Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 10
1.1. Фотофизика и фотохимия индола, триптофана и их производных 10
1.1.1. Спектры поглощения основного состояния 10
1.1.2. Возбужденные триплетные состояния 11
1.1.2.1. Спектры поглощения 11
1.1.2.2. Коэффициенты экстинкции 13
1.1.2.3. Выходы интеркомбинационной конверсии 14
1.1.2.4. Время жизни 14
1.1.3. Свойства радикалов 16
1.1.3.1. Радикалы, образующиеся в реакциях окисления 16
1.1.3.2. Радикалы, образующиеся в реакциях восстановления 18
1.1.4. Реакции синглетного возбужденного состояния 18
1.1.4.1. Реакции переноса протона 18
1.1.4.2. Фотоионизация индола, триптофана и их производных 20
1.2. Фотофизика и фотохимия нуклеиновых кислот и их компонентов 24
1.2.1. Строение нуклеиновых кислот 24
1.2.2. Спектры поглощения компонентов нуклеиновых кислот 25
1.2.3. Фотохимические реакции нуклеиновых кислот и их компонентов 26
1.2.4. Применение метода ХПЯ к изучению фотохимических реакций с участием молекул нуклеиновых кислот и их компонентов 27
1.3. Постановка задачи 30
Глава II. Экспериментальная часть 31
2.1. Методы исследования 31
2.1.1 Установка лазерного импульсного фотолиза 31
2.1.2. Установка химической поляризации ядер с временным разрешением 34
2.1.3. рН- и спектрофотометрия 38
2.1.4. Актинометрия 39
2.2. Материалы и реактивы 39
Глава III. Изучение фотохимических реакций триптофана в водных растворах 40
3.1. Свойства возбужденных состояний триптофана 40
3.1.1. Спектроскопические характеристики интермедиатов триптофана 40
3.1.2. Кинетические характеристики 43
3.1.3. Измерение квантового выхода триплета триптофана 46
3.1.4. Константы скорости и квантовые выходы 50
3.1.5. Природа короткоживущего интермедиата 52
3.2. Фотоионизация триптофана 54
3.2.1. Предшественник фотоионизации триптофана 54
3.2.2. Зависимость выхода фотоионизации от энергии лазерного облучения 55
3.2.3. Зависимость квантового выхода фотоионизации от температуры для N-ацетилтриптофана (NATrpH) 57
3.2.4. Зависимость квантового выхода фото ионизации от температуры для L-триптофана (L-TrpH) 59
3.2.5. Зависимость от температуры реакции внутримолекулярного переноса электрона для L-TrpH 60
3.2.6. Реакции синглетного состояния триптофана 62
3.2.7. Численное моделирование реакций ионизации и ВПП 65
3.3. Количественная модель фотолиза триптофана 67
3.4. Заключение 69
Глава IV. Исследование фотохимических реакций и механизмов формирования хпя при фотолизе водных растворов 2,2- дипиридина с гуанозин-5-монофосфатом 72
4.1. Лазерный импульсный фотолиз растворов дипиридина с нуклеотидом 74
4.2. Исследование эффектов ХПЯ 79
4.3. Заключение 86
Глава V. Фотохимические реакции триплетного триптофана с нуклеотидами 88
5.1. Лазерный импульсный фотолиз растворов триптофана в присутствии нуклеотидов 89
5.2. Эффекты ХПЯ 95
5.3. Заключение 100
Выводы 101
Список цитируемой литературы 103
- Спектры поглощения основного состояния
- Спектры поглощения компонентов нуклеиновых кислот
- Установка лазерного импульсного фотолиза
- Спектроскопические характеристики интермедиатов триптофана
Введение к работе
Жизнь на Земле возникла и развивалась благодаря поглощению излучения. Несколько миллиардов лет назад под действием солнечного ультрафиолетового излучения, свободно проникавшего сквозь первозданную разбавленную атмосферу нашей планеты, ионизирующих излучений радиоактивных элементов и тепла вулканов синтезировались сложные органические молекулы, и началась пребиотическая эволюция, приведшая к созданию анаэробных организмов. Фотосинтез возник и стал развиваться позже, когда в земной атмосфере появились кислород и озон, защищающие поверхность планеты от воздействия солнечной УФ-радиации. В это время гетеротрофы - организмы, использовавшие для своего питания органические соединения, синтезируемые под действием ультрафиолетового излучения, исчезли, уступив свое место автотрофам -организмам, содержащим порфирины и обладающим способностью синтезировать собственную пищу, поглощая энергию видимого света. Фотосинтез снабжал и до сих пор снабжает все живые организмы энергией, необходимой для развития. Солнечный свет к тому же позволяет многим живущим организмам видеть свое окружение. Однако ионизирующее, ультрафиолетовое или видимое излучения оказывают и вредное воздействие на жизнедеятельность клеток. Они способны повреждать биологические молекулы, что приводит к изменению их активности или гибели клетки.
Белки, составляющими которых являются аминокислоты, участвуют во многих биологических процессах, а ультрафиолетовое излучение и ионизирующая радиация изменяют многие их свойства. С точки зрения фотобиологии триптофан наиболее важен, так как его спектр поглощения основного состояния перекрывается со спектром солнечной радиации, достигающей земной поверхности. Поэтому его фотовозбуждение может приводить к таким процессам, как фотоинактивация ферментов и фотоиндуцированное повреждение белков, приводящие к развитию различных заболеваний, в первую очередь кожи и органов зрения. Очевидно, что фотохимические реакции водных растворов триптофана могут существенно отличаться от реакций, протекающих в живых организмах. Это связано с тем, что, во-первых, в живых клетках триптофанильные остатки находятся в составе белковых молекул, а, во-вторых, реакции в молекулярно-организованных средах (которыми являются биологические растворы) могут отличаться от реакций в гомогенных растворах. Тем не менее, исследование фотовозбужденных состояний триптофана и их реакций является важным шагом для понимания механизмов фотохимических реакций, протекающих в живой природе. В
связи с этим в течение последних десятилетий фотохимия триптофана активно изучалась рядом научных коллективов, Однако, несмотря на это, до сих пор не существует детального количественного описания фотохимических реакций с участием этой аминокислоты.
Наиболее тяжелые последствия воздействия избыточного УФ облучения для людей связаны с повреждениями молекул нуклеиновых кислот. Реакции, вызванные прямым облучением структурных элементов нуклеиновых кислот - нуклеотидов ионизирующим или жестким ультрафиолетовым облучением, изучены достаточно хорошо. Однако основную опасность повреждения ДНК и РНК представляет не прямой, а сенсибилизированный фотолиз, так как сами нуклеиновые кислоты в видимом и ближнем УФ диапазонах прозрачны. Известно, что некоторые аминокислоты (триптофан, тирозин) способны поглощать свет в области длин волн 280-300 нм (то есть в диапазоне солнечного света) с образованием высокореакционных интермедиатов. Поскольку в живых организмах белки связываются с молекулами нуклеиновых кислот (например, в процессе транскрипции), то образующиеся интермедиаты могут вступать в реакции с азотистыми основаниями нуклеиновых кислот и вызывать химические повреждения последних. В связи с этим возникает необходимость в исследовании фотохимических реакций, вызванных облучением аминокислот, наиболее интенсивно поглощающих в области ближнего УФ диапазона (в первую очередь триптофана), в присутствии различных нуклеотидов. Таким образом, исследование свойств интермедиатов, образующихся при фотолизе растворов как самого триптофана, так и в присутствии нуклеотидов, имеет фундаментальное значение для фотохимии и фотобиологии.
В настоящее время взаимодействие излучений с биомолекулами является главным объектом исследования многих научных дисциплин, использующих различные методы. Основным вопросом всех исследований, прежде всего, является выяснением механизма реакций. Важнейшую роль в изучении механизмов фотохимических реакций с участием биомолекул играют современные кинетические методы. Как правило, эти методы основаны на импульсном возбуждении химической реакции с последующей регистрацией временной эволюции как исходных реагентов и конечных продуктов реакции, так и промежуточных частиц, возникающих в ходе реакции. Для импульсного инициирования реакции используют реакторы быстрого смешивания (для реакций смешения), а также импульсное облучение образца светом лазера или потоком ионизирующих частиц (для фото- и радиохимических реакций). Для регистрации проходящих в исследуемой системе изменений используется большое количество
различных методов, среди которых важное место занимают методы спиновой химии. Эти методы основаны на использовании явлений спиновой поляризации (ХПЯ - химическая поляризация ядер и ХПЭ - химическая поляризация электронов), возникающей в ходе радикальных химических реакций. Ядерная поляризация формируется за наносекунды в продуктах геминальной рекомбинации, но сохраняется в диамагнитных продуктах реакции в течение времени ядерной релаксации (порядка секунды) и может быть использована как спиновая селективная неразрушающая метка на молекуле биополимера. К преимуществу этого метода относится также его более высокая чувствительность по сравнению с обычными методами ЭПР и ЯМР, связанная с высокой степенью поляризации исследуемых образцов. Кроме того, современные методы позволяют проводить исследование кинетики формирования спиновой поляризации в микросекундном и субмикросекундном временных диапазонах, что в сочетании со спектральной информативностью, свойственной ЭПР и ЯМР, делает эти методы незаменимыми при исследовании механизмов быстрых радикальных реакций. Информация о механизме реакции может быть получена из анализа знаков, амплитуды и кинетики формирования сигналов поляризации. Поскольку спектры ХПЯ возникают в результате взаимодействий радикальных частиц, детальное изучение этих спектров и кинетики их эволюции позволяет сделать важные выводы о магнитных и кинетических свойствах этих интермедиатов. Следует заметить, что каждый метод сам по себе способен дать только ограниченную информацию о механизме исследуемой реакции, и для детального исследования необходимо комплексное использование ряда методов.
Настоящая работа посвящена исследованию кинетики и механизмов фотохимических реакций с участием структурных элементов биологических молекул -аминокислот и нуклеотидов, а также изучению свойств и взаимодействий короткоживущих промежуточных частиц, возникающих в ходе этих реакций. Исследования проводились с использованием комплексного подхода, основанного на совместном применении магнитнорезонансного и оптического методов: метода ХПЯ с временным разрешением и метода лазерного импульсного фотолиза (ЛИФ).
Цель диссертационной работы состояла в определении физико-химических свойств интермедиатов, образующихся при фотолизе триптофана, в установлении механизма реакций этих интермедиатов с нуклеотидами и определении свойств образующихся радикалов, в выяснении влияния параметров среды (рН, температура) на эти реакции, а также в установлении механизма фотохимических реакций между одним
из нуклеотидов и фотовозбужденными аза-ароматическими красителями и механизмов формирования ХПЯ в этих реакциях.
В первой главе диссертации дан обзор литературы по фотофизике и фотохимии индола, триптофана и родственных им соединений. Рассмотрены примеры основных фотохимических реакций, а также свойства радикалов и возбужденных состояний, образующихся при фотолизе этих молекул. В этой же главе дан обзор работ по изучению фотохимических реакций с участием нуклеиновых кислот и их компонентов. Приведены примеры использования физико-химических методов для изучения этих реакций.
Во второй главе описаны методики проведения экспериментов.
Третья глава диссертации посвящена исследованию фотохимических реакций, протекающих при фотолизе триптофана. Представлены результаты изучения эволюции и свойств образующихся интермедиатов, изучен механизм реакции фотоионизации триптофана, приведена целостная схема фотолиза данной аминокислоты.
В четвертой главе изучены механизмы фотохимических реакций между триплетным красителем и одним из оснований нуклеиновых кислот (гуанозин-5'-монофосфат) в водных растворах, а также изучены механизмы формирования эффектов ХПЯ в этих реакциях. В результате проделанной работы был установлен механизм тушения триплетного состояния красителя нуклеотидом, определены константы скорости реакций в широком диапазоне рН водных растворов, и установлены особенности формирования эффектов ХПЯ в водных растворах.
Пятая глава диссертации посвящена исследованию фотоиндуцированных реакций между триптофаном и различными нуклеотидами. Исследованы реакции между триплетным триптофаном и нуклеотидами, обсуждается механизм этих реакций.
В конце диссертации перечислены основные результаты и приведен список цитируемой литературы.
Спектры поглощения основного состояния
С точки зрения фотохимии наибольший интерес для исследования вызывают соединения, имеющие в своем составе хромофорные группы. В случае белковых молекул хромофором может являться аминокислотная боковая группа (или остаток аминокислоты). С этой точки зрения, наибольший интерес представляют ароматические аминокислоты: тирозин, фенилаланин и триптофан, а также гистидин и цистенн, поглощающие в длинноволновом диапазоне от 230 до 310 нм.
Среди всех аминокислот ароматическая кислота - триптофан имеет наиболее высокий коэффициент экстинкции в основном состоянии в ближнем УФ - диапазоне. Он поглощает в спектральном диапазоне длин волн солнечного излучения, достигающего поверхности нашей планеты (к 300 нм). По этой причине триптофан играет важную роль в фотодезактивации ферментов [2]. Фотоиндуцированные реакции могут приводить к развитию заболеваний кожи и органов зрения; так фотоповреждение белков хрусталика глаза приводит к определенному виду катаракты [3]. Первая электронная полоса поглощения So— Si триптофана, его хромофора (индола) и их производных лежит для водных растворов в области 260-310 нм (г о ю 6000 дм3/мольсм для индола). Она возникает вследствие наложения двух переходов, обозначаемых l А и lLb - А. Вторая полоса поглощения So - S2 расположена вблизи 220 нм и обозначается как В - А (Є220 30 000 дм3/моль-см для индола). Для тирозина и фенилаланина первая полоса поглощения совпадает с переходом lB2v, —1А\ъ бензола. Наиболее низкорасположенные синглетные уровни энергии соответствуют пересечению спектров поглощения и люминесценции. Рассмотрение этих уровней энергии для ароматических аминокислот показывает, что перенос энергии возможен от фенилаланина к тирозину и далее к триптофану. По этой причине в большинстве белков флуоресцирует преимущественно триптофан. Квантовые выходы флуоресценции и времена жизни флуоресцентного Si -состояния для ароматических аминокислот в нейтральном (рН = 7) водном растворе составляют соответственно 0.20 и 2.6 не для триптофана, 0.14 и 3.6 не для тирозина, 0.04 и 6.4 не для фенилаланина. [4]. Тем не менее, несмотря на большое количество исследований (см. работы [5-7] и приведенные в них ссылки) в вопросе о гибели флуоресцентного состояния триптофана остается много неясного. Так, считается установленным, что важнейшим каналом гибели флуоресцентного состояния является внутримолекулярный перенос протона от протонированной аминогруппы к индольному кольцу, однако механизм этой реакции остается невыясненным. Кроме того, до сих пор не решен вопрос о роли флуоресцентного состояния триптофана в процессе фотоиндуцированной ионизации.
Хромофором триптофана и его производных является индол. Спектры триплет-триплетного поглощения индола, триптофана, их производных и триптофансодержащих пептидов довольно схожи. Максимумы поглощения расположены между 430 и 460 нм, что иллюстрируется спектрами, приведенными на рис.1.2 и рис.1.3.а для индола и триптофана, соответственно [8-11]. Триплет-триплет-ное поглощение
Спектры поглощения короткоживущих промежуточных частиц, приведенные на рис 1.2, были получены Бентом и Хайоном при лазерном импульсном фотолизе нейтрального водного раствора индола (Ш) при длине волны возбуждения 265 нм. Сплошной линией изображен спектр, полученный через 50 не после импульса возбуждения в обескислороженном растворе; штриховой линией - спектр, полученный через 1 мке после импульса возбуждения в растворе, насыщенном кислородом [8].
Коэффициенты экстинкции триплетных состояний индола и триптофана в жидких растворах при комнатной температуре были измерены с помощью трех методов. С помощью сравнительного метода была сделана оценка величины молярного коэффициента экстинкции триплетного состояния индола в циклогексане (єт430 = 4000 дм3/ моль см). При этом значение выхода интеркомбинационной конверсии Фт вычисляли из соотношения Фт=1-Фь а в качестве актинометра использовали нафталин [13]. В дальнейшем оказалось, что для индола правило Фт + ФР =1 не выполняется, так как с уровня Si протекают химические реакции. При температуре 298 К для индола Фт + ФР =0.51 [14]. Методом переноса энергии с использованием антрацена в качестве стандарта для измерения коэффициента экстинкции триплетного состояния индола в циклогексане было получено значение єх на 430 нм равное 4700 ± 500 дм3/ моль-см [14]. Отсюда, предполагая, что сила осциллятора для поглощения триплетного состояния не меняется при переходе к другому растворителю, был оценен коэффициент экстинкции триплетного состояния индола в воде Єт430 = 3640 дм3/моль-см. Третий метод использовался в случае триптофана в водном растворе. При рассмотрении кинетики триплет-триплетной аннигиляции в предположении, что скорость аннигиляции контролируется диффузией, для триплета триптофана было получено значение є/60 = 5000дм3/мольсм[11]. 1.1.2.3. Выходы интеркомбинационной конверсии.
Триплетное состояние триптофана Tj образуется в результате интеркомбинационной конверсии из Si состояния. Значения квантовых выходов интеркомбинационной конверсии Фт для триптофана и Ы-ацетил-Ь-триптофанамида (NATA) в воде были измерены с помощью метода Медингера и Уилкинсона [15]. В этом методе сравнивается изменение интенсивности флуоресценции молекулы в растворе при добавлении известной концентрации тушителя — тяжелого атома — в зависимости от изменения интенсивности триплет-триплетного поглощения, наблюдаемого методом лазерного импульсного фотолиза. В качестве тушителя флуоресценции использовались ионы брома (Вг"). Полученные величины Фт составили 0.18 и 0.21 для ТгрН и NAT А, соответственно [11]. Близкое значение Фт= 0.23 было найдено сравнительным методом для индола в воде [14]. В этой же работе был определен выход интеркомбинационной конверсии для индола в циклогексане Фт = 0.43. Роббинс и сотрудники [7], используя данные Моана [16], Бента и Хай она [8], вычислили значение Фт (—0.10) для триптофана в нейтральном водном растворе (рН=7). Полученная величина разумно согласуется с данными Фолькерта с соавторами [11], если использовать то же самое значение єт= 5000 дм3/ моль-см.
Спектры поглощения компонентов нуклеиновых кислот
Сильное поглощение нуклеиновых кислот в ближней УФ-области спектра обусловлено поглощением пуриновых и пиримидиновых оснований (рис. 1.4). Полосы поглощения, расположенные в области 260-270 нм, приписывают главным образом -кп-переходам, а также замаскированным более слабым пп -переходам, положение которых определено не очень хорошо. Замещение атома водорода в основаниях на рибозу приводит к небольшому батохромному сдвигу. Изолированные основания не являются адекватными моделями нуклеиновых кислот ввиду отсутствия N-гликозидной связи. При переходе от рибонуклеозидов к дезоксирибонуклеозидам или к нуклеотидам спектр поглощения практически не меняется. Для пиримидинов и их нуклеозидов поглощение в области 260 нм соответствует одному тле - переходу, поляризованному в плоскости молекулы. Для пуринов и их нуклеозидов поглощение в области 260 нм соответствует двум тлі - переходам, поляризованным перпендикулярно друг другу, причем второй переход в спектрах аденина, аденозина или дезоксиаденозинмонофосфата проявляется как плечо, а в спектрах поглощения гуанина, гуанозина или дезоксигуанозинмонофосфата — как отдельный пик (рис. 1.4).
Все основания, нуклеозиды и нуклеотиды имеют вторую полосу поглощения вблизи 200 нм, которая соответствует одному или нескольким яя - переходам и является более интенсивной, чем полоса поглощения при 260-270 нм. Важно отметить, что спектры поглощения компонентов нуклеиновых кислот чувствительны к изменению рН [28].
Считается, что наиболее опасными последствиями воздействия УФ облучения на живую материю являются фотохимически-индуцированные повреждения молекул нуклеиновых кислот.
Поскольку основания нуклеиновых кислот имеют слабое поглощение в области ультрафиолета, то фотохимически-индуцированные повреждения молекул нуклеиновых кислот обычно возникают или при их облучении светом с длиной волны короче, чем 260 нм, или при сенсибилизированном фотолизе. В частности, недавно было показано, что сенсибилизированный ацетоном фотолиз нуклеотидов приводит к образованию триплетных состояний нуклеотидов и радикалов, возникающих в результате реакций переноса электрона [73-78]. В связи с этим, исследование фотохимических реакций между ароматическими аминокислотами и нуклеотидами может представлять особый интерес.
Фотохимические реакции с участием структурных элементов биологических молекул (аминокислот и оснований нуклеиновых кислот) являются предметом многочисленных исследований [28,48,79-83 J. В живых клетках фотоокисление протеинов может происходить по трем основным механизмам: а) фотоиндуцированное образование синглетного кислорода и его последующие реакции, б) поглощение света хромофорами, связанными с белком и с) поглощение света в белках аминокислотными остатками. Последний механизм относится, главным образом, к ароматическим аминокислотам, которые поглощают свет в диапазоне ближнего ультрафиолета: триптофан, тирозин, фенилаланин и, в меньшей степени, гистидин. Свойства и химические реакции фотовозбужденных состояний ароматических аминокислот широко исследовались в последние десятилетия [8,48,79,80,84,85].
Белки, содержащиеся в клетках живых организмов, часто связываются с молекулами нуклеиновых кислот. Поэтому короткоживущие интермедиаты, образующиеся при фотолизе аминокислот (триплетные состояния, сольватированные электроны, радикалы) могут реагировать с нуклеиновыми основаниями и вызывать повреждения молекул нуклеиновых кислот. К примеру, два высокореакционных долгоживущих интермедиата - триплет и сольватированый электрон, образующиеся при фотолизе триптофана [7-9,11,28,36,52,59-61,65,80,86], способны реагировать с нуклеиновыми основаниями.
Реакции между сольватированными электронами и нуклеотидами были изучены ранее методом импульсного радиолиза [82,87]. Как пуриновые, так и пиримидиновые нуклеозиды быстро реагируют с сольватированным электроном с диффузионно-контролируемой бимолекулярной константой скорости » 10ю NT1 с"1, хотя при введении фосфатной группы константа скорости реакции между сольватированным электроном и нуклеотидом уменьшается вследствие электростатического взаимодействия [88]. В молекулах нуклеиновых кислот отрицательно заряженный центр (анион радикал) перемещается к конечному месту нахождения на тимине или цитозине [89-92], при этом процесс миграции определяется значениями окислительно-восстановительных потенциалов и константами кислотно-основного равновесия (рКв) нуклеиновых оснований [93-95].
Данные о свободных радикалах пиримидинов, пуринов, нуклеозидов, нуклеотидов и ДНК были получены в основном из исследований по радиолизу, и, в особенности, из исследований по импульсному радиолизу [95-97]. Эти исследования проводились в разбавленных водных растворах, где радикалы растворенных веществ образуются в результате реакций с короткоживущими продуктами радиолиза воды: гидроксильными радикалами, атомами водорода и гидратированными электронами [98-101]. Важно заметить, что хотя многие фотохимические реакции с участием индивидуальных аминокислот [102] и нуклеотидов [103-105] достаточно хорошо известны, изучение реакций между фотовозбужденными аминокислотами и нуклеотидами ранее не проводилось. Возможно, это связано со сложностью проведения экспериментов и анализа полученных данных: короткоживущие интермедиаты большинства аминокислот и нуклеотидов обладают достаточно слабым поглощением в области видимого и ближнего УФ диапазонов и имеют плохо разрешенные спектры ЭПР [106].
Установка лазерного импульсного фотолиза
Метод импульсного фотолиза, впервые предложенный в 1949 году, является мощным методом исследования механизмов фотохимических процессов. Этот метод заключается в возбуждении молекул образца очень коротким высокоинтенсивным импульсом света с последующей регистрацией происходящих изменений оптической плотности образца В настоящее время одним из общепринятых способов регистрации изменений в образце является детектирование пропускания образца на определенной длине волны как функции времени.
Принципиальная схема установки лазерного импульсного фотолиза с использованием фотоэлектрической регистрации кинетики изменения промежуточного поглощения в УФ- и видимой области спектра представлена на рис. 2.1. Зондирующее излучение проходит через образец под прямым углом к возбуждающему лазерному импульсу. Поглощение короткого импульса возбуждающего излучения приводит к образованию неустойчивых интермедиатов - возбуждённых молекул, свободных радикалов или короткоживущих продуктов. Монохроматор позволяет выбрать необходимую длину волны для наблюдения изменений поглощения короткоживущих интермедиатов. Поглощение образца как во время прохождения возбуждающего импульса, так и в предшествующие и последующие моменты времени регистрируются фотодетектором, преобразующим изменения интенсивности света в электрические сигналы, которые наблюдаются затем на экране осциллографа. Изменения поглощения обычно выражают в изменениях оптической плотности. Изменяя длину волны регистрации, можно изучать спектральные характеристики промежуточного поглощения.
Эксперименты по лазерному импульсному фотолизу проводились на установке созданной в МГЦ СО РАН в 1995 году [120,121]. Схема установки изображена на рис. 2.1. Раствор, циркулирующий через прямоугольную кварцевую кювету сечением 10x3 мм при помощи проточной системы, облучается излучением импульсного ХеС1 эксимерного лазера (Lambda Physik EMG 101, длина волны 308 нм, энергия до 100 мДж/импульс, длительность импульса 15-20 не). Излучение лазера проходит через блок измерения мощности ИМ и шторку Ш2 и концентрируется двумя сферическими линзами на поверхность кюветы К.
Регистрирующая система состоит из дуговой ксеноновой лампы ДКсШ-150 (длительность импульса 2 мс, размер регистрирующего луча 1x3 мм), двух синхронно управляемых монохроматоров Ml и М2 (240-670 нм, 1200 штрихов на мм, обратная дисперсия 3 нм/мм, набор щелей 2-0.1 мм), фотоумножителя ФЭУ (9794В, Electron Tubes Ltd., питание до 1000 В, 9 динодов) и цифрового двухканального осциллографа с 11-битным АЦП (LeCroy 9310А, 400 МГц, временное разрешение 10 не). Для регистрации слабых сигналов возможно включение в схему предусилителя (вычитание пьедестала и усиление в 5 раз). Установка полностью контролируется компьютером (ПК) ЮМ PC 486 посредством МР488СТ IEEE 488 интерфейса.
Установка имеет ряд особенностей, выгодно отличающих ее от других подобных установок. Использование двух синхронно работающих монохроматоров позволило разрешить ряд экспериментальных проблем. Во-первых, это позволило сконцентрировать детектирующий свет внутри кюветы в четкий прямоугольник размерами 1x3 мм. Во вторых, поскольку в данной конфигурации образец облучается только узкой спектральной полосой детектирующего света, практически снимается проблема выгорания образца за счет облучения детектирующим светом. В-третьих, монохроматичность падающего света позволяет легко корректировать настройку оптической системы, необходимую в связи с хроматическими аберрациями оптических элементов при изменении длины волны регистрации.
Поскольку детектирующий свет, сконцентированный в прямоугольнике 3 мм в высоту и 1 мм в ширину, проходит через кювету вдоль переднего фронта окна (ширина 8 мм, высота 3 мм) лазерного облучения, то во всех экспериментах длина оптического пути возбуждения составляет 1 мм, а длина детектирующего луча L равна мм. Соответственно, на всех рисунках значения поглощения интермедиатов приведены для L = 0.8 см.
Установка оснащена температурной приставкой, позволяющей проводить эксперименты в диапазоне температур от 190 К до 350 К. При проведении высокотемпературных измерений нагревание образца осуществляли с помощью обдувания кюветы потоком горячего воздуха. При низкотемпературных измерениях кювета помещалась в оптический дьюар и обдувалась потоком холодного азота. Температуру образца контролировали термопарой, помещенной внутрь образца. Для изменения интенсивности лазерного излучения использовались стеклянные фильтры или их комбинации. Бели за время эксперимента выгорание образца было незначительным, и вторичные фотохимические процессы не вносили существенного вклада в промежуточное поглощение, то измерения проводились с использованием стационарной фотохимической кюветы, в противном случае использовалась струевая система.
Предварительно, до проведения измерений, все растворы барбатировались соответствующим газом в течение 15 минут. В большинстве случаев, через раствор барбатировался инертный газ (аргон) для удаления Ог из системы. В отдельных случаях, которые в тексте особо оговариваются, использовались закись азота (N2O) и/или кислород. Во время эксперимента барбатирование газом продолжали, что также способствовало перемешиванию раствора.
В подавляющем большинстве время-разрешенных физико-химических экспериментов, связанных с прямым детектированием короткоживущих промежуточных частиц, существует жесткая связь между предельным временным разрешением данного метода и спектральным разрешением получаемых экспериментальных данных. Так, временное разрешение метода ЭПР с временным разрешением составляет десятки наносекунд, а ширина линий в спектре ЭПР лежит в диапазоне от десятков килогерц до десятков мегагерц. Временное разрешение оптической спектроскопии достигает фемтосекундного временного диапазона, однако для большинства органических молекул различные линии сливаются вместе настолько, что вместо термина "спектральная линия" используется выражение "полоса поглощения". Метод химической поляризации ядер (ХПЯ) с временным разрешением в силу его косвенной природы по отношению к детектированию промежуточных частиц, составляет одно из редких исключений. Метод позволяет получить информацию о кинетике формирования ядерной поляризации в диамагнитных продуктах радикальных реакций в наносекундном временном диапазоне, сохраняя при этом типичное для ЯМР-спектроскопии разрешение до долей герца. Эта особенность метода ХПЯ связана с тем, что ядерная поляризация, создаваемая в ходе химических реакций, протекающих в диапазоне 10" -10 секунды, затем переходит в диамагнитные продукты реакции и сохраняется в них в течение времен ядерной спин-решеточной релаксации (единицы и десятки секунд). Таким образом, благодаря высокому спектральному разрешению современной ЯМР спектроскопии, можно исследовать кинетику формирования ядерной поляризации в микросекундном и субмикросекундном временных диапазонах на каждом отдельном продукте или даже на каждой отдельной функциональной группе данного продукта, имеющей СТВ взаимодействие в соответствующем радикале.
Спектроскопические характеристики интермедиатов триптофана
До и во время измерений через раствор барбатировапся аргон для удаления кислорода. При фотолизе растворов триптофана образуются следующие промежуточные частицы: триплет триптофана тТгрН, сольватированный электрон е «, и катион радикал триптофана ТгрН4 . В нейтральных растворах катион радикал быстро депротонирует (рКа - 4.3 [8,65,133]), образуя нейтральный радикал Тгр . Таким образом, второй спектр на рисунке 3.1.а (открытые кружки), полученный в присутствии ацетона, состоит из суперпозиции спектров поглощения триплета триптофана ТгрН и нейтрального радикала Тф . Следует отметить, что поглощение ацетона при используемой концентрации является незначительным (коэффициент поглощения ацетона на длине волны 308 нм равен Єдс = 0.4 М см 1).
Простое вычитание спектров одного из другого позволяет получить индивидуальные спектры поглощения интермедиатов, образующихся при фотолизе (Х=308 нм) водных растворов триптофана (рис. 3.1.6). На данном рисунке кружками представлен спектр поглощения нейтрального радикала Тгр с характерными максимумами на 330 и 510 нм [8,9,12,65,144,145]. Квадратами на рисунке показана разница между спектрами, полученными для обезкислороженных растворов в отсутствие (рис. 3.1.а, треугольники) и в присутствие ацетона (рис. З.І.а, неокрашенные кружки). Данный спектр соответствует поглощению радикала ТгрНг с максимумом полосы поглощения на Д.=350 нм [11,33,34]. И, наконец, разница между вторым и третьим спектрами рис. З.І.а соответствует спектру поглощения триплетного триптофана тТірН (рис. 3.1.6, неокрашенные треугольники) с максимумом поглощения на 450 нм [8,11,1 б].
На рис. 3.1.6 приведен также спектр, представляющий собой разницу между спектрами, полученными под аргоном в присутствии ацетона, зарегистрированными через 50 и 250 не после лазерного облучения (закрашенные треугольники). Максимум полосы поглощения этого промежуточного короткоживущего состояния находится на 400 нм; кинетика гибели данного состояния описывается экспоненциальным законом с константой кт = 3.8x10 с" . Спектр и время жизни этой промежуточной частицы совпадает с данными для "Ті состояния по Бенту и Хайону" [8]. Природа этого состояния будет рассмотрена ниже.
В отсутствие соединений (ацетон, закись азота), приводящих к гибели электронов, поглощение сольватированного электрона наблюдается практически во всем спектральном диапазоне, причем интенсивность сигнала увеличивается при переходе в область больших длин волн. Скорость спада сигнала сольватированного электрона пропорциональна начальной концентрации триптофана ТгрН, то есть 1 = keX[TrpH], где ke = 3.0x108 NT c"1. Поскольку в наших экспериментальных условиях [ТгрН]=10 мМ, то через 3 мкс после импульса лазера все электроны исчезают в реакции с триптофаном.
При варьировании кислотности среды от 7.0 до -0.3 спектр короткоживущей частицы (кт = 3.8х107 с"1) с максимумом полосы поглощения на 400 нм (рис. ЗЛ.б, закрашенные треугольники) не изменяется, хотя интенсивность сигнала в очень кислой среде была примерно на 20-30 % выше, чем в нейтральном растворе. Для того, чтобы проверить, в действительности ли этот интермедиат является триплетным состоянием триптофана, были проведены эксперименты по тушению триплетного состояния. В нейтральном растворе при регистрации на длине волны 450 нм при добавлении различных концентраций акриламида были получены кинетические кривые гибели как короткоживущей частицы, так и "долгоживущего" триплетного состояния триптофана. Наблюдаемая константа скорости спада сигнала долгоживущей составляющей компоненты (Х=450 нм) линейно возрастает с увеличением концентрации акриламида. Расчетное значение бимолекулярной константы скорости тушения долгоживущего триплетного состояния акриламидом равно kqi = (1.3±0.2)х10 М" с". Присутствие акриламида в концентрации 0.01-0.1 М также оказывает влияние на время жизни короткоживущего интермедиата. Однако полученное значение константы скорости тушения kq2 — 1.6x10 М с" следует рассматривать только как грубую оценку, так как временное разрешение нашей экспериментальной установки лежит в тех же пределах, что и значение времени жизни короткоживущего интермедиата. Кроме этого, было проведено тушение триплетных состояний триптофана кислородом. Скорость спада сигнала долгоживущего триплетного состояния линейно зависит от концентрации Ог с константой скорости к, — (5.3±0.8)х109 M V1, в то время как даже при 100% насыщении раствора кислородом увеличения скорости гибели короткоживущей частицы не было зарегистрировано. Очевидно, для тушения такого короткоживущего состояния концентрации кислорода (растворимость в воде около 1.4 мМ) не достаточно.
