Введение к работе
Актуальность проблемы. При детектировании короткоживущих радикалов, в том числе in vivo, в большинстве работ применялся метод спиновых ловушек. В основе данного метода лежит реакция короткоживущих радикалов со специально подобранными химическими соединениями - спиновыми ловушками. Образующийся в результате реакции радикальный аддукт обычно представляет собой устойчивый нитроксильный радикал, спектр ЭПР которого несет информацию о котороткоживущем предшественнике. К настоящему моменту в литературе присутствует большое количество публикаций о регистрации радикальных аддуктов спиновых ловушек с S-центрированными короткоживущими радикалами, в том числе in vivo. Образование последних часто рассматривают в качестве одного из доказательств присутствия короткоживущих радикалов in vivo и токсичности сульфита. К сожалению, большинство публикуемых работ обладают существенным недостатком - образование радикальных аддуктов однозначно интерпретируется как присутствие короткоживущего радикала в системе и мало внимания уделяется рассмотрению других возможных механизмов образования данных аддуктов.
SH-содержащие соединения играют важную роль в организме: структурная функция, центр множества ферментов, окислительно-восстановительный буфер клеточной среды, основной барьер защиты от окислительного стресса и т.д. Все существующие к настоящему времени методы измерения концентраций данных соединений так или иначе основываются на их выделении, что не позволяет применять данные методики непосредственно in vivo. Недавно в Новосибирске был предложен метод определения концентраций SH-соединений, основанный на использовании дисульфид-бирадикалов и ЭПР спектроскопии. Детектирование нитроксильных монорадикальных компонентов, образующихся по механизму реакции тиол-дисульфидного обмена, позволяет сделать вывод о концентрации тиола. Однако высокая скорость восстановления нитроксильных радикалов, присутствующими в плазме клеток агентами, является главным фактором, сдерживающим его применение in vivo.
Основными целями работы являются: Исследование механизмов образования и деградации радикальных аддуктов S-
центрированных радикалов с нитронными спиновыми ловушками;
разработка метода регистрации SH-содержащих соединений с использованием
фторированных дисульфидов и ЯМР1' F спектроскопии.
WC НАЦИОНАЛЬНА^ БИБЛИОТЕКА \
Научная новизна работы. Показано существование реакции нуклеофильного присоединения S-центрированных нуклеофилов к двойной связи нитронных спиновых ловушек 5,5-диметилпиролин-М-оксида (ДМПО) и 5-диэтоксифосфорил-5-метил-1-лиррол-N-оксида (ДЭФМПО) и установлены структуры образующихся продуктов. На основании полученных экспериментальных данных предложен механизм данной реакции и определены константы скорости и равновесия соответствующих стадий. Показано участие механизма Форрестера-Хэпбурна (образование гидроксиламиновых производных спиновых ловушек в реакции нуклеофильного присоединения с последующим их окислением в радикальные аддукты) в формировании радикальных адцуктов сульфитного радикала со спиновыми ловушками ДМПО и ДЭФМПО. На основании этого сделан вывод о необходимости более тщательного анализа экспериментальных данных по детектированию сульфитного радикала методом спиновых ловушек.
Исследован механизм гибели радикальных аддуктов S-центрированных радикалов со спиновыми ловушками ДМПО и ДЭФМПО. Впервые показано, что реакция спинового захвата S-центрированного глутатионового радикала (GS*) нитронными спиновыми ловушками является обратимой. Определены константы скорости мономолекулярного распада радикальных адцуктов GS* с ДМПО и ДЭФМПО на глутатионовый радикал и спиновую ловушку.
Исследован механизм реакции дисульфида 2,3,5,6-тетрафтор-парамеркалтобензойной кислоты (BSSB) с SH содержащими соединениями: глутатионом, альбумином и гемоглобином. На основе полученных экспериментальных данных предложена схема реакции. Для реакции с глутатионом определены соответствующие константы равновесия Проведенные исследования позволили впервые применить метод "F ЯМР спектроскопии для определения содержания SH соединений в крови.
Практическая ценность. В данной работе впервые проведено детальное исследование механизмов образования и деградации радикальных аддуктов S-центрированных радикалов и нитронных спиновых ловушек. Полученные данные могут быть применены при анализе результатов экспериментов по детектированию S-центрированных радикалов
Результаты, полученные при исследовании механизма реакции дисульфида 2,3,5,6-тетрафтор-парамеркапто-бензойной кислоты с SH содержащими соединениями могут бьпь использованы при разработке методов регистрации SH групп на основе 19Р-ЯМР спектроскопии.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на российских и международных конференциях: 9-я международная встреча «ЭПР в живых системах» (Нью Хэмпшир, США, 2001); XIII, XV и XVI симпозиум "Современная химическая физика" (Туапсе, Россия, 2001, 2003, 2004); 10 и 11 Амперовская школа поЯМР (Закопаны, Польша, 2002, 2003); 31 Амперовский конгресс (Познань, Польша, 2002), VI Международная конференция имени Воеводского «Физика и химия элементарных химических процессов» (Новосибирск, Россия, 2002); Российская молодежная научная школа «Актуальные проблемы магнитного резонанса и его приложений» (Казань, Россия, 2002); Вторая международная конференция по биомедицинской спектроскопии (Лондон, Великобритания, 2003); 8-й международный симпозиум по спиновым и магнитным эффектам в химии (Чапл Хилл, США, 2003); 37-я ежегодная международная встреча «Новые технологии и применения ЭПР» (Варвик, Великобритания, 2004).
Публикации, Основные результаты диссертационной работы изложены в 4 статьях, а также ВІЗ тезисах докладов на международных и российских симпозиумах и конференциях.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, двух приложений и списка цитируемой литературы, включающего 299 наименований. Работа изложена на 150 страницах, содержит 9 таблиц, 30 рисунков и 14 схем.
