛ. При применении индукторов адипогенной дифференцировки в двух группах (норма и ОМЛ) примерно в одинаковой степени возрастает и доля остеогенных колоний (норма: ИОТ=2,6+0,28;ОМЛ: ИОТ= 1,7+0,16), тогда как при ОЛЛ данная стимуляция не влияет на предшественники с остеогенной направленностью дифференцировки (ИОТ=0,9+0,06). При оценке соотношения О/А во всех трех сравниваемых группах преобладают адипогенные колонии над остеогенными.
Результаты исследований количественного и качественного состава предшественников стромальных фибробластов при остеогенной индукции приведены в табл. 9.
Показатели ЭК при применении индукторов остеогенной стимуляции, как и в предыдущем случае, снижена при ОЛЛ и практически не различаются в норме и при ОМЛ. ЭК при ОЛЛ составило 2,39+0,07; в норме-52,77±9,46; при ОМЛ - 42,73+1,72. Таблица 9. Количественный и качественный состав колоний МСК в нормальном костном мозге, при ОМЛи ОЛЛпри остеогенной индукции. (М±т) ЭК на 1хЮ5МНК ПП %адипогенныхколоний %остеогенныхколоний О/А ИАТ йот 1.НОРМА (п=11) 52,77+9,46 0,32+0,05 39,96+1,73 77,99±2,0 1,98+0,08 1,66+0,11 5,06+0,54 2.0МЛ (п=15) 42,73±1,72 0,25±0,02 31,05±1,27 58,93+1,4 1,95+0,11 1,11+0,05 3,44+0,39 З.ОЛЛ (п=15) 2,39+0,07 0,26+0,01 29,91 ±1,47 70,2+1,6 2,44+0,15 2,22+0,18 2,32+0,13 Достоверность различий Рі-з 0,05 Р2-з 0,0 Pi-2 0,05 Рі-з 0,05 Рі-2 0,05 Рі-з 0,05 р2-з 0,05 Р1.з 0,05 р2-з 0,05 Рі-2 0,05 Рі-з 0,05 р2-з 0,05 Pi-2 0,05 Рі-з 0,05 р2-з 0,05 ПП при остеогенной индукции не имеет статистически значимой разницы во всех трех группах. Остеогенная стимуляция индуцирует остеогенную дифференцировку в норме и при ОМЛ более выражено, чем при ОЛЛ. ИОТ составило 5,06+0,54 в норме; 3,44±0,39 при ОМЛ; 2,32+0,13 при ОЛЛ. Остеогенная стимуляция также увеличивает долю адипогенных колоний в норме и при ОЛЛ, не влияя при этом на долю жировых колоний при ОМЛ. ИАТ составило 1,66+0,11 в норме; 2,22±0,18 при ОЛЛ; 1,11+0,05 при ОМЛ.
Таким образом, можно сказать, что стромальное микроокружение при ОЛЛ страдает в большей степени, чем при ОМЛ не только в количественном (снижение ЭК и ПП клоногенных фибробластов), но и в качественном отношениях. Отмечается значительное уменьшение доли адипогенных предшественников в стабильном состоянии, без стимуляции. Применение индукторов остеогенной и адипогенной дифферепцировки оказывает воздействие на популяцию МСК при ОМЛ в качественном и количественном отношениях близкое к таковому в нормальном костном мозге. МСК при ОЛЛ оказались менее чувствительными к индукции дифференцировки. При этом в большей степени страдает дифференцировка МСК в сторону адипогенных предшественников.
Связь показателей клонирования стромальных фибробластов с длительностью медикаментозной аплазии костного мозга при программной полихимиотерапии первичных лейкозов. Для оценки влияния состава стромального микроокружения на возможность восстановления гемопоэза при медикаментозной аплазии нами были проанализированы результаты индукционной терапии 30 пациентов с различными вариантами первичных лейкозов. Больные с ОЛЛ проходили лечение по протоколу ALL MB 2002. 6 больных с ОМЛ проходили лечение по протоколу ОМЛ 2000; 6 больных по протоколу APL 2003; 3 больных по протоколу BFM 93.
Модель влияния МСК костного мозга на рост гранулоцитарно-макрофагальных предшественников
Для оценки колониестимулирующей активности стромальных фибробластов костного мозга на рост гранулоцитарно - макрофагальных предшественников, агаровые капли с клетками-мишенями помещали в культуральные чашки с жидкой питательной средой, в качестве фидера использовали покрывающий дно монослой предварительно выращенных фибробластов тестируемого костного мозга в трех вариантах: без стимуляции, с адипогенной и остеогенной стимуляцией.
Подслой стромальных фибробластов получали путем культивирования мононуклеарных клеток костного мозга в течение двух недель, как без применения индукторов дифференцировки, так и со стимуляцией направленной адипогенной и остеогенной дифференцировки. Параллельно в каждом исследовании для контроля положительного ответа на индукторы дифференцировки проводили цитохимические реакции на щелочную фосфатазу и Судан, описанные в главе 2. Тестируемые клетки мишени (мононуклеары пуповинной крови, выделенные на градиенте фиколла 1077) в агаровой капле (методика описана в гл.2) помещали в сухую чашку Петри. После застывания капли переносили в чашки с подслоем культивированных фибробластов и добавляли 2,5 мл полной питательной среды. В этих чашках изучали колониестимулирующее действие МСК, выращенных с использованием и без использования различных индукторов дифференцировки. Параллельно на тех же клетках мишенях изучали совместное действие МСК и лейкоцитарного фидера. Каждый вариант опыта ставили в двух идентичных чашках. Инкубацию, снятие культур и учет результатов культивирования проводили по обычной, описанной в гл.2 методике.
Для этих исследований был использован костный мозг 10 детей с условно нормальным гемопоэзом (больных тромбоцитопенической пурпурой) и 10 образцов пуповиной крови. Всего проведено 80 культуральных и 60 цитохимических исследований. Результаты культивирования гранулоцитарно-макрофагальных предшественников оценивали но следующим показателям: Колониеобразующая (КОС) и кластерообразующая (КлОС) способность- число колоний и кластеров на 1x105 эксплантированных клеток. Эффективность клонирования (ЭК)- общее число колоний и кластеров на 1x10 эксплантированных клеток в условиях стандартного колониеобразования, и в условиях применения в качестве колониестимулирующих факторов МСК без использования и с использованием индукторов дифференцировки. Пролиферативный потенциал гранулоцитарно-макрофагальных предшественников пуповиной крови оценивали как отношение колоний к кластерам (КОС/ КлОС) т.е. числа колониеобразующих клеток- предшественников с высоким пролиферативным потенциалом к числу кластерообразующих клеток-предшественников с низким пролиферативным потенциалом; этот показатель дает представление о пролиферативной активности пула предшественников. Таким образом значение КОС /КлОС 1,0 говорит о преобладании предшественников с высоким пролиферативным потенциалом, при значениях КОС/ КлОС 1,0 преобладают предшественники с низким пролиферативным потенциалом. Процентное содержание больших колоний (более 100 клеток). Полученные результаты представлены в таблице 10. Таблица 10. Влияние МСК костного мозга на рост гранулоцитарно макрофагальных колоний пуповиной крови (М + т) п— ЭКхЮ5 Колонии/Кластеры % Бол.колоний Контроль (без МСК) Фо 0 0 2+Фсг 21,6±3,00 0,93±0,24 17,5±3,96 МСК без индукции 3Фо 18,9±2,61 1,43+0,12 24,01±3,01 4+Фст 18,6±2,93 1,09+0,13 23,33±3,11 МСК адипогенная индукция 5Фо 16,6+1,68 1,32+0,11 28,67+3,01 6+Фст 22,6+3,60 1,75+0,13 28,64± 3,48 МСК остеогенная индукция 7Фо 16,1±2,37 0,89+0,19 31,95±4,16 8+Фст 17,8+2,76 1,30+0,06 32,0± 4,54 Достоверность различий Рі-з 0,05 Рі-5 0,05 Рі-7 0,05р2-4 0,05p2-r, 0,05Р2-8 0,05 Рм 0,05 Pi-5 0,05 Р..7 0,05Р2-4 0,05р2-б 0,05Р2-8 0,05 Рі-з 0,05 Рь5 0,05 Р..7 0,05Р2-4 0,05р2-б 0,05 Р2-8 0,05 Как видно из данных, приведенных в таблице, при отсутствии фидерных клеток в культуре (Ф0) роста гранулоцитарно-макрофагальных предшественников в агаровой капле не отмечено.
МСК костного мозга без индукции дифференцировки оказывают стимулирующий эффект на рост гранулоцитарно-макрофагальных колоний, близкий к действию Фет. Так, при культивировании со стандартным фидером эффективность клонирования гранулоцитарно-макрофагальных предшественников пуповиной крови составила 21,6+3,00, при этом предшественники с низким и с высоким пролиферативным потенциалом были представлены в равных пропорциях (КОС/КлОС =0,93+0,24).
При помещении предшественников на подслой стромальных фибробластов, выращенных без индукторов дифференцировки, ЭК гранулоцитарно-макрофагальных предшественников составило 18,9+2,61 (различие статистически недостоверно), при этом отмечалась тенденция к увеличению их пролиферативного потенциала (КОС/КлОС=1,43; процент больших колоний составил 24,01+3,01) по сравнению с культивированием со стандартным фидером.
При использовании в качестве подслоя МСК, выращенных в присутствии адипогенных индукторов дифференцировки (процент колоний, содержащих жир, составил при этом 60,4+1,53) статистически значимых различий в показателях клонирования, по сравнению с использованием МСК без индукторов дифференцировки, не отмечено. Однако при этом обращает внимание четкая тенденция к уменьшению ЭК и увеличению пролиферативного потенциала гранулоцитарно-макрофагальных предшественников.
Использование в качестве подслоя МСК, выращенных в присутствии остеогенных индукторов дифференцировки (процент колоний, содержащих остеоидные клетки составил 69,12+1,95) не вызывает каких-либо существенных отличий от результатов клонирования с использованием адииогеннои дифференцировки МСК. Однако тенденция к увеличению процента больших колоний выражена еще в большей степени.
Внесение в культуры дополнительно к МСК лейкоцитарного фидера в каждом варианте опыта не вызывало каких- либо изменений показателей пролиферации гранулоцитарно-макрофагальных предшественников.
