Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 16
1.1. Современные представления о клинике и патогенезе аутоиммунного тиреоидита 16
1.2. Применение цветовой допплерографии для диагностики аутоиммунного тиреоидита 28
1.3. Применение магнитно-резонансной томографии для диагностики заболеваний щитовидной железы 42
1.4. Аутоантитела к ДНК в норме и патологии 51
1.4.1. Биологические функции аутоантител к ДНК в норме и патологии 51
1.4.2. Возможные механизмы реализации повреждающего действия патологических аутоантител к ДНК при аутоиммунных заболеваниях 54
1.4.3. Биологические функции каталитических аутоантител к ДНК в норме и патологии 56
1.4.4. Возможные механизмы реализации повреждающего действия каталитических аутоантител к ДНК при аутоиммунной патологии 62
Глава 2. Материалы и методы исследования 66
2.1. Объект исследования 66
2.2. Ультразвуковое исследование щитовидной железы с допплерографией 68
2.3. Магнитно-резонансная томография щитовидной железы 70
2.4. Определение уровня антител к нативной и денатурированной ДНК в сыворотке крови иммуноферментным методом 73
2.5. Изучение каталитических свойств антител к нативной ДНК, выделенных из сыворотки крови больных аутоиммунным тиреоидитом методом атомно-силовой микроскопии 74
2.5.1. Получение очищенных антител к нативной ДНК 75
2.5.2. Изучение каталитических свойств антител к нативной ДНК, выделенных из сыворотки крови больных аутоиммунным тиреоидитом, методом атомно-силовой микроскопии 78
2.6. Методы статистического анализа 80
Результаты собственных исследований и их обсуждение
Глава 3. Определение значения ультразвуковой допплерографии щитовидной железы для диагностики аутоиммунного тиреоидита 82
3.1. Оценка информативности ультразвуковой допплерографии щитовидной железы для диагностики аутоиммунного тиреоидита 82
3.2. Изучение зависимости количественных допплерографических показателей в нижних щитовидных артериях от функционального состояния щитовидной железы у больных аутоиммунным тиреоидитом 95
3.3. Изучение зависимости количественных допплерографических показателей в нижних щитовидных артериях от степени активности аутоиммунного процесса у больных аутоиммунным тиреоидитом 107
3.4. Корреляционный анализ зависимости количественных допплерографических показателей в нижних щитовидных артериях у больных аутоиммунным тиреоидитом от степениактивности аутоиммунного процесса и от функционального состояния щитовидной железы 128
Глава 4. Определение значения магнитно-резонансной томографии щитовидной железы для диагностики аутоиммунного тиреоидита 135
4.1. Оптимизация стандартного протокола MP-томографии органов передней поверхности шеи для исследования щитовидной железы 135
4.2. Оценка информативности МРТ щитовидной железы для диагностики аутоиммунного тиреоидита 146
4.3. Изучение зависимости показателей средней интенсивности MP- сигнала тиреоидной ткани от клинико-морфологических изменений в щитовидной железе у пациентов с аутоиммунным тиреоидитом 157
4.4. Изучение зависимости показателей относительной интенсивности MP-сигнала тиреоидной ткани от клинико-морфологических изменений в щитовидной железе у пациентов с аутоиммунным тиреоидитом 170
4.5. Изучение влияния физиологических доз йода на МР-характеристики щитовидной железы у больных аутоиммунным тиреоидитом 175
Глава 5. Определение содержания в сыворотке крови больных аутоиммунным тиреоидитом ДНК-связывающих антител и изучение их каталитической активности 184
5.1. Результаты определения уровня антител к нДНК и дДНК в сыворотке крови у больных аутоиммунным тиреоидитом иммуноферментным методом 184
5.2. Результаты исследования каталитических свойств антител к нативной ДНК, выделенных из сыворотки крови больных аутоиммунным тиреоидитом, методом атомно-силовой микроскопии 209
Обсуждение полученных результатов 216
Выводы 264
Практические рекомендации 266
Список основной использованной литературы 268
- Применение цветовой допплерографии для диагностики аутоиммунного тиреоидита
- Изучение зависимости количественных допплерографических показателей в нижних щитовидных артериях от степени активности аутоиммунного процесса у больных аутоиммунным тиреоидитом
- Изучение влияния физиологических доз йода на МР-характеристики щитовидной железы у больных аутоиммунным тиреоидитом
- Результаты исследования каталитических свойств антител к нативной ДНК, выделенных из сыворотки крови больных аутоиммунным тиреоидитом, методом атомно-силовой микроскопии
Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема аутоиммунного тиреоиди-та (АИТ) до настоящего времени остается актуальной, так как вопросы этиологии, патогенеза, морфологии, классификации, диагностики, терапии и прогноза заболевания не получили еще своего окончательного решения АИТ считается одним из наиболее распространенных заболеваний щитовидной железы (ЩЖ) после йоддефицитных состояний (Балаболкин М И, 1997) Его частота среди взрослого населения колеблется от 6 до 11% (Петунина Н А. 1997) Он занимает значительное место в структуре диффузного нетоксического зоба и является наиболее частой причиной развития первичного гипотиреоза (Касаткина Э П, 1999) Диагностика АИТ сопряжена с определенными трудностями в связи с низкой специфичностью применяющихся лабораторных и инструментальных методов исследования В соответствии с «Клиническими рекомендациями Российской ассоциации эндокринологов по диагностике и лечению аутоиммунного тиреоидита» «большими» диагносгическими признаками заболевания являются первичный гипотиреоз, наличие высоких титров антител (AT) к ти-реоидной пероксидазе (ТПО) и ультразвуковых признаков аутоиммунной патологии ЩЖ При отсутствии одного из «больших» диагностических признаков, диагноз АИТ носит вероятностный характер (Дедов ИИ и др . 2003) Однако AT к ТПО являются малоспецифичными для АИТ и могут обнаруживаться как при других заболеваниях ЩЖ, так и у 3-26% здоровых лиц (Knudsen N., 1999, Ladenson Р W., 2000) Особую трудность для диагностики представляют серонега-тивные варианты заболевания, протекающие без повышения содержания AT к компонентам ЩЖ в сыворотке крови, составляющие более 50% случаев АИТ у детей (Касаткина Э П, 1999) Исследованиями ряда авторов было доказано присутствие в сыворотке крови больных аутоиммунными заболеваниями ЩЖ ДНК-связывающих AT, проявляющих ДНКазную активность (Невинский Г А . 2000, Бреусов А А и др , 2001, Сучков С С , 2002) При ряде аутоиммунных заболеваний выявлена положительная корреляция между уровнем ДНКазной активности AT и степенью выраженности клинических и лабораторных признаков аутоиммунного процесса (Бреусов А А и др, 2001, Сащенко Л П, 2001. Бунева В Н и др, 2003, Andnevskaya О A et al, 2002, Nevrn-sky GA et al, 2003) В этом плане представляется целесообразным изучение концентрации AT к ДНК и их ДНКазной активности при
АИТ До настоящего времени в литературе отсутствуют ссылки на исследования, в которых проводилась комплексная оценка соногра-фичерких, дрпплерографических, иммунологических и функциональных характеристик состояния ЩЖ при АИТ До настоящего времени окончательно не определено значение магнитно-резонансной томографии (МРТ) в диагностике АИТ В настоящее время продолжает обсуждаться вопрос о целесообразности назначения физиологических доз йода больным АИТ. проживающим в йоддефицитных регионах, что указывает на необходимость поиска дополнительных диагностических критериев, которые позволили бы выделить среди общей группы больных АИТ ту часть пациентов, которым было бы показано
\ применение препаратов йода Исходя из перечисленного выше, пред-
ставляется актуальной выработка дополнительных диагностических критериев АИТ на основе доступных в практическом здравоохранении неинвазивных лучевых методов исследования ЩЖ (ультразвуковой допплерографии и магнитно-резонансной томографии), а также оценка диагностической значимости определения уровня AT к ДНК и их ДНКазной активности при данном заболевании
Цель исследования: разработать критерии и алгоритмы дифференциальной диагностики аутоиммунного тиреоидита на основании данных ультразвуковой допплерографии, магнитно-резонансной томографии и определения концентрации ДНК-связывающих аутоанти-
' тел в сыворотке крови иммуноферментным методом и их ДНК-азной
j активности
Задачи исследования:
1 Разработать диагностические критерии аутоиммунного ти
реоидита на основании ультразвуковой допплерографии щитовидной
железы Оценить зависимость показателей скорости систолического
кровотока в нижних щитовидных артериях от функционального со
стояния щитовидной железы и степени активности аутоиммунного
процесса
-
Разработать оптимальную программу МРТ щитовидной железы Изучить MP-семиотику аутоиммунного тиреоидита с учетом кли-нико-морфологических вариантов его течения Оценить чувствительность определения средней и относительной интенсивности МР-сигнала тиреоидной ткани для диагностики аутоиммунного тиреоидита
-
Изучить влияние физиологических доз йода на MP-характеристики щитовидной железы при аутоиммунном тиреоидите
-
Оценить чувствительность определения концентрации антител к нативной и денатурированной ДНК в сыворотке крови иммуно-ферментным методом для диагностики аутоиммунного тиреоидита Изучить зависимость содержания антител к нативной и денатурированной ДНК в сыворотке крови больных аутоиммунным тиреоидитом от функционального состояния щитовидной железы и степени активности аутоиммунного процесса
-
Методом атомно-силовой микроскопии определить наличие каталитической активности у аутоантител к нативной ДНК, выделенных из сыворотки крови больных аутоиммунным тиреоидитом
Научная новизна. Впервые изучены допплерографические признаки различных клинико-морфологических вариантов течения аутоиммунного тиреоидита Показана высокая информативность ультразвукового исследования в режиме цветового доплеровского картирования для диагностики аутоиммунного тиреоидита Установлена зависимость допплерографических показателей от степени активности аутоиммунного воспаления и функционального состояния щитовидной железы
Предложено теоретическое обоснование изменения ряда инструментальных параметров и введения дополнительных опций при проведении МРТ щитовидной железы, что позволило повысить качество изображения и диагностическую информативность исследования по сравнению со стандартной программой МРТ органов шеи
Впервые изучены MP-признаки различных клинико-морфологических вариантов течения аутоиммунного тиреоидита Установлена чувствительность определения средней и относительной интенсивности MP-сигнала тиреоидной ткани для диагностики аутоиммунного тиреоидита Показана зависимость величины интенсивности МР-сигнала тиреоидной паренхимы от типа морфологических изменений в щитовидной железе при аутоиммунном тиреоидите Показана целесообразность и безопасность применения физиологических доз йода при аутоиммунном тиреоидите, развившемся на фоне эндемического зоба
Впервые проведена оценка информативности определения содержания антител к нативной и денатурированной ДНК в сыворотке крови иммуноферментным методом и отношения AT к нДНК/АТ к дДНК для диагностики аутоиммунного тиреоидита Показана зависимость между содержанием ДНК-связывающих AT в сыворотке крови, степенью активности аутоиммунного воспаления и функцио-
нальным состоянием щитовидной железы Определена взаимосвязь между содержанием AT к нДНК в сыворотке крови и процессом аутоиммунной деструкции щитовидной железы с формированием гипотиреоза Показана динамика направленности ДНК-связывающих AT в процессе естественного течения заболевания и на фоне заместительной терапии препаратами тиреоидных гормонов
Впервые для визуальной оценки механизма взаимодействия AT к нДНК, выделенных из сыворотки крови больных аутоиммунным тиреоидитом, и молекул нативной ДНК применена атомно-силовая микроскопия (АСМ) Методом АСМ получены изображения комплексов ДНК-ДНК-гидролизующее антитело к нДНК Установлено наличие ДНКазной активности у AT к нДНК, выделенных из сыворотки крови больных аутоиммунным тиреоидитом, и показан непро-цессивный механизм их взаимодействия с молекулами ДНК
Практическая значимость. Выделенные типы васкуляризации щитовидной железы наряду с определением показателей скорости систолического кровотока в нижних щитовидных артериях могут использоваться в качестве дополнительных критериев диагностики аутоиммунного тиреоидита
Описанные MP-признаки различных клинико-морфологических вариантов течения аутоиммунного тиреоидита в совокупности с определением относительной интенсивности сигнала тиреоидной паренхимы могут использоваться в качестве дополнительных критериев дифференциальной диагностики заболеваний щитовидной железы Оптимизация протокола МРТ щитовидной железы обеспечила возможность получения MP-изображений с высоким пространственным разрешением и контрастностью, что значительно повысило информативность исследования по сравнению со стандартным протоколом Наличие положительной динамики показателей относительной интенсивности сигнала и размеров щитовидной железы у больных аутоиммунным тиреоидитом, сочетающимся с эндемическим зобом, на фоне приема физиологических доз йода является доказательством необходимости и безопасности применения физиологических доз препаратов йода у этой категории больных
Определение содержания AT к нДНК в сыворотке крови методом ИФА и (или) отношения AT к нДНК/АТ к дДНК может использоваться в качестве дополнительного диагностического критерия аутоиммунного тиреоидита Наличие положительной корреляционной зависимости между концентрацией AT к ТПО и содержанием AT к
нДНК в сыворотке крови больных аутоиммунным тиреоидитом указывает на возможность их определения для оценки степени активности аутоиммунного воспаления в щитовидной железе Наличие положительной корреляционной зависимости между концентрацией ти-реотропного гормона и содержанием AT к нДНК в сыворотке крови может использоваться в качестве дополнительного критерия эффективности супрессивной терапии препаратами тиреоидных гормонов при большом зобе, обусловленном аутоиммунным тиреоидитом Значительное повышение концентрации AT к нДНК и коэффициента отношения AT к нДНК/АТ к дДНК у больных аутоиммунным тиреоидитом с субклиническим гипотиреозом, а также наличие положительной динамики указанных показателей на фоне приема левотирок-сина предполагает возможность их использования в качестве дополнительных критериев необходимости назначения препаратов тиреоидных гормонов при субклинической гипофункции щитовидной железы
Полученные данные о ДНК-гидролизующей активности AT к нДНК, выделенных из сыворотки крови больных аутоиммунным тиреоидитом, могут внести вклад в понимание механизмов развития аутоиммунных заболеваний щитовидной железы и служить методической основой для изучения патогенетической роли ДНК-абзимов при аутоиммунной патологии
Внедрение результатов исследования. Основные результаты исследования внедрены в практическую деятельность НУЗ «Отделенческая больница на ст Казань» ОАО «РЖД», Республиканской клинической больницы №2 МЗ Республики Татарстан, ГУ «Межрегиональный клинико-диагностический центр», а также в учебный процесс кафедр лучевой диагностики и эндокринологии ГОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Апробация работы. Основные положения работы доложены на 8 (10) Всероссийском Симпозиуме по хирургической эндокринологии «Современные аспекты хирургической .эндокринологии» (Казань, 1999), Республиканской научно-практической конференции «Современные проблемы медицинской науки и практики» (Казань, 2000), 12-м Европейском конгрессе радиологов (Вена, Австрия. 2000), 13-м Европейском конгрессе радиологов (Вена, Австрия, 2001), Дюков-ском семинаре по семейной медицине (Зальцбург, Австрия, 2001), Региональной научно-практической конференции «Новые методы луче-
вой диагностики» (Казань. 2001). Республиканской научно-практической конференции «Современные проблемы лучевой диагностики» (Казань. 2001), Республиканской научно-практической конференции «Современные ультразвуковые технологии» (Казань, 2002), Республиканской научно-практической конференции «Новые методы лучевой диагностики» (Казань. 2002). Республиканской научно-практической конференции «Диагностика и лечение узлового зоба» (Казань. 2002). Республиканской научно-практической конференции «Современные проблемы развития регионального здравоохранения» (Казань, 2003), 16-м Европейском конгрессе радиологов (Вена, Австрия, 2004), Межрегиональной конференции «Современные представления о диагностике и лечении узлового зоба» (Н Новгород, 2005). Республиканской научно-практической конференции «Актуальные проблемы эндокринологии» (Казань, 2006), VIII Европейском Конгрессе Эндокринологов (Глазго, Англия, 2006), Республиканской научно-практической конференции «Актуальные проблемы эндокринологии» (Казань. 2007), совместном заседании кафедры лучевой диагностики и кафедры эндокринологии ГОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (Казань, 2007)
Публикации. По теме диссертации опубликовано 34 печатные работы, в том числе 2 учебных пособия
Положения, выносимые на защиту:
1 Применение ультразвуковой допплерографии щитовидной
железы позволяет дифференцировать различные клинико-морфоло-
гические варианты аутоиммунного тиреоидита по характеру васкуля-
ризации тиреоидной паренхимы Определение скорости систоличе
ского кровотока в нижних щитовидных артериях при аутоиммунном
тиреоидите позволяет определять степень активности аутоиммунного
процесса и оценивать функциональное состояние щитовидной желе
зы
2 Протокол МРТ, оптимизированный для исследования щито
видной железы, обеспечивает улучшение пространственного разре
шения и контрастности изображения за счет повышения отношения
сигнал/шум Проведение МРТ в сочетании с определением относи
тельной интенсивности сигнала щитовидной железы позволяет диф
ференцировать различные морфологические варианты аутоиммунно
го тиреоидита от другой патологии щитовидной железы Применение
МРТ щитовидной железы позволяет выделить группу больных ауто-
иммунным тиреоидитом которым показана терапия препаратами йода
-
Определение содержания AT к нДНК в сыворотке крови им-муноферментным методом и (или) отношения AT к нДНК/АТ к дДНК позволяют проводить оценку степени активности аутоиммунного воспаления в щитовидной железе и дифференцировать аутоиммунный тиреоидит от другой тиреоиднои патологии неаутоиммунной природы
-
Атомно-силовая микроскопия позволяет определять наличие и оценивать механизм каталитической активности ДНК-связыва-ющих антител, выделенных из сыворотки крови больных аутоиммунным тиреоидитом
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 297 страницах машинописного текста, состоит из введения^ обзора литературы, 4-х глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего 283 источника, из них 100 работ отечественных и 183 зарубежных авторов Работа иллюстрирована 83 рисунками и 26 таблицами
Применение цветовой допплерографии для диагностики аутоиммунного тиреоидита
Цветовая допплерография (ЦД) используется в диагностике патологических изменений ЩЖ с начала восьмидесятых годов прошлого столетия. ЦД является уникальным методом, позволяющим оценить качественные и количественные параметры кровотока не только в крупных сосудах - тирео-идных артериях и венах, но и получить изображения мелких паренхиматозных сосудов ЩЖ (Лелюк В.Г., Лелюк С.Е., 1995; Митьков В.В., Зыкин Б.И., Буланов М.Н., 1996; Ямасито С, Ито М., 1996; Пыков М.И., Шилин Д.Е., Рюмин Г.А. и др., 1997; Цыб А.Ф., Паршин B.C., Нестайко Г.В., 1998; Харченко В.П., Котляров П.М., Сметанина Л.И., 1999; Зубарев А.В., Башилов В.П., Насникова И.Ю. и др., 2000; Артемова A.M., Игнатков В.Я., 2001; Котляров П.М., Янушпольская Т.О., Александров Ю.К. и др., 2001; Маркова Н.В., 2001; Михайлов М.К., Тухбатуллин М.Г., 2002; Тухбатуллин М.Г., Ва-леева К.Т., Сорокина Н.В., 2004; Заболотская Н.В., Заболотский B.C., 2005; Antoniv V.R., Dynnik О.В., Korychenskyi O.M., 2000; Gritzmann N., Koischwitz D., Rettenbacher Т., 2000). Диагностическая ценность ЦД ЩЖ продолжает обсуждаться до настоящего времени. Исследования, проведенные в течение последних лет, не привели к определенным однозначным результатам, поскольку разные патологические процессы могут иметь как схожие, так и отличающиеся типы и скоростные характеристики васкуляризации (Schulz S.L., Seeberger U., Hengstmann J.H., 2003). В связи с этим считается, что дифференциальный диагноз патологических изменений в тиреоидной ткани требует более детализированного и специфичного описания результатов ЦД (Hegedus L., Karstrup S., 1998). Высокая информативность ЦД общепризнана для дифференциальной диагностики автономных аденом ЩЖ, идентифи-кации ги-пертиреоидной фазы подострого тиреоидита и ДТЗ, разграничения I и II типов амиодарон - индуцированного тиреотоксикоза, а так же для диагностики лекарственного тиреотоксикоза (Becker D., Bair H.J., Becker W. et al., 1997; Bogazzi F., Bartalena L., Brogioni S. et al., 1997; Hiromatsu Y., Ishibashi M., Miyake I. et al., 1999; Summaria V., Salvatori M., Rufmi V., 1999; Arslan H., Unal 0., Algun E. et al., 2000). В то же время, ЦД имеет ограниченное значение для верификации доброкачественных и злокачествен-ных новообразований ЩЖ, в дифференциальной диагностике некоторых диффузных и очаговых поражений органа (Котляров П.М., Янушпольская Т.О., Александров Ю.К. и др., 2001; Маркова Н.В., 2001; Тухбатуллин М.Г., Валеева К.Т., Сорокина Н.В., 2004; Любаев В.Л., Бржезовский В.Ж., Сомасундрам С. и др., 2005; Блюм М., 2006; Arslan Н., Unal О., Algun Е. et al., 2000; Langer J.E., Khan A., Nisenbaum H.L. et al., 2001), что объясняется частым отсутствием зависимости допплерографической картины от харак-тера гистологических изменений в тиреоидной ткани. По данным R. Lagalla, G. Caruso, М. Romano и др. (1993) информативность ЦД в диагностике АИТ составляет: специфичность - 91,4%, чувствительность - 80,3%, предсказуе-мость положительного теста-91,4%.
В норме сосудистый рисунок ЩЖ представлен единичными цветовыми сигналами, исходящими от паренхиматозных сосудов. Кроме того, визуализируются входящие по периферии регионарные верхние и нижние щитовидные артерии (ЩА), а так же сопровождающие их одноименные вены. То есть ЦД предоставляет информацию о глобальном распределении сосудов в срезе ЩЖ, однако, по мнению S. Huber (2001) только количественные данные могут быть использованы для верификации диагноза, определения прогноза заболевания, а также - для оценки эффективности и мониторирования проводимого лечения.
Большинство исследователей с целью воспроизводимости и унификации описания допплерограм ЩЖ используют качественную шкалу. Общепризнанной является шкала, включающая четыре степени выраженности кровотока в ЩЖ. Нулевая степень васкуляризации присуща неизмененной железе и характеризуется отсутствием цветовых сигналов в ее паренхиме, кровоток определяется лишь в периферических щитовидных артериях. 1-я степень характеризуется наличием слабовыраженного паренхиматозного кровотока. П-я степень подразумевает усиление паренхиматозного кровотока с его диффузным и гомогенным распределением. Ш-я степень проявляется в виде значительного усиления паренхиматозного кровотока с его диффузным и гомогенным распределением, так называемая «thyroid inferno» (Bogazzi F., Bartalena L., Brogioni S. et al., 1999; Arslan H., Unal O., Algun E. et al., 2000).
R. Lagalla, G. Caruso, M. Romano и др. (1993) выделили четыре основных типа васкуляризации ЩЖ: I - отсутствие цветовых сигналов, II - наличие перино-дулярного кровотока, III - одновременное присутствие пери- и интра-нодулярного кровотока, IV - диффузное повышение васкуляризации органа.
Э.П. Касаткина, Д.Е. Шилин, М.И. Пыков (1999) выделили шесть типов допплерографической картины ЩЖ с соответствующей оценкой по бальной шкале. Нулевой тип - цветные эхо-сигналы на эхографическом срезе не определяются; 1 тип - единичные цветные пиксели локализуются преимущественно по периферии среза; 2 тип - единичные цветные пиксели располагаются преимущественно в толще среза; 3 тип - единичные цветные пиксели выявляются по периферии и в толще среза; 4 тип - множественные цветные пиксели распределяются по всему срезу доли; 5 тип - огромное количество сливающихся цветных эхо-сигналов определяется по всему срезу.
У здоровых лиц степень васкуляризации ЩЖ умеренная и соответствует 0-3 баллам. Диффузное усиление кровотока, соответствующе 4-5 баллам, наблюдается при тиреотоксикозе.
М. Baldini, D. Castagnone, R. Rivolta и др. (1997) с целью количественной оценки степени выраженности паренхиматозного кровотока определяли количество сосудов на квадратный сантиметр площади среза.
СР. Глонти (1996) для объективизации данных ЦД применяла суммирование площадей изображений сосудов в единице площади тиреоидной ткани на замороженных допплерограммах ЩЖ.
Анализ параметров кровотока как абсолютных угол - зависимых: скорость систолического кровотока (ССК), скорость диастолического кровотока (СДК); так и относительных угол - независимых: индекс резистентности (RI), пульсативный индекс (PI), выполненный на основании серийных исследований, показал наличие симметричного характера изменений в верхних и нижних щитовидных артериях (Пыков М.И., Шилин Д.Е., Рюмин Г.А. и др., 1997; Касаткина Э.П., Шилин Д.Е., Пыков М.И., 1999; Жарская И.М., 2003). В большинстве работ, посвященных допплерографии ЩЖ, состояние кровотока оценивалось по показателям в нижних щитовидных артериях (ЕШДА), что было обусловлено доступностью и лучшей воспроизводимостью исследования (Caruso G., Attard М., Caronia A. et al., 2000; Schulz S.L., Seeberger U., Hengstmann J.H., 2003). У здоровых лиц средние показатели пиковой ССК в НЩА по данным М.И. Пыкова, Д.Е. Шилина, Г.А. Рюмина и др. (1997) составляют 28,04±1,52 см/сек., по данным G. Caruso, М. Attard, A. Caronia и др. (2000) - 50,0±10,0 см/сек, М. Sponza, В. Fabris, М. Bertolotto и др. (1997) -20,0±4,0 см/сек., G. Argalia, U.Mignosi, F.Lucarelli и др. (1997) - 18±4,65 см/сек., Y. Hozumi, Т. Yamanaka (1996) - 24,6±6,0 см/сек., P. Vitti, Т. Rago, S. Mazzeo и др. (1995) - 17,7±3,0 см/сек., С.С. Wu, J.K. Torng (1991) - 32,4±13,49 см/сек. Показатели RI у здоровых лиц составляют: 0,65±0,02 (Пыков М.И., Шилин Д.Е., Рюмин Г.А. и др., 1997); 0,55±0,02 (Hozumi Y., Yamanaka Т., 1996); 0,53±0,07 (Argalia G., Mignosi U., Lucarelli F. et al., 1997), 0,6±0,04 (Sponza M., Fabris В., Bertolotto M. et al., 1997). Величина PI у здоровых лиц составляет: 0,5-1,5 (Касаткина Э.П., Шилин Д.Е., Пыков М.И., 1999), 0,46±0,11 (Sievers K.W., Krause U., Plajer Т. et al., 1993). Вариабельность показателей артериального кровотока в ЩЖ, по видимому, объясняется тем, что исследования проводились в группах лиц, не рандомизированных по полу и возрасту.
Изучение зависимости количественных допплерографических показателей в нижних щитовидных артериях от степени активности аутоиммунного процесса у больных аутоиммунным тиреоидитом
С целью исключения возможного влияния функционального состояния ЩЖ на исследуемые параметры определение зависимости количественных допплерографических показателей в НЩА от степени активности аутоиммунного процесса при АРГГ проводилось у пациентов в стадии эутиреоза. Было обследовано 150 больных АИТ в стадии эутиреоза, не получавших какого-либо лечения. Степень активности аутоиммунного процесса оценивалась в зависимости от концентрации аутоантител к ТЛО в сыворотке крови. В соответствии с этим выделялись следующие стадии: минимальная активность аутоиммунного процесса (при уровне AT к ТПО от 30 до 100 МЕ/мл), умеренная активность (при уровне AT к ТПО от 100 до 500 МЕ/мл) и активная стадия (при уровне AT к ТПО более 500 МЕ/мл). Из 150 больных АИТ минимальная активность аутоиммунного процесса наблюдалась у 50, умеренная активность - у 50 и активная стадия - у 50 человек (таблица 3.6).
Медиана V max НЩА в контрольной группе здоровых лиц составила 0,22 м/сек (2,5П - 0,17; 97,5П - 0,29) и достоверно не отличалась от указанного показателя больных эндемическим эутиреоидным зобом - 0,22 м/сек (2,5П - 0,14; 97,5П - 0,35). Значения максимальной систолической скорости кровотока в НЩА у больных АИТ с были значимо выше показателей контрольной группы здоровых лиц и больных ЭЭЗ (при минимальной и умеренной активности аутоиммунного процесса р 0,05 и при активной стадии р 0,001 по критерию Данна). Медиана V max НЩА у больных АИТ в стадии минимальной активности аутоиммунного воспаления составила 0,26 м/сек (2,5П - 0,15; 97,5П - 0,47) и была значимо ниже, показателей Vmax НЩА у больных с умеренной активностью аутоиммунного процесса - 0,37 м/сек (2,5П - 0,23; 97,5П - 0,64) (р 0,05 по критерию Дана) и значений Vmax НЩА у больных с активной стадией - 0,53 м/сек (2,5П - 0,22; 97,5П - 1,41) (р 0,001 по критерию Дана). Значения V max НЩА у больных АИТ с выраженной степенью активности аутоиммунного процесса были значимо выше (р 0,05 по критерию Данна) указанных показателей в группе больных с умеренной активностью аутоиммунного воспаления (таблица 3.7; рис. 3.17 и 3.20 а, б - 3.24 а, б).
Показатели индекса пульсативности и индекса резистентности в НЩА у больных АИТ достоверно не отличались как между подгруппами с разной степенью активности аутоиммунного воспаления, так и от значений контрольной группы здоровых лиц и группы больных ЭЭЗ (таблица 3.7; рис. 3.18-3.19).
Таким образом, у больных АИТ в стадии эутиреоза имелась прямая зависимость показателей максимальной систолической скорости кровотока в НЩА от степени активности аутоиммунного процесса. Несмотря на то, что при минимальной активности аутоиммунного воспаления наблюдались наи более низкие показатели Vmax в ИЩА, по сравнению со значениями в группах больных АИТ с боле выраженной аутоиммунной активностью, они значимо превышали показатели контрольной группы здоровых лиц и больных ээз.
При других функциональных состояниях ЩЖ наблюдались следующие изменения количественных допплерографических показателей. У больных АИТ с субклиническим гипотиреозом в 10 случаях наблюдалась стадия минимальной активности аутоиммунного процесса, в 15 - стадия умеренной активности и в 15 случаях - стадия активного аутоиммунного воспаления (таблица 3.8). Медиана максимальной систолической скорости кровотока в НЩА у больных АИТ с субклиническим гипотиреозом в стадии минимальной активности аутоиммунного воспаления составляла 0,18 м/сек (2,5П - 0,1; 97,5П - 0,29) и была достоверно ниже медианы V max НЩА контрольной группы здоровых лиц - 0,22 м/сек (2,5П - 0,17; 97,5П - 0,29) и больных ЭЭЗ - 0,22 м/сек (2,5П - 0,14; 97,5П - 0,35) (р 0,05 по критерию Данна). Медиана V max НЩА у больных с умеренной активностью аутоиммунного процесса составила 0,34 м/сек (2,5П - 0,17; 97,5П - 0,83), у больных с активной стадией - 0,4 м/сек (2,5П - 0,16; 97,5П - 0,68), что было значимо выше (р 0,05 по критерию Данна) аналогичных значений у больных АИТ с субклиническим гипотиреозом в стадии минимальной активности аутоиммунного воспаления, контрольной группе здоровых лиц и больных ЭЭЗ (таблица 3.9; рис. 3.17).
При определении индексов пульсативности и резистентности в НЩА у больных АИТ с субклиническим гипотиреозом было выявлено, что указанные показатели не отличались как внутри групп с разной степенью активностью аутоиммунного процесса, так и от значений контрольной группы здоровых лиц и больных ЭЭЗ (таблица 3.9; рис. 3.18-3.19).
Таким образом, у больных АИТ в стадии субклинического гипотиреоза имеется прямая зависимость показателей скорости кровотока в НЩА от степени активности аутоиммунного процесса. На фоне снижения активности аутоиммунного воспаления в ЩЖ наблюдается снижение показателей скорости кровотока в НЩА ниже нормальных значений, характерных для контрольной группы здоровых лиц. Однако при прогрессировании аутоиммунного воспаления, несмотря на снижение функциональной активности ЩЖ, отмечается значимое повышение максимальной систолической скорости кровотока в НЩА, превышающее нормальные значения, с достоверной разницей внутри групп.
Для изучения зависимости количественных показателей кровотока в НЩА у больных АИТ с некомпенсированным гипотиреозом все пациентки (60 человек) были разделены на три группы по уровню аутоантител к тирео-идной пероксидазе: минимальная активность аутоиммунного воспаления - 20 человек, умеренная активность - 20 человек и активная стадия - 20 человек (таблица 3.10).
Медиана V max НЩА у больных АИТ с гипотиреозом в стадии мини 123 мальной активности аутоиммунного воспаления составила 0,13 м/сек (2,5П -0,1; 97,5П - 0,19) и была значимо ниже аналогичного показателя в контрольной группе здоровых лиц - 0,22 м/сек (2,5П - 0,17; 97,5П - 0,29) и больных ЭЭЗ - 0,22 м/сек (2,511 - 0,14; 97,5П - 0,35) (р 0,05 по критерию Данна). Тогда как у больных гипотиреозом с умеренной активностью и с активной стадией аутоиммунного воспаления медианы V max НЩА составили 0,27 м/сек (2,5П - 0,14; 97,5П - 0,60) и 0,29 м/сек (2,5П - 0,21; 97,5П - 0,86) соответственно и были значимо выше показателей контрольной группы здоровых лиц, больных ЭЭЗ и больных АИТ с минимальной активностью аутоиммунного процесса (р 0,05 по критерию Данна) (таблица 3.11; рис. 3.17).
Более того, показатели V max НЩА значимо (р 0,05 по критерию Данна) отличались между группами больных аутоиммунным гипотиреозом с разной активностью аутоиммунного воспаления в ЩЖ. Так медиана V max НЩА имела минимальные значения у больных в стадии минимальной активности аутоиммунного процесса и максимальные значения у больных с активной стадией аутоиммунного процесса (таблица 3.11; рис. 3.17).
Таким образом, у больных АИТ в стадии гипотиреоза имеется четкая зависимость показателей скорости кровотока в НЩА от степени активности аутоиммунного процесса. На фоне снижения активности аутоиммунного воспаления в ЩЖ наблюдается снижение показателей скорости кровотока в НЩА ниже значений, характерных для контрольной группы здоровых лиц и больных ЭЭЗ. Тогда как при прогрессировании аутоиммунного процесса, несмотря на низкую функциональную активность ЩЖ, отмечается значимое повышение максимальной систолической скорости кровотока в НЩА, превышающее нормальные значения, с достоверной разницей внутри групп.
Что касается величины индексов пульсативности и резистентности в сосудах тиреоидной паренхимы и НЩА у больных АИТ с некомпенсированным гипотиреозом, то указанные показатели не отличались как от значений контрольной группы здоровых лиц и больных ЭЭЗ, так и внутри групп больных АИТ с разной активностью аутоиммунного процесса (таблица 3.11; рис. 3.18-3.19).
Описанная выше зависимость V max в НЩА от степени активности аутоиммунного процесса в ЩЖ не наблюдалась в группах больных с субклиническим гипертиреозом и тиреотоксикозом. Это, по-видимому, было обусловлено с одной стороны небольшим числом наблюдений (по 5-Ю человек в каждой группе), а с другой стороны - взаимным усилением влияния двух факторов, определяющих высокие показатели кровотока в НЩА, гиперфункции ЩЖ и активации аутоиммунного воспаления в органе. Так медиана V max в НЩА у больных АИТ с субклиническим гипертиреозом, имеющих концентрацию AT к ТПО ниже 500 МЕ/мл, составила 0,58 м/сек (2,5П - 0,39; 97,5П - 0,88) и статистически не отличалась от аналогичного показателя у больных, имеющих уровень AT к ТПО более 500 МЕ/мл, - 0,59 м/сек (2,5П -0,4; 97,5П - 0,75). Медиана V max в НЩА у больных АИТ с тиреотоксикозом и уровнем AT к ТПО ниже 500 МЕ/мл, составила 0,95 м/сек (2,5П - 0,55; 97,5П - 1,89) и статистически не отличалась от аналогичного показателя у больных, имеющих уровень AT к ТПО более 500 МЕ/мл, - 0,98 м/сек (2,5П -0,54; 97,5П - 1,96) (таблицы 3.12-3.13; рис. 3.17).
При определении индексов пульсативности и резистентности в НЩА у больных АИТ с субклиническим и манифестным гипертиреозом было выявлено, что указанные показатели не отличались как внутри групп с разной степенью активностью аутоиммунного процесса, так и от значений контрольной группы здоровых лиц (таблица 3.13; рис. 3.18-3.19).
Изучение влияния физиологических доз йода на МР-характеристики щитовидной железы у больных аутоиммунным тиреоидитом
Различия в течении АИТ на фоне приема препаратов йода подчеркивают гетерогенность его патогенеза. С этой точки зрения представляет интерес выявление двух типов MP-изменений в группе больных с гипертрофической формой АИТ. Наличие гиперинтенсивных участков в ТІ и Т2 режимах указывает на накопление коллоида в ЩЖ при втором типе гипертрофической формы АИТ, развившемся на фоне ЭЗ. Полученные результаты согласуются с данными морфологов, выделяющих несколько гистологических вариантов АИТ, один из которых определяется как хронический лимфоматозный струмит и характеризуется сочетанием гистологических изменений, свойственных хроническому лимфоцитарному тиреоидиту, с гистологическими изменениями, свойственными эндемическому зобу. Поскольку именно при этом морфологическом варианте заболевания может ожидаться положительный эффект от назначения физиологических доз йода, 5 пациенткам со вторым типом MP-изменений был назначен Иодомарин в дозе 100 мкг в сутки в течение 6 месяцев с последующим проведением МРТ ЩЖ в динамике после завершения курса лечения. При парном сравнительном анализе MP-томограмм после 6 месячного приема физиологических доз йода у всех больных наблюдалась положительная динамика в виде: значительного уменьшения количества или полного исчезновения гиперинтенсивных точечных сигналов на ТІ ВИ и Т2ВИ, обусловленных отложением коллоида, и сокращения объема ЩЖ (рис. 4.20 а, б - 4.21 а, б).
Кроме того на фоне лечения было отмечено достоверное снижение медианы ОИС на Т1ВИ с 1,53 (2,511 - 1,51; 97,5П - 1,54) до 1,39 (2,5П - 1,35; 97,5П - 1,42) и на Т2ВИ с 7,12 (2,5П - 7,02; 97,5П - 7,18) до 6,23 (2,511 - 5,36; 97,5П - 6,70) (р 0,01 по критерию Данна) (таблица 4.7; рис. 4.22).
Однако, снижение после лечения значений медианы СИС на ТІ ВИ с 129,27 (2,5П- 121,76; 97,5П- 139,56), до 119,66 (2,5П - 115,09; 97,5П- 123,61) и на Т2ВИ с 151,62 (2,5П - 145,54; 97,5П - 158,98) до 133,34 (2,5П - 125,84; 97,5П -145,89) было статистически недостоверным (таблица 4.7; рис. 4.23).
Отмечалось статистически значимое уменьшение объема ШЖ, определявшегося как методом МРТ с 28,62 мл (2,5П - 21,02; 97,5П - 39,81) до 18,09 мл (2,5П - 15,36; 97,5П -20,45), так и методом УЗИ с 20,64 мл (2,5П - 17,01; 97,5П - 26,11) до 18,09 мл (2,5П - 15,36; 97,5П - 20,45) (р 0,01 по критерию Данна) (таблица 4.7; рис. 4.24).
На фоне шестимесячного приема физиологических доз препаратов йода было отмечено статистически достоверное (р 0,05 по критерию Данна) снижение медианы содержания ТТГ в плазме с 2,9 мкМЕ/мл (2,5П - 2,72; 97,5П -3,29) до 2,3 мкМЕ/мл (2,5П - 1,75; 97,5П - 2,64), не выходившее за пределы референсных значений нормы. Статистически значимых различий между показателями концентрации Св. Т4, AT к ТПО и AT к ТГ в сыворотке крови больных АИТ до и после приема препаратов йода не наблюдалось (таблица больных АИТ до и после приема препаратов йода не наблюдалось (таблица 4.8).
Таким образом, длительное назначение физиологических доз препаратов йода больным АИТ с наличием коллоидных кист в ЩЖ по данным МРТ не привело к ухудшению течения аутоиммунного процесса, что подтверждалось отсутствием отрицательной динамики в содержании AT к ТПО и AT к ТГ в плазме, объема ЩЖ и ее функционального состояния. Напротив шестимесячный прием 100 мкг йода в сутки сопровождался значительным уменьшением или полным исчезновением гиперинтенсивных точечных сигналов на ТІ ВИ и Т2ВИ, обусловленных отложением коллоида, и статистически значимым снижением ОИС тиреоидной ткани в ТІ и Т2 последовательное-тях, что указывало на снижение степени выраженности воспалительного отека тиреоидной паренхимы. Наличие положительной динамики величины ОИС, размеров щитовидной железы и концентрации ТТГ в сыворотке крови у больных со вторым типом гипертрофической формы АИТ, которая наблюдалась на фоне приема физиологических доз йода, является доказательством гетерогенности заболевания и безопасности применения физиологических доз йода у этой группы больных АИТ.
Результаты исследования каталитических свойств антител к нативной ДНК, выделенных из сыворотки крови больных аутоиммунным тиреоидитом, методом атомно-силовой микроскопии
Для оценки каталитической активности сывороток крови больных АИТ и антител, выделенных из сыворотки крови больных АИТ, использовали два вида субстрата: плазмидную ДНК pBR-322 и хромосомную ДНК эритроцитов цыплят. Продукты реакции гидролиза регистрировали двумя методами: методом электрофореза в агарозном геле и методом атомно-силовой микроскопии (АСМ).
Методом электрофореза в агарозном геле была проведена оценка способности сывороток крови больных АИТ гидролизовать суперскрученную плазмидную ДНК pBR-322. О наличии ДНК-гидролизующей активности судили по переходу суперскрученной плазмидной ДНК (I форма) во II форму (кольцевая, открытая молекула) и в III форму (линейная молекула). Для исключения возможного влияния сывороточных ДНК-аз на превращение суперскрученной плазмидной ДНК pBR 322 в открытые формы, сыворотки крови больных СКВ, АИТ и здоровых доноров подвергались предварительному прогреванию при +56С в течение 40 минут. После прогревания сыворотки крови здоровых доноров утрачивали способность превращать суперскрученную форму плазмидной ДНК pBR 322 в открытые формы, тогда как сыворотки больных СКВ и АИТ, сохраняли ДНК-гидролизующую способность (таблица 5.5, рис. 5.18). Поскольку методом электрофореза было показано отсутствие ДНК-гидролизующей активности сывороток крови здоровых лиц (отрицательный контроль), дальнейшее изучение каталитических свойств указанных препаратов методом АСМ не проводилось.
Методом АСМ была проведена оценка способности AT к нДНК, выделенных из сыворотки крови больных АИТ, гидролизовать хромосомную ДНК эритроцитов цыплят. Электрофорез в Ds-Na-ПААГ показал, что AT к нДНК, выделенные из сыворотки крови больных АИТ методом аффинной хромато графии на ДНК-целлюлозе, представляют собой IgG с молекулярной массой 150 кДа. При проведении ИФА выделенные AT класса IgG взаимодействовали с нДНК и их содержание в препарате составило 12 МЕ/мл. В сыворотке крови больных СКВ - положительный контроль, их концентрация составляла 49 МЕ/мл, в группе отрицательного контроля - 4 МЕ/мл.
Методом АСМ были получены изображения AT класса IgG, выделенных из сыворотки крови больных АИТ (рис. 5.19 а). Молекулы AT класса IgG имели овальную форму с диаметром от 9,8 до 24,4 нм и высотой от 0,77 до 1,6 нм со средним значением 1,1 нм. Были получены АСМ-изображения контрольных препаратов молекул нДНК эритроцитов цыплят (рис. 5.19 б). Ширина фрагментов молекул нДНК эритроцитов цыплят на АСМ-изображениях варьировала от 9,8 до 20,2 нм со средним значением 15,3 нм, а высота - от 0,38 до 1,05 нм со средним значением 0,71 нм.
Для оценки каталитической активности AT к нДНК, выделенные из сыворотки крови больных АИТ, инкубировались с нДНК эритроцитов цыплят при +37С в течение 18 часов. Поскольку ферментативную реакцию вели в течение нескольких часов, то для исключения возможного влияния процесса инкубации на изменение длинны молекул хромосомной ДНК, не связанное со специфической ферментативной реакцией гидролиза фосфодиэфирных связей, методом АСМ было исследовано два контрольных препарата, содержавшие субстрат - молекулы хромосомной ДНК и активатор ферментативной реакции - ионы Mg . Один из которых инкубировали при +37 С в течение 18 часов (контроль №1), а другой не подвергался инкубации (контроль №2). Медиана длинны молекул хромосомной ДНК эритроцитов цыплят в контрольном препарате №2, не подвергавшемся инкубации, составила 806,0 нм (2,5П - 172,45; 97,5П - 1941,5), а в контрольном препарате №1, который подвергался инкубации - 665,75 нм (2,5 П - 124,43; 97,5 П - 1987,66). Статистически значимых различий между контрольными образцами нДНК выявлено не было, что указывало на отсутствие влияния температуры и инкубации на неспецифическое расщепление молекулы ДНК (рис. 5.20).
При исследовании взаимодействия AT класса IgG, выделенных из сыворотки крови больных АИТ, с нДНК эритроцитов цыплят было обнаружено появление низкомолекулярных фрагментов ДНК по сравнению с контрольными образцами. Так, после инкубации нДНК эритроцитов цыплят с выделенными антителами медиана длины молекул нДНК значимо уменьшилась с 806,0 нм (2,5П - 172,45; 97,5П - 1941,5) до 295,15 нм (2,5П - 102,25 ; 97,5 П -1171,27) (р 0,05 по критерию Данна), что свидетельствовало о гидролизую-щем характере действия указанных антител на молекулы ДНК (рис. 5.20).
Методом АСМ было показано, что после остановки реакции AT класса IgG располагаются на концах коротких и средних по длине молекул ДНК или в центре длинных и средних по длине молекул ДНК (рис. 5.21). Причем количество коротких фрагментов ДНК повышается по мере увеличения продолжительности реакции. Участки локализации указанных AT на молекулах нДНК эритроцитов цыплят характеризовались более крупными размерами, чем свободные молекулы AT класса IgG и молекулы ДНК. Диаметр участков взаимодействия ДНК - ДНК-гидролизующее AT составлял от 11,4 до 39,7 нм, высота - от 0,47 до 1,9 нм. Необходимо отметить, что образовавшиеся иммунные комплексы AT-ДНК отличались высокой стабильностью, то есть после осуществления реакции гидролиза фосфодиэфирной связи не происходило освобождения AT от молекулы ДНК, что указывает на непроцессивный механизм действия AT к нДНК, полученных от больных АИТ.
Таким образом, методом АСМ получены изображения комплексов ДНК - ДНК-гидролизующее антитело к нативнои ДНК с нанометровым разрешением. Установлено наличие ДНКазной активности у AT к нДНК, выделенных из сыворотки крови больных АИТ, и показано, что для ДНКазной активности антител к нативнои ДНК характерен непроцессивный механизм действия.
