Введение к работе
1.1. Актуальность проблемы. Широкое распространение и увеличение случаев заболевания вирусным гепатитом В, дифтерией ( в период с 1993 по1995 гг.), бруцеллезом, оппортунистическими инфекциями, а также высокая частота и тяжесть инфекционных осложнений, возникающих на фоне иммунной недостаточности организма, появление антибиотикорези-стентных штаммов микроорганизмов и явно недостаточная эффективность этиотропных противовирусных препаратов, предопределяет необходимость поиска и создания средств патогенетической и иммунокорригирующей терапии инфекционных болезней.
В зависимости от этиологического агента, его вирулентности и дозы возбудителя иммунная недостаточность протекает по транзиторному типу, например, в случае острого инфекционного поражения, или носит характер стойкого иммунодефицитного состояния, с нарушением продукции цито-кинов, дисбалансом субпопуляций Т- и В-лимфоцитов и функциональной недостаточностью мононуклеарных фагоцитов, что обычно наблюдается при хронических вирусных и бактериальных инфекциях ( В.И. Покровский, 1994).
Среди патогенетических факторов инфекционных болезней человека, важное место занимают вновь образующиеся медиаторы или модуляторы воспаления, которые в условиях нормальной жизнедеятельности организма существуют в физиологических концентрациях и ответственны за регуляцию функций на клеточном и тканевом уровне. Некоторые из них, такие как лимфокины, монокины и метаболиты арахидоновой кислоты - эйкоза-ноиды, одновременно, являются медиаторами клеток иммунной системы, а другие, например, активные метаболиты кислорода, обеспечивают функционирование кислородзависимой системы бактерицидности нейтрофилов. При инфекционном воспалении, в условиях гиперпродукции медиаторов, резкое увеличение концентрации цнтокинов, прежде всего монокинов и лимфокинов, вызывает количественные и функциональные изменения им-мунокомпетентных клеток, а усиление продукции активных метаболитов кислорода оказывает на них прямое повреждающее действие (Д.Н. Маян-ский, 1994; Chensue S., 1996; J.W.M. van der Meer, 1996).
Таким образом, посредством вновь образующихся медиаторов, инфекционная воспшіительная реакция всегда вовлекает в типовой патологи-
ческий процесс клетки иммунной системы организма и может являться одной из причин формирования вторичного иммунодефицитного состояния.
Важное патогенетическое значение цитокинов в развитии воспалительной и иммунной реакции организма вызывает особый интерес в плане их использования, как лекарственных препаратов для патогенетической и иммунокорригирующей терапии. Применение цитокинов или медиаторов в качестве фармакологических средств терапии иммунодефицитных состояний предполагает усиление или изменение того или иного звена иммунитета в системе каскадной регуляции иммунной реакции организма. При этом необходимо иметь ввиду, что действие одного цитокина или цитокиноми-метика на клетки-мишени в результате их активации обязательно вызывает продукцию других медиаторов и, соответственно, расширение спектра фармакологических эффектов. Такое расширение спектра действия при введении медиаторов в организм может вызывать серию параллельных или побочных эффектов (И.П. Ашмарин, 1984; Е.И. Чазов, МИ. Титов и др., 1984; Donahue, Rosenberg, 1983).
Другая причина появления побочных эффектов заключается в несоответствии между уровнем распределения медиаторов в органах и тканях при их введении в организм и созданием действующей концентрации цитокинов в зоне межклеточной передачи сигнала. В физиологических условиях медиаторы продуцируются непосредственно в межклеточное пространство, где оказывают влияние по паракринному типу действия. Такой тип передачи сигнала обеспечивает высокие концентрации медиатора среди клеток ближайшего окружения, как это например, происходит в системе межклеточного взаимодействия А-клеток, Т- и В-лимфоцитов. Паракринный тип передачи сигнала обеспечивает определенную избирательность действия цитокинов и имеет существенное значение в регуляции воспалительной и иммунной реакции организма. Напротив, поступая в кровь при парентеральном введении, цитокины утрачивают паракринный тип действия, распределяются по органам и тканям и приобретают не свойственный медиаторам эндокринный характер действия. Поэтому, введение в организм экзогенных цитокинов или цитокиномиметиков может вызывать нарушение специфики их действия с расширением спектра фармакологических и побочных эффектов. Вероятно по этой причине попытки лекарственного применения ряда цитокинов, таких как ИЛ-1, ИЛ-2, фактор некроза опухоли (ФНО) и некоторых других не получили широкого клинического применения (Nagarkatti P.S., Hammond-McGibben D.,1994).
Значительные успехи достигнутые в области разработки лекарственных препаратов для коррекции нарушений иммунной системы организма обусловлены открытием нового класса биологически активных соединений - тимических пептидных гормонов иммунитета (Goldstein A.L., Hooper J., 1970). Естественные гормоны Т-системы иммунитета представлены семейством тимозинов, тимопоэтинов и сывороточным тимическим фактором (тимулином). Данные гормоны продуцируются клетками центрального органа иммунитета - вилочковой железой и обеспечивают гуморальную регуляторную связь центральной и периферической иммунной системы организма (Basch R.S., Goldstein G., 1974; Lewis V.M., Twomey J.J. et al., 1978; Sunshine G.H., Basch R.S. et al., 1978; Goldstein G., Audhya Т.К., 1985).
Регуляторные тимические пептиды или гормоны тимуса, секретиру-ются в кровь и осуществляют дистанционное управление клетками периферической иммунной системы, вызывая стимуляцию их дифференцировки и созревания. Активированные лимфоидные клетки периферической иммунной системы, в свою очередь, продуцируют цитокины, которые инициируют пролиферацию и созревание субпопуляций Т- и В-лимфоцитов (Hadden J.W., 1992). Таким образом, пептидные гормоны тимуса контролируют рост и развитие лимфоидных клеток периферической иммунной системы посредством их прямого действия и влияния на продукцию медиаторов иммунитета.
Активация лимфоидных клеток пептидными гормонами тимуса, как и действие других регуляторных пептидов, осуществляется универсальным способом путем образования в цитоплазме вторичных мессенжеров: цАМФ и ионов кальция, инозилтрифосфата диацилглицерола с последующей генерации сигнала на разнообразные индукторы (Н.П. Мертвецов, 1986; Oates К.К., Goldstein A.L., 1984). Ряд пептидных гормонов тимуса, такие как тимозин-а 1 и тимопоэтин, помимо изменения продукции цАМФ вызывают стимуляцию синтеза вторичных медиаторов - простагландинов группы Е, действие которых, вероятно, реализуется через цГМФ (Garaci Е., Favelli et al., 1984; Faist E., Markewitz A. et al., 1991).
Таким образом, влияние пептидов тимуса на функциональное состояние клеток периферической иммунной системы обусловлено биохимическими механизмами, свойственными пептидным гормонам. Такой универсальный механизм действия лежит в основе двух важных фармакологических эффектов пептидных гормонов иммунитета: эффекта малых доз и эффекта иммуномодулирующего действия.
Эффект малых доз выражается в том, что регуляторные пептиды или пептидные гормоны вызывают адекватное изменение функции клетки-мишени в очень низких концентрациях, порядка 10ш - 10s М (Е.И. Чазов, М.И. Титов и др., 1984; Н.П. Мертвецов, 1984; В.А. Ткачук, 1983). Регуляторные пептиды тимуса и их синтетические аналоги также вызывают фено-типическую трансформацию лимфоидкых клеток в низких дозах близкого порядка (Low T.L.K., Goldstein A.L., І 979; Audhya Т., Scheid M.P. et al., 1984). Активация клетки низкими дозами регуляторных пептидов достигается за счет генерализации сигнала путем образования вторичных мессен-жеров в цитоплазме клетки (В.А. Ткачук, 1983; Berridge M.J., Irvin R.F., 1985). При этом итоговое усиление сигнала может составлять 106 - 107 раз, что позволяет тимическим пептидам, действующим в каскадной системе, работать при низких концентрациях.
Иммуномодулирующее действие пептидов тимуса выражается в адекватном изменении функционального состояния клеток Т-системы иммунитета. На фоне нарушенных функций иммунной системы организма введение полипептидов тимуса характеризуется тенденцией к восстановлению баланса субпопуляций Т-лимфоцитов и их функциональной активности. При этом сниженные показатели увеличиваются, а гиперактивные процессы среди отдельных субпопуляций Т-лимфоцитов возвращаются до значений, близких к нормальному уровню ( Ю.М. Лопухин, Р.В. Петров, и др., 1977; Л.В. Ковальчук, Б.В., Цейтлин и др., 1981; Oates К.К., Goldstein A.L., 1984). Данное наблюдение явилось обоснованием для создания пептидных иммунорегулируюших препаратов первого поколения, таких как Тимозин -фракция 5, Тактивин, Тималин и некоторых других (Goldstein A., Low T.L.K., 1978; Ю.М. Лопухин, Р.В. Петров и др., 1978; В.Г. Морозов, В.Х. Хавинсон, 1978).
Клиническое изучение препаратов, полученных на основе экстрактов ткани тимуса, продемонстрировало выраженное улучшение количественных и функциональных показателей Т-системы иммунитета с достижением положительного терапевтического эффекта у больных инфекционной и неинфекционной патологией (Ю.М. Лопухин, 1982; В.Х. Хавинсон, В.Г. Морозов, 1981; Constanzi J., Daniels J. et al., 1979). Вместе с тем, препараты первого поколения, обладают рядом существенных недостатков, которые резко ограничивают возможности их производства и применения. Экстракты тимуса представляют собой неразделенную смесь пептидов и других биологически активных веществ, что не позволяет проводить их стандартизацию.
Создание лекарственных препаратов второго поколения на основе синтетических гормонов иммунитета (тимазин-а ), тимопоэтин 1,2) позволило обеспечить их надежную стандартизацию и усиление иммунорегули-рующего действия (Ershler W.B., Hebert J.С. et al., 1985; Audhya Т.К., Scheid MP. et al., 1984).
Однако, масштабирование производства и применение лекарственных препаратов второго поколения оказалось затруднительным из-за сложности химического синтеза больших пептидов и наличия у них полифункциональных участков. Поэтому дальнейшие исследования касались изучения структурно-функциональной особенности и поиска активных фрагментов естественных гормонов иммунитета. Такие фрагменты были обнаружены в составе тимозина-а 1 и тимопоэтина I и II. На основе одного из таких фрагментов, включающего аминокислотные остатки 32-36 тимопоэтина, создан препарат третьего поколения - Тимунокс (Тимопентин), (Goldstein G., Audhya Т.К., 1985). Экспериментальное исследование подтвердило полное соответствие его иммунорегулирутощей активности и действия на-тивного тимопоэтина. Клиническое изучение тимунокса продемонстрировало его безвредность, способность частично или полностью восстанавливать нарушенные показатели Т-клеточного иммунитета, терапевтическую эффективность при лечении острого и хронического стресса, рассеянного склероза, ревматоидного артрита, в качестве средства профилактики гнойно-септических осложнений в плане предоперационной подготовки хирургических больных и для достижения адъювантного действия при назначении некоторых вакцин (Е.М. Вазничая, Л.М. Тарасенко и др., 1992; Cognazzo A., Seliak D. et al., 1991; Afeltra A., Galeazzi M. et al., 1991; Braga M, Di Francesco A. et al., 1992; Palestini M, Messina A. et al., 1990). Сравнительный анализ фрагментов различных тимических гормонов показал, что только синтетические активные фрагменты тимопоэтина способны воспроизводить иммунорегулирующее действие естественного тимического гормона на периферическую иммунную систему организма с достижением терапевтического эффекта, а другие, например короткие фрагменты тимозина-а 1 (ВігтС, 1984), рестриктированы по иммунорегуляторной активности и не получили развития для их лекарственного применения.
Дальнейший поиск активных фрагментов естественных гормонов иммунитета для создания новых препаратов к настоящему времени представляется исчерпанным по причине крайне ограниченного представительства семейства естественных тимических гормонов и однотипности их действия.
В этой связи создание иммунорегуляторных пептидов нового поколения требует применения иного подхода и других методических решений. Такой подход видится в направленном синтезе иммунорегуляторных пептидов нового, четвертого поколения путем модификации последовательности аминокислотных остатков естественных гормонов иммунитета для усиления противоинфекциоиного иммунитета, повышения эффективности вакцинации, расширения регулирующего действия на другие системы защиты и инактивации патогенетических факторов, вызывающих повреждения и нарушения функционирования клеточных структур организма.
1.2. Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось совершенствование средств терапии инфекционных, онкологических и кожных заболеваний путем разработки пептидного лекарственного препарата нового, четвертого поколения, для коррекции иммунодефицитных состояний, усиления противоинфекциоиного иммунитета и резистентности организма к вирусной инфекции, повышения эффективности вакцинации, стимуляции антиоксидантной системы защиты, инактивации свободно-радикальных соединений и сокращения симптомов интоксикации и воспаления у больных.
В соответствии с целью работы решались следующие задачи:
-
Разработать химическую структуру нового регуляторного пептида путем фармакологического скрининга модифицированных аналогов фрагментов тимического гормона - тимопоэтина по критерию безвредности, специфической активности и стабильности.
-
Создать лекарственную форму, разработать технические условия изготовления, методы биологического и аналитического контроля лекарственного препарата.
-
Изучить действие препарата на количественные и функциональные показатели Т-клеточного иммунитета, продукцию иммуноглобулинов и специфических антител, иммуногенность вакцин, синтез медиаторов иммунитета (воспаления) и оценить его протективное влияние на организм при заражении некоторыми вирусами.
-
Определить влияние препарата на кислород-зависимую систему бак-терицидности нейтрофилов, окислительно-антиокислительную систему и перекисное окисление липидов.
-
Разработать клинико-иммунологические критерии оценки эффективности препарата и провести его клиническое изучение.
-
На основании результатов клинического изучения разработать инструкцию по применению препарата в медицинской практике.
1.3. Научная новизна. В работе предложено повое-решение проблемы патогенетической терапии инфекционных, онкологических и кожных заболевании человека, основанное на создании лекарственного препарата, содержащего в качестве фармакологического вещества уникальный регуля-торный гексапептид, обеспечивающий коррекцию нарушенных показателей Т-клеточного иммунитета и кислород-зависимой системы бактерицидності!, усиление гуморального противовирусного и антибактериального иммунитета, стимуляцию антиоксидантной системы защиты и инактивацию повреждающих свободнорадикальных соединений в организме больного.
Впервые разработана и экспериментально обоснована методика направленного синтеза пептидных производных тимического гормона иммунитета, позволяющая путем модификации последовательности аминокислотных остатков изменять его иммунорегуляторную активность и расширять регулирующее действие на другие системы защиты и патогенетические факторы, вызывающие повреждения и нарушения функционирования клеточных структур организма.
Предложенная методика направленного синтеза пептидных производных тимического гормона - тимопоэтина впервые позволила создать гексапептид структурной формулы: аргинил-а-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинин, обладающий свойством оказывать регуляторное действие на механизмы иммунной и неспецифической (окислительно-антиокислительной) системы защиты организма.
Полученный гексапептид, как синтетический производный тимического гормона иммунитета, выделен, согласно предложенной нами классификации [7], в группу иммунорегуляторных пептидов четвертого поколения и на основании совокупности его основных фармакологических эффектов определен как регуляторный иммуноксидредуктант.
Разработан состав лекарственной формы нового препарата, получившего наименование Имунофан (Тимогексин), критерии фармакологической оценки, специфического действия и показания для клинического изучения.
Впервые показана клиническая эффективность применения препарата нового поколения при лечении инфекционных, онкологических и кожных заболеваний людей.
1.4. Практическая значимость. Разработан новый лекарственный
препарат Имунофан в виде 0,005% раствора в ампулах по 1,0 мл для лече
ния онкологических больных в схеме радикального комбинированного ле
чения и у больных с распространенным опухолевым процессом различной
локализации в плане комплексной или симптоматической терапии;
при оппортунистических инфекциях (цитомегаловирусная и герпетическая инфекция, токсоплазмоз, хламидиоз, пневмоцистоз, криптоспороди-оз);
при хроническом вирусном гепатите В и бруцеллезе, дифтерии, дифтерийном бактерионосительстве;
при лечении тяжедообожженных с явлениями токсемии, септикоток-семии, у больных с септическим эндокардитом, длительно незаживающими ранами конечностей, гнойно-септическими осложнениями;
при бронхо-обструктивном синдроме, холецисто-панкреатите, ревматоидном артрите и лечении псориаза. Получены авторские свидетельства СССР NN997298; 1469616; 1482154; 3706037; 4850515; Патент РФ N2062096; Патент США N 4377511; патент Великобритании N 2086392В
1.5. Внедрение. В соответствии с приказом Министерства здраво
охранения и медицинской промышленности Российской Федерации N 283
от 09 июля 1996 года лекарственное средство под названием "Раствор
Имунофана 0,005% для инъекций" в виде лекарственной формы "раствор"
состава ВФС 42-2754-96 зарегистрировано в Российской Федерации и раз
решено для медицинского применения и промышленного выпуска. Про
мышленный выпуск препарата осуществляет Научно-производственное
предприятие "Бионокс", г. Москва на основании Регистрационного удосто
верения N 96/283/5.
1.6. Апробация работы. Материалы исследования доложены на: со
ветско-французском научном симпозиуме по медицинской биотехнологии
(Москва, 1990); IV Всесоюзном съезде гастроэнтерологов (Москва-
Ленинград, 1990); LXII сессии общего собрания АМН СССР (Москва,
1991); Всесоюзной конференции "Экологическая безопасность и техноген
ный риск предприятий" (Иркутск, 1991); 1-ом Российском национальном
конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1992); международной выставке
"Медицинская биотехнология в СССР" (Карсруэ, 1991); международном
симпозиуме по аллергологии и клинической иммунологии (Алма-Ата,
1992); 1-ой международной конференции по иммунореабилитации
(Цхалтубо, 1992); Всесоюзной научной конференции "Разработка и произ-
водство препаратов медицинской биотехнологии" (Махачкала, 1992); 1-ом международном конгрессе по иммунореабилитации (Сочи, Дагомыс, 1994); международном симпозиуме "Пищевые зоонозы" (Москва, 1995), II Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1995).
1.7. Публикации. По материалам исследования соискатель имеет 36 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях, 5 авторских свидетельств СССР, 1 патент Российской Федерации и 2 патента за рубежом.
