Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 11
1.1. Метод спиновых ловушек 11
1.1.1. Свободные радикалы 11
1.1.2. Метод ЭПР спиновых ловушек 18
1.1.3. Метод ЯМР спиновых ловушек 24
1.2. Комплексы «гость-хозяин» с различными супрамолекулами 27
1.2.1. Циклодекстрины и их комплексы 27
1.2.2. Каликсарены и их комплексы 35
1.2.3. Кукурбитурилы и их комплексы 37
1.3. Подвижность нитроксильных радикалов при ограниченном движении 39
Постановка задачи 43
Глава 2. Исследование механизма реакции глутатипльного радикала и спиновой ловушки ФБН 45
Введение 45
2.1. Экспериментальна часть 45
2.2. Результаты и обсуждение 47
2.1.1. Измерение скорости захвата тиильного радикала 47
2.2.2. Механизм гибели радикального аддукта 51
2.2.3. Измерение константы скорости реакции с тиильным радикалом конкурентным методом 55
2.2.4. Исследование механизма гибели ФБН/GS* и фтор-ФБН /GS* методом ЯМР-спектроскопии 60
2.5.5. Нерадикальное присоединение восстановленного глутатиона к ФБН 65
2.3. Заключение 68
Глава 3. Влияние р-циклодекстрииов на реакцию спинового захвата тиильного радикала ловушкой ФБН 69
Введение 69
3.1. Экспериментальная часть 69
3.2. Результаты и их обсуждение 70
3.2.1. Измерение константы скорости захвата тиильного радикала в присутствии В-циклодекстринов 70
3.2.2. ЭПР спектры аддукта и кинетический анализ 73
3.2.3. Спектры ЭПР и кинетики гибели аддуктов ФБН, ковалентно связанного с р- циклодекстринами 76
3.2.4. Измерение константы скорости реакции глутатиильньгх радикалов с ФБН, коваленто связанным с р-цикл о декстринами 79
3.3. Заключение 81
Глава 4. Структура нитроксильного радикала TIPNO, ковалентно связанного с Р- циклодекстрином 82
Введение 82
4.1. Экспериментальная часть 82
4.2. Результаты 83
4.2.1. Исследование методом ЭПР W-диапазона 84
4.2.2. Конкурентные эксперименты с применением ЯМР 86
4.2.3. Конкурентные эксперименты с применением ЭПР 91
4.3. Обсуждение результатов 92
4.4. Заключение 93
Глава 5. Изучение комплексов нитроксильных радикалов с каликсаренами и кукурбитурилами 94
Введение 94
5.1. Экспериментальная часть 94
5.2. Результаты и их обсуждение 95
5.2.1. Структура комплекса 4-метокси-ТЕМПО с каликсаренами 95
5.2.2. Исследование комплекса методом ЭПР в различных частотных диапазонах.. 99
5.2.3. Подвижность и динамика радикалов, помещенных в каликсарены 104
5.2.4. Устойчивость инкапсулированных нитроксильных радикалов к
восстановлению аскорбиновой кислотой 111
5.2.5. Комплексы нитроксильного радикала DEPN с каликсаренами 114
5.2.6. Комплексы нитроксильных радикалов с кукурбит[7]урилом 119
5.3. Заключение 122
Результаты и выводы 123
Благодарности 124
Список литературы
- Комплексы «гость-хозяин» с различными супрамолекулами
- Измерение константы скорости реакции с тиильным радикалом конкурентным методом
- Измерение константы скорости захвата тиильного радикала в присутствии В-циклодекстринов
- Конкурентные эксперименты с применением ЯМР
Введение к работе
Исследования последнего десятилетия указывают на то, что свободные короткоживущие радикалы принимают участие в различных физиологических и патологических процессах в живых организмах. Показано, что микробицидная функция фагоцитов, осуществляющих защиту организма от бактериальных инфекций, во многом зависит от способности клеток вырабатывать супероксидный радикал. Однако высокий уровень генерации реактивных форм кислорода клетками может вызвать повреждение клеток и тканей организма. Генерация кислородных радикалов приводит к окислительному повреждению биомолекул, к нарушению функций биомембран, повреждению ДНК, и в итоге к развитию патологий и старению. Неспаренный электрон может быть локализован не только на атомах кислорода, но и на атомах углерода, серы, азота. Для живых организмов большое значение имеют тиильные радикалы глутатиона (GS") и радикалы мочевой кислоты с локализацией электрона на атомах серы и азота. Основным источником супероксидного радикала (Ог*") в биологических системах являются ферментативные системы, такие как митохондриальная цепь переноса электронов и фотосинтезирующая система хлоропластов растительных клеток, и ксантиноксидаза. Тиильные радикалы могут образовываться из глутатиона (GSH), при реакции глутатиона с различными реакционными частицами. С реакциями, инициируемыми в живых организмах этими радикалами, связывают такие важные биологические процессы как окислительный стресс, ишемию и т.д. Типичные времена жизни таких радикалов лежат в диапазоне времен 10"9-10"6 секунд. Вследствие высокой реакционной активности, стационарные концентрации таких радикалов низки, что затрудняет, а часто делает невозможным их непосредственное детектирование методами лазерного импульсного фотолиза или методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР).
В качестве метода детектирования короткоживущих радикалов часто используется метод ЭПР спиновых ловушек, основанный на реакции спиновых ловушек (как правило, нитронов) с короткоживущими радикалами с образованием относительно стабильных спиновых аддуктов, времена жизни которых лежат в диапазоне 1-10 секунд. Наиболее важными характеристиками спиновых ловушек являются — скорость реакции нитрона с короткоживущими радикалами, времена жизни образующихся спиновых аддуктов и различие спектров ЭПР в зависимости от захваченного короткоживущего радикала. Кроме
того, для корректной интерпретации полученных результатов необходимо знание механизмов реакций короткоживущих радикалов со спиновыми ловушками. В некоторых случаях наличие нерадикального присоединения по двойной связи нитронов по механизму Форрестера-Хэпбурна и последующее окисление продукта может приводить к неверным выводам о наличии короткоживущих радикалов в системе. Поэтому исследование механизмов реакций короткоживущих радикалов с нитронами, а также измерение констант скоростей реакций присоединения короткоживущих радикалов к нитронам и констант гибели соответствующих спиновых аддуктов является востребованной и актуальной задачей.
Нитроксильные радикалы широко используются в качестве рН-чувствительных зондов, зондов и спиновых меток для определения полярности и вязкости среды, в качестве медиаторов радикальной полимеризации, зондов на оксид азота, для измерения концентрации кислорода, в медицинской диагностике заболеваний с помощью ЭПР-томографии, в качестве контрастных агентов в ЯМР-томографии.
Проблемой применения нитроксильных радикалов в качестве спиновых меток и зондов, и нитронов в качестве спиновых ловушек in vivo, является быстрое восстановление нитроксилов и спиновых аддуктов до диамагнитных соединений, которые невозможно регистрировать методом ЭПР. Основной реакцией, приводящей к короткому времени жизни спиновых аддуктов и нитроксильных радикалов в живых системах, является их восстановление до гидроксиламинов. Для уменьшения роли этой реакции и получения новых, более эффективных, спиновых ловушек и нитроксильных радикалов применяются два подхода. Это разработка новых стерически-затрудненных нитронов или нитроксильных радикалов, с низкой скоростью восстановления. Другой подход заключается в синтезе спиновых ловушек на основе комплексов нитронов с различными макромолекулами или применение инкапсулирования спиновых ловушек и нитроксильных радикалов в супрамолекулы, такие как полисомы, циклодекстрины, каликсарены и др. Заключение нитроксильных радикалов в различные нанокапсулы или макромолекулы приводит к повышению стабильности радикалов по отношению к восстановлению различными биологическими восстановителями. Функциональные свойства инкапсулированных нитроксильных радикалов зависят от подвижности нитроксилов в капсулах и константы равновесия образования комплекса с нанокапсулами. В литературе имеются данные об исследовании комплексов некоторых нитроксильных радикалов с каликсаренами и кукурбитурилами и нитроксильных радикалов, ковалентно связанных с циклодекстринами в растворах. Однако данные об исследовании комплексов
«гость-хозяин» нитроксильных радикалов с супрамолекулами в твердой фазе и информация о подвижности нитроксилов в комплексах отсутствуют. Исследование комплексов нитроксилов с циклодекстринами, каликсаренами и кукурбитурилами в твердой фазе позволяет получить информацию о подвижности нитроксильных радикалов и поэтому является практически важным и актуальным.
В настоящей работе методами ЭПР, ЯМР и лазерного импульсного фотолиза исследован механизм реакции глутатиильного радикала с широко применяемой спиновой ловушкой ФБН, изучено влияние циклодекстринов различного строения на время жизни спинового аддукта глутатиильного радикала с ФБН. Кроме того, исследовано влияние инкапсулирования некоторых нитроксильных радикалов и спиновой ловушки ФБН на их функциональные свойства.
Целями настоящей работы были:
Установление механизма реакции спиновой ловушки фенил-И-третбутилнитрон (ФБН) и ее фторированного аналога с тиильным радикалом глутатиона, в том числе механизма реакции нерадикального присоединения восстановленного глутатиона к фенил->Т-третбутилнитрону, получение констант скорости захвата радикала глутатиона спиновой ловушкой ФБН и измерение времени жизни соответствующего спинового аддукта.
Установление влияния циклодекстринов на эффективность детектирования глутатиильного радикала спиновой ловушкой ФБН методом ЭПР.
Определение структуры комплексов нитроксильных радикалов, ковалентно-связанных с циклодекстринами, и свойств комплексов нитроксильных радикалов с каликсаренами и кукурбитурилами.
Научная новизна работы.
Впервые показана обратимость реакции широко используемой ловушки фенил-N-третбутилнитрон с тиильным радикалом глутатиона. Измерены константа скорости реакции ФБН с глутатиильным радикалом, и время жизни соответствующего спинового аддукта. Показано, что осуществляется реакция нерадикального присоединения восстановленного глутатиона к ФБН.
Показано, что образование комплексов р-циклодекстринов с ловушкой ФБН позволяет увеличить эффективность детектирования тиильных радикалов. ФБН, ковалентно связанный с различными циклодекстринами, был впервые применен для
детектирования тиильных радикалов, измерена константа скорости реакции ловушки ФБН, ковалентно связанного с р-циклодекстринами, с тиильными радикалами. Показано, что ФБН, ковалентно связанный с циклодекстрином, является более эффективной ловушкой для детектирования тиильных радикалов методом ЭПР по сравнению с ФБН.
Применение комбинации различных магнитно-резонансных методов - ЭПР Х- и W-диапазонов, Н ЯМР спектроскопии позволило исследовать структуру нитроксильного радикала 1,1-диметилэтил 2-метил-1-фенилпропил нитроксила (TIPNO), ковалентно связного с метилированным Р-циклодекстрином. Показано, что для данного нитроксила наблюдается равновесие между комплексом с радикальным фрагментом, расположенным вне полости и радикальным фрагментом, прикрывающим полость циклодекстрина.
Изучены спектроскопические свойства комплексов нитроксильных радикалов 4-метокси-ТЕМПО и М-(2-метилпропил)-1Ч-(1-диэтил фосфоно-2,2-диметилпропил)-аминоксила (DEPN) с пара-гексаноил-каликс[4]аренами и кукурбит[7]урилом в твердой фазе, исследована подвижность этих радикалов в нанокапсулах. Показано, что пара-гексаноил-каликс[4]арены эффективно предохраняют заключенные в них нитроксильные радикалы от восстановления аскорбиновой кислотой.
Практическая ценность работы.
Измеренные в работе константы скоростей реакции глутатиильного радикала с ФБН и с фторированным ФБН и времена гибели соответствующих радикальных аддуктов, а также показанное в работе наличие реакции нерадикального присоединения восстановленного глутатиона к ФБН могут быть применены при анализе результатов экспериментов по детектированию S-центрированных радикалов с применением ловушки ФБН в различных биологических системах. В работе показано, что применение циклодекстринов увеличивает эффективность спиновых ловушек при детектировании глутатиильных радикалов. Этот подход может быть применен для увеличения чувствительности метода ЭПР спиновых ловушек. Полученные в работе результаты показывают, что инкапсулировагоіе нитроксильных радикалов в каликсарены увеличивает стабильность нитроксильных радикалов относительно восстановления аскорбиновой кислотой, что может быть использовано для улучшения свойств функциональных нитроксильных радикалов.
Объем и структура работы.
В первой главе представленной диссертации приведен литературный обзор, касающийся метода спиновых ловушек и его применения, комплексов «гость-хозяин» различных молекул с циклодекстринами, каликсаренами, кукурбитурилами, и подходов к описанию подвижности нитроксильных радикалов при их ограниченном движении.
Вторая глава посвящена исследованию механизма реакции спиновой ловушки фенил-М-третбутилнитрона (ФБН) и его фторированного аналога с тиильным радикалом глутатиона. Измерены константы скорости реакции тиильного радикала с ФБН и фторированным ФБН, показана обратимость этой реакции. Получены константы скорости гибели аддуктов ФБН/тиильный радикал и фторированный ФБН/тиильный радикал. Кроме того, показано наличие реакции нерадикального присоединения восстановленного глутатиона (GSH) к ловушкам ФБН и фторированному ФБН с образованием стабильных гидрокси ламинов.
В третьей главе представлены результаты исследования влияния метилированных Р-циклодекстринов на реакцию ФБН и тиильного радикала, а именно на константу скорости реакции и стабильность образующихся спиновых аддуктов. Нитрон ФБН, ковалентно-связанный с р-циклодекстринами различного строения, был впервые применен для детектирования глутатиильного радикала. Показано, что для ФБН в присутствии Р-циклодекстринов и ФБН, ковалентно-связанного с Р-циклодекстрином, несущественно изменяется константа скорости реакции ФБН с короткоживущим радикалом. При этом время жизни спинового аддукта увеличивается в несколько раз.
Четвертая глава диссертации посвящена изучению структуры нитроксильного радикала 1,1-диметилэтил 2-метил-1-фенилпропил нитроксил (TIPNO), ковалентно-связанного с триметилированным р-циклодекстрином. Показано, что для данного нитроксила характерно равновесие между двумя формами, т.е. комплексом с радикальным фрагментом, расположенным вне полости и радикальным фрагментом, прикрывающим полость циклодекстрина.
В пятой главе представлены результаты исследования комплексов нитроксильных радикалов с пара-гексаноил-каликс[4]аренами и кукурбит[7]урилом в твердой фазе. Методом ЭПР различных частотных диапазонов изучена подвижность нитроксильных радикалов в нанокапсулах на основе каликсаренов и кукур[7]битурилов.
В конце диссертации приведены основные результаты и выводы, и список литературы.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей в рецензируемых научных международных журналах, рекомендованных ВАК и 23 тезиса докладов конференций. Список статей:
Polovyanenko, D.N., Marque, S.R.A., Lambert, S., Jicsinszky, L., Plyusnin, V.F., Bagryanskaya, E.G. "EPR spin trapping of gluthathiyl radicals by PBN in the presence of p-cyclodextrins and by PBN attached to p-cyclodextrin", J. Phys. Chem. В., 2008, 112 (41),13157-13162.
Polovyanenko, D.N., Bagryanskaya, E.G., Schnegg, A., Mobius, K., Coleman, A.W., Ananchenko, G.S., Udachin, K.A., Ripmeester, J.A. "Inclusion of 4-methoxy-2,2,6,6-tetrarnethylpiperidine-N-oxyl in a calixarene nanocapsule in the solid state", Phys. Chem. Chem. Phys., 2008, 10, 1-9.
Bagryanskaya, E.G., Bardelang, D., Chenesseau S., Finet, J.-P., Jicsinszky, L., Karoui, H., Marque, S. R. A., Mobius, K., Polovyanenko, D.N., Savitsky, A., Tordo, P. " EPR, NMR, and Thermodynamic Evidences for Forced Nuclear Spin - Electron Spin Interactions in the Case of l-Phenyl-2-methylpropyl-l,l-dimethyI-2-nitroxide (TIPNO) Appended Permethylated P-Cyclodextrin", Applied Magnetic Resonance, 2009, 36 (1).
Polovyanenko, D.N., Plyusnin, V.F., Reznikov, V.A., Khramtsov, V.V., Bagryanskaya, E.G. "Mechanistic studies of the reactions of nitrone spin trap PBN with glutathiyl radical", 2008, J. Phys. Chem. B, 112 (15), 4841-4847.
Ananchenko, G.S., Udachin, K.A., Coleman, A.W., Polovyanenko, D.N., Bagryanskaya, E.G., Ripmeester, J. A. "Crystalline inclusion complex of a calixarene with a nitroxide", Chem. Comm., 2008, 223-225.
Апробация работы. Основные результаты работы представлены на следующих конференциях:
1. 5th International Conference on Nitroxide Radicals SPIN 2008, 7-11 сентября 2008 г.,
Анкона, Италия.
3rd Annual Research Day, сентябрь 2008 г., Госуниверситет штата Огайо, США.
XXIIIrd International Conference on Magnetic Resonanse in Biological Systems, 24-29
августа 2008 г., Сан-Диего, Калифорния, США.
6th Asia Pacific EPR Society - EPR Symposium 2008 (APES 2008), 13-18 июля 2008 г., Каине, Австралия.
EUROMAR 2008 Magnetic Resonance for the Future, 4-11 июля 20 08 г., Санкт-Петербург, Россия.
SFRR-Europe Meeting 2008 "Free Radicals and Nutrition: Basic Mechanisms and
Clinical Apllication", 5-9 июля 2008 г., Берлин, Германия.
7. GIRSE-ARPE first join meeting (GIRSE07), 30 сентября - 03 октября 2007 г.,
Наполи, Италия.
International conference Modern development of magnetic resonance, 24-29 сентября 2007 г., Казань, Россия.
90th Canadian Chemistry Conference and Exhibition (CSC2007), 26-30 мая 2007 г., Винипег, Канада.
10. The 40th Annual International Meeting ESR Group Royal Society of Chemistry, 25-29
марта 2007 г., Оксфорд, Великобритания.
National Symposium on Biophysics: Trends in Biomedical Research, 13-15 февраля, 2007, Нью-Дели, Индия.
13th Biennial Congress Society for Free Radical Research - International, 15-19 августа, 2006 г., Давос, Швейцария.
The 5th Asia-Pacific EPR/ESR Symposium 2006, 24-27 августа 2006 г., Новосибирск, Россия.
Sendai-Berlin-Novosibirsk Seminar on Advanced EPR 2006, 28-31 августа 2006 г., Новосибирск, Россия.
AMPERE NMR SCHOOL, 22 июня - 01 июля 2006 г., Познань/В ерзба, Польша.
The 39th Annual International Meeting Electron Spin Resonance Group of the Royal Society of Chemistry "Advanced Techniques and Applications of EPR", 2-5 апреля 2006 г., Эдинбург, Великобритания.
17. The 4th International Conference on Nitroxide Radicals: Synthesis, Properties and
Implications of Nitroxides (SPIN-2005), 20-24 сентября 2005 г., Академгородок,
Новосибирск, Россия.
18. International Symposium and Summer School in Saint Petersburg "Nuclear Magnetic
Resonance in Condensed Matter", 11-15 июля 2005 г., Санкт-Петербург, Россия.
Комплексы «гость-хозяин» с различными супрамолекулами
Первое сообщение о циклодекстринах датируется 1891 годом, когда Вилиерс впервые получил а-и Р- ц иклодекстрины [111]. 1930-1970 годы относятся к периоду систематического исследования свойств и комплексов циклодекстринов [112]. Основные результаты исследований представлены в обзорах Д. Френча [113], Сома и Стюарта [114], Цезаря [115]. Третий период с 1970 года по настоящее время связан с производством циклодекстринов в промышленных масштабах и их активным применением в различных областях науки. Помимо традиционных а-, р- и у- циклодекстринов были получены и охарактеризованы большие циклодекстрины, состоящие из девяти (5-циклодекстрин) и десяти глюкозидных колец. Оказалось, что для ряда молекул повышение размера циклодекстрина не способствует увеличению равновесной константы комплексообразования [112]. Р-циклодекстрин обладает наибольшими константами комплексообразования, а последующее увеличение размера начиная с у- вплоть до 9-циклодекстрина не приводит к увеличению констант комплексообразования для различных кислот. Это связано не только с неподходящими (большими) размерами циклодекстринов, но и с их нецилиндической структурой. Предполагается, что формирование внутримолекулярных водородных связей между ОН группами и атомами водорода молекулы приводит к образованию структур, аналогичных представленной на рисунке 1.7.
В настоящее время циклодекстрины и их производные активно исследуются и широко используются в фармацевтике, пищевой и химической промышленности [116.-118]. Комплексы цикло декстринов
Имеется множество сообщений, касающихся исследований свойств и строения комплексов с цикло декстринами в твердой фазе [119]. В ряде работ бьши исследованы комплексы молекул, содержащих атомы переходных металлов и наночастиц золота с различными модифицированными циклодекстринами [120]. Также активно изучаются комплексы циклодекстринов с различными молекулами в растворе [121], в том числе с нитронными спиновыми ловушками. Одним из методов изучения процесса комплексообразования молекул с циклодекстринами является конкурентный метод. В рамках данного метода помимо изучаемой молекулы добавляются молекулы-конкуренты с известной константой комплексообразования. Широко используемыми молекулами-конкурентами являются 1-адамантанол и его производные и метиловый оранжевый. Равновесная константа комплексообразования для указанных молекул с Р-циклодекстринами лежит в пределах К 10 -10 М" [121]. Процесс комплексообразования обычно исследуется различными модификациями двумерного ЯМР. Образования комплекса и, как следствие, взаимодействие гостя с атомами водорода полости циклодекстрина приводит к изменению химического сдвига атомов водорода гостя и циклодекстрина [122]. Далее проводят титрование и получают зависимость изменения химического сдвига от концентрации гостя. Это позволяет получить данные о стехиометрии комплексов и константе комплексообразования.
Работа [123] посвящена изучению комплексов большого числа аналогов спиновой ловушки ФБН с Р-цикл о декстрином. Конечной целью подобных исследований является получение более эффективных спиновых ловушек по сравнению с существующими. Для определения оптимальной пары гость - хозяин необходимо рассмотреть следующие вопросы: (і) какие структурные особенности спиновых ловушек способствуют образованию комплексов; (ii) какова стехиометрия образующихся комплексов нитрон-циклодекстрин; (Ш) протекает ли реакция нитрона с короткоживущим радикалом внутри или вне полости циклодекстрина; (iv) каковы величины константы комплексообразования нитрона и спинового аддукта с циклодекстрином; (v) какова структура комплекса. Чтобы ответить на часть вопросов, авторами бьши синтезированы производные ловушки ФБН, отличающиеся различными заместителями в фенильном кольце и метильных группах (рисунок 1.8). R2 R3 If -ОН R = Н, Me, ОМе, Et, i-Pr, t-Bu, Ph, CI, N 1 1 Методами Ни С ЛМР для нитронов были получены кривые титрования, а именно зависимости изменения химического сдвига атомов водорода ловушки и полости циклодекстрина от концентрации гостя. Были получены равновесные константы комплексообразования нитронов с р-циклодекстрином ф-CD) и стехиометрия комплексов (1:1). Наибольшая константа комплексообразования наблюдается для нитрона с этильным заместителем (4-Et-OBH(OH), Ri=Et, R2=R3=H), 988-1162 М 1. Это связано со стерическими затруднениями и гидрофобностыо, определяемыми заместителями. Для нитрона с наиболее гидрофобным этильным заместителем (Et) наблюдается более глубокое погружение в полость циклодекстрина и наибольшая константа комплексообразования. Константа комплексообразования убывает в ряду заместителей Ri: Н Me Et. Для ловушек с различной полярностью группы с заместителями, которая возрастает в ряду ФБН ФБН(ОН) ФБН(сІіОН) ФБЩггЮН), константа комплексообразования ведет себя аналогичным образом. По результатам применения 2-х мерной ЯМР спектроскопии ROISY для 4-Е1-ФБН(0Н) показано глубокое погружение нитрона в полость циклодекстрина с образование двух типов комплексов. Комплексы отличаются расположением молекулы в полости.
Были также изучены комплексы некоторых производных ФБН (аналогичных представленным на рисунке 1.8, Ri=H, Me, Et и R2=R3=H, ОН) с различными метилированными циклодекстринами, а именно метилированным произвольным образом (RAMEB) и диметилированным (DIMEB) циклодекстрином [124]. Как и в случае неметилированного р-циклодекстрина, константа комплексообразования с RAMEB и DIMEB убывает в ряду ФБН(ОН) 4-Ме-ФБН(0Н) 4-Еі-ФБН(0Н).
Измерение константы скорости реакции с тиильным радикалом конкурентным методом
В результате моделирования спектра и интегрирования отдельных линий спектра было получено соотношение для квазистационарных адцуктов, равное 1.1±0.2, при концентрации ловушек ДМПО/ФБНRIMEB 3:30 мМ. Для обоих адцуктов наблюдается гибель в реакциях первого порядка, поэтому для получения интересующей константы скорости справедливо выражение (20), глава 2. В процессе измерения ЭПР спектра (10 с.) концентрации ловушек изменялись незначительно (менее 3 %), поэтому их концентрации были приняты равными начальным. Для ловушки ДМПО были использованы следующие величины: константа скорости захвата GS радикала кдмпсГ (1.1+0.5)-108 M V1 и константа скорости гибели аддукта / =(0.14+0.04) с"1 (глава 2).
Наблюдаемая константа скорости гибели аддукта ФБНRIMEB/GS зависит от начальных концентраций GSNO и ловушки согласно выражению 19, глава 2. В предположении близкого значения константы скорости захвата GS к ФБН для ФБНRIMEB можно оценить константу скорости реакции гибели ФБНRIMEB/GS через отношение наблюдаемых в эксперименте констант скоростей гибели {кі"абл) как:
Исходя из полученного соотношения для квазистационарных концентраций двух аддуктов и начальных концентраций ловушек и GSNO, константа скорости реакции GS радикала с ФБНRIMEB оказалась равной кФБн-тшмЕв:= (5.1±1.4)х 107М"1с"1. Эта величина близка к константе скорости реакции GS радикала с ФБН кфвн= (6.7±1.5)х107 К/Г с"1, измеренной методом лазерного импульсного фотолиза (глава 2). Близкие величины кфвн можно получить и непосредственно как решение системы из двух уравнений, одно из которых это зависимость наблюдаемой константы скорости гибели ФБН/GS от концентрации ФБН и GSNO (глава 2, выражение 19) и выражение для константы кфБн (глава 2, выражение 20).
Как следует из проведенных экспериментов, присутствие метилированных р-циклодекстринов или использование ФБН, ковалентно связанного с циклодекстринами, способствует повышению эффективности детектирования тиильных радикалов глутатиона. Так, в присутствии циклодекстринов несущественно изменяется константа скорости реакции ловушки ФБН с тиильным радикалом, а время жизни спинового адцукта увеличивается в несколько раз. Добавление метилированного произвольным образом и диметилированного циклодекстрина приводит к увеличению времени жизни ФБН/GS в 5.5 и 6.9 раза, соответственно. Нами впервые был использован ФБН, ковалентно связанный с различными 3-циклодекстринами, для детектирования глутатиильного радикала. Для ФБН, ковалентно связанного с триметилированным циклодекстрином, была получена константа скорости реакции с тиильным радикалом ((5.1±1.4)х107 M V1), которая оказалась близкой к аналогичной константе скорости для ФБН. Методом ЭПР были получены кинетические кривые гибели аддуктов для ловушек ФБН-DIMEB и ФБНRIMEB. Показано, что время жизни аддуктов для ФБН-DIMEB и ФБНRIMEB соответственно в 5 и 2.4 раза больше, чем для адцукта ФБН. Такми образом при близкой к значению для ФБН константе скорости реакции с короткоживущих радикалом, время жизни аддуктов для ФБН, связанного с циклодектсрином, существенно выше чем для ФБН. Поэтому нитроны, ковалентно связанные с циклодекстринами, являются перспективными эффективными спиновыми ловушеками для детектирования различных биологически важных короткоживущих радикалов, в том числе для использования in vivo.
Ранее было показано, что использование циклодекстринов позволяет существенно повысить эффективность регистрации короткоживущих радикалов методом ЭПР спиновых ловушек (глава 3). Добавление циклодекстринов способствует увеличению времени жизни образующихся радикальных аддуктов, что упрощает и делает более эффективным их детектирование методом ЭПР. При этом механизм повышения стабильности аддукта для ФБН, ковалентно связанного с циклодекстрином, как и структура соответствующего аддукта, остаются неизученными. Исследование структуры аддукта для ФБН-циклодекстрина методом ЭПР возможно лишь в замороженном растворе. Альтернативным методом является изучение радикального аналога спинового аддукта ФБН-циклодекстрина с короткоживущим радикалом. Аналогом спинового аддукта ФБН-циклодекстрина и тиильного радикала, является нитроксильный радика л 1,1-диметилэтил 2-метил-1-фенилпропил нитроксил, ковалентно связанный с триметилированным циклодекстрином (TIPNORIMEB). Данная глава посвящена исследованию структуры TIPNORIMEB методами ЯМР и ЭПР различных частотных диапазонов [199].
Молекула TIPNORIMEB была синтезирована в Прованском университете г. Марселя, в группе UMR 6264 проф. П. Тордо согласно описанной ранее методике [140]. (2,3,6-три-0-метил)-Р-циклодекстрин (TRIMEB) использовался производства Fluka. 2,2,6,6-тетраметил-пиперидин-№оксил (ТЕМПО), Метиловый Оранжевый, 1-адамантанол, 1-адамантиламин, дейтерированная вода (D2O) использовались производства Sigma-Aldrich без какой-либо дополнительной очистки.
Измерение константы скорости захвата тиильного радикала в присутствии В-циклодекстринов
Как уже указывалось выше, кристаллические образцы удалось получить для радикалов ТЕМПО-ОМе, DEPN и оказалось невозможным для ТЕМПО и ТЕМПО-CN. Наличие ОМе группы в четвертом положении пипердинового кольца в МТ способствует образованию комплекса с С4 благодаря CHj/n взаимодействию [205] с фенильными кольцами молекулы С4. ТЕМПО образует комплексы с С4 лишь после восстановления в соответствующий гидроксиламин ТЕМПО-Н и мотив образования комплекса кардинально отличается от МТ [154]. Из-за отсутствия "якорной" ОМе группы образование парамагнитного комплекса ТЕМПО с С4 оказывается маловероятным. Восстановление в ТЕМПО-Н приводит к образованию водородных связей с молекулами растворителя (этанола) и, как следствие, к формированию диамагнитного комплекса ТЕМПО-Н/2-С4. Электроотрицательная CN группа в ТЕМПО-CN не взаимодействует с фенильными кольцами каликсарена, что делает невозможным образование комплекса радикала с капсулой 2-С4.
На рисунке 5.4а представлены спектры ЭПР Х-диапазона для поликристаллических комплексов МТ и С4 при различных температурах. Форма спектра ЭПР и ширина линий определяется сильным диполь-дипольным взаимодействием между радикалами в соседних капсулах. Движение радикалов в капсулах может приводить к изменению как расстояний между радикалами в соседних капсулах, так и направления для диполь-дипольного взаимодействие, но даже при температуре 370 К сохраняется большой вклад диполь-дипольного взаимодействия в ширину линий спектра.
При тетрагональной структуре кристалла (рисунок 5.2а) каждая капсула имеет 8 соседей. Согласно кристаллографическим данным для МТ в капсуле существует 8 эквивалентных положений, что соответствует количеству фенильных колец каликсарена в капсуле 2-С4. Расстояние между (N)-0 атомами нитроксилов соседних капсул лежит в пределах 10-16 А. Величину диполь-дипольного взаимодействия на таких расстояниях можно оценить согласно выражению (23), где /иа,ь - магнитные моменты двух электронов а и Ь, гаь - радиус вектор между электронами, h - постоянная Планка и ge , Д, ,Se - соответственно g-фактор электрона, магнетон Бора и величина спина электрона (5 =1/2) [206].
Для величины диполь-дипольного взаимодействия оценка по формуле 23 составляет 0.4 - 2.0 мТ, и сравнима с шириной линий в спектрах кристаллических комплексов МТ/2-С4 (рисунок 5.4а), 2 мТ. Получение информации о характере движения и подвижности из моделирования подобных спектров сильно затруднено. Для уменьшения величины диполь-дипольного взаимодействия были синтезированы комплексы смеси радикалов МТ и диамагнитных молекул дибензилкетона (ДБК, рисунок 5.1), в которых часть нанокапсул заняты молекулами ДБК.
ДБК был выбран в качестве диамагнитного гостя, вследствие подходящего размера, соизмеримого с размером полости капсулы [152], и инертности по отношению ко всем соединениям, используемым при получении комплексов. По данным рентгеноструктурного анализа параметры элементарной ячейки смешанных комплексов МТ / ДБК полностью идентичны параметрам для комплексов МТ с 2-С4. Анализ методом жидкостной хроматографии высокого давления (проведен Г. Ананченко) показывает, что соотношение концентраций гостей МТ / ДБК в смешанных комплексах составляет 1/5 и 1/31, соответственно, для двух полученных и охарактеризованных типов комплексов. В последнем случае (МТ / ДБК = 1/31) вероятность нахождения радикалов МТ в соседних капсулах оказывается пренебрежимо малой. Для комплексов с соотношением МТ / ДБК = 1/31 вклад диполь-дипольного взаимодействия в ширину линии в спектрах ЭПР оказывается несущественным (рисунок 5.4в).
ЭПР спектр разбавленного комплекса при 150 К (рисунок 5.4в) представляет собой типичный спектр нитроксильного радикала в замороженном растворе [206]. Форма спектра определяется анизотропными тензорами g-фактора (g) и СТВ (А). При повышении температуры форма спектра изменяется вследствие молекулярного движения радикалов, приводящего к частичному усреднению анизотропных компонент
гамльтониана [206]. При температуре 370 К для разбавленного комплекса (МТ / ДБК = 1/31) наблюдается спектр ЭПР, близкий к спектру в жидкости. Расщепление между линиями спектра определяется константой сверхтонкого взаимодействия с ядром азота N (спин ядра /N=1). В то же время форма спектра и интенсивности линий соответствуют типичному спектру при ограниченном ориентированном движении радикала. Результаты моделирования спектров ЭПР Х-диапазона для разбавленного комплекса в модели анизотропного ограниченного движения радикала представлены в отдельном разделе 5.2.3.
Для повышения спектрального разрешения в спектрах и получения детальной информации о магнитно-резонансных параметрах и о подвижности радикалов в капсулах для разбавленного комплекса были зарегистрированы высокопольные спектры ЭПР, W- (резонансная частота 94.951 ГГц) и Y- (360 ГГц / 14 Т) диапазонов.
ЭПР W-диапазона (94.95 ГГц). Спектры ЭПР W-диапазона при температурах 150 К - 330 К представлены на рисунке 5.5. При 150 К спектр ЭПР соответствует спектру замороженного раствора нитроксильного радикала. По мере повышения температуры, как и для Х-диапазона, спектры существенно изменяются, что связано с движением радикала в капсулах. При 330 К наблюдается ЭПР спектр, близкий к спектру радикала в растворе.
Конкурентные эксперименты с применением ЯМР
Аминогруппа AMP играет роль "якорной" группы. Взаимодействие положительно заряженной протонированнои аминогруппы AMP (рКа 10) с отрицательно заряженными порталами СВ7, представляющими собой атомы кислорода, способствует образованию комплекса с СВ7. ЭПР спектр AMP в воде представляет собой три линии, расщепление между которыми определяется констнтой сверхтонкого взаимодействия на атоме азота I4N (рисунок 5.26а). Для AMP изотропный g-фактор и константа СТВ оказались равными giS0-2.0060(2), 3N=(1.603±0.06) мТ и время корреляции тс=1-10-11 с. Образование комплекса с СВ7 приводит к изменению g-фактора и константы СТВ до giSO=2.0063(2), aN=(1.487±0.05) мТ и времени корреляции до Tc=5T0"n с (рисунок 5.266). Благодаря медленному обмену между двумя формами AMP - АМР/СВ7 на шкале ЭПР (Х-диапазон) в спектре наблюдаются линии каждой из форм. Так для соотношения концентраций АМР/СВ7 = 1/2 при рН 3.7 соотношение форм AMP и АМР/СВ7 составляет 0.07/0.93, соответственно. Константа комплексообразования радикала с кукурбит[7]урилом оказывается зависимой от показателя рН, поэтому при рН 9.0 соотношение форм составляет 0.45/0.55 (AMP и АМР/СВ7). Проведенные оценки для равновесной константы комплексообразования для процесса AMP - АМР/СВ7 из соотношения форм показывает, что равновесная константа лежит в пределах (0.24 -2.6)Т04 М"1 для рН 3.4 - 9.5. Ионы металлов эффективно (К 102-103 М"1) образуют комплексы с кукурбитурилами [162,168] вследствие взаимодействия положительно заряженных ионов с отрицательно заряженными порталами СВ7. Добавление KI в соотношении (АМР/К1= 1 / 4000) приводит к изменению соотношения форм (AMP и АМР/СВ7) с 0.07/0.93 до 0.20/0.80, соответственно (рисунок 5.26в).
ЭПР спектр (Х-диапазон) радикала AMP (0.25 мМ) при 298 К, рН 3.7 (а) AMP, 0.25 мМ; (б) в присутствии 0.5 мМ СВ7; (в) в присутствии 0.5 мМ СВ7, 0.1 М KI. Прерывистыми линиями представлены расчетные спектры. Соотношение форм АМР/АМР@СВ7 соответственно составляет: (а) 1/0; (б) 0.07/0.93; (в) 0.20/0.80.
Для AMP были получены комплексы с СВ7 в твердой фазе. Синтез был проведен к.х.н. О. А. Герасько, Лаборатория химии кластерных и супрамолекулярных соединений ИНХ СО РАН. Данные рентгеноструктурного анализа показывают, что полученные образцы являются аморфными. На рисунке 5.27а представлены ЭПР спектры при различной температуре для комплексов AMP с СВ7. Как и в случае комплексов МТ и DEPN с каликсаренами, диполь-дипольное взаимодействие между радикалами в соседних капсулах приводит к уширению линий в спектре ЭПР. Ширина линии для неразбавленных комплексов составляет 2 мТ. Это позволяет получить оценку для расстояния между радикалами в соседних капсулах - 10 А. Магнитное разбавление комплексов было проведено, используя анилин в качестве второго гостя. Для этого были получены образцы с соотношение концентраций АМР/анилин 1/1 и 1/15. Анилин был выбран в качестве гостя ввиду подходящего размера для СВ7, инертности к другим соединениям и наличия, как и в случае AMP, "якорной" аминогруппы. Для комплексов АМР/анилин = 1/15 спектр ЭПР при 150 К (рисунок 5.27в) соответствует типичному спектру неподвижных радикалов, форма которого определяется анизотропными g-фактором и константой СТВ. Моделирование ЭПР спектра при 150 К в пределе неподвижных радикалов (рисунок 5.27в) позволило получить приведенные ниже магнитно-резонансные параметры для комплекса (АМР+анилин)/СВ7:
Полученные магнитно-резонансные параметры не зависят от рН среды в пределах 3.4 - 9.5. Следует отметить, что для моделирования спектров было необходимо учесть вклад в спектр радикалов, располагающихся на поверхности нанокапсул. Вклад указанных радикалов учитывался в виде обменносуженой линии с соответствующим g-фактором 2.0055. Концентрация радикалов на поверхности капсул составляет около 7%, что возможно является недостатком процедуры синтеза изучаемых комплексов. По мере повышения температуры молекулярное движение радикалов в кукурбитурилах приводит к частичному усреднению компонент Гамильтониана системы [206]. В результате, при 370 К спектрютличается от спектра при 150 К (рисунок 5.27в).
Спектры ЭПР для аморфных образов (а) комплексов AMP / СВ7 и смешанных комплексов (АМР+анилин) / СВ7 со степенью разбавления (б) AMP / анинил = 1 / 1; (в) AMP / анинил =1/15. Прерывистыми линиями представлены расчетные спектры. Параметры расчетных спектров приведены в тексте. Времена корреляции вращения (тс) составляли 5-Ю 7с при 150 К и 1.7-10"8с при 370 К.
По результатам моделирования спектров при различной температуре в модели медленного изотропного движения радикалов были получены времена корреляции вращения (тс) (рисунок 5.27в). При температуре 370 К время корреляции составляет с, что свидетельствует о чрезвычайно низкой подвижности радикалов AMP в кукурбитурилах. Например, для МТ в капсуле на основе каликсаренов время корреляции вращения при Т=370 К составляет 1-Ю"10 с. Причиной чрезвычайно медленного движения AMP в кукурбитурилах может быть меньший размер полости СВ7 по сравнению с капсулой на основе каликсаренов и более сильное взаимодействие протежированной NH2 группы AMP с порталами СВ7 чем Ван-дер-Ваальсово взаимодействие между МТ и каликсаренами.
Методом ЭПР Х- (9.8 ГГц), W- (94.5 ГГц) и Y- (360 ГГц.) диапазонов была изучена подвижность радикалов 4-метокси-ТЕМРО и DEPN в калике [4]аренах. Для изучения подвижности нитроксилов в нанокапсулах были исследованы "разбавленные" образцы с включением в каликсарены помимо радикала диамагнитной молекулы дибензилкетона. Моделирование спектров позволило получить магнитно-резонансные параметры комплексов и информацию о подвижности нитроксилов внутри полости нанокапсул на основе каликс[4]арена. ЭПР спектр Х-диапазона при 373 К идентичен спектру в растворе, таким образом, капсула каликсарена может рассматриваться как "клетка" растворителя. Более того, показано, что каликсарены предохраняют включенные в них нитроксилы от восстановления аскорбиновой кислотой.
Были также исследованы комплексы AMP с кукурбит[4]урилами. Получены магнитно-резонансные параметры для комплексов и показано, что радикалы обладают чрезвычайно низкой подвижностью в кукурбитурилах.
