Введение к работе
Актуальность проблемы.
До настоящего времени химиотерапия остается основным методом лечения острых лейкозов. Несмотря на большое разнообразие цитостатических средств, базисными препаратами в терапии острых миелоидных лейкозов (ОМЛ) являются цитозин-арабинозид (цитозар, цитарабин) и даунорубицин. Семидневная инфузия цитарабина в комбинации с трехдневным введением антрациклинового антибиотика является основой всех ныне существующих программ и проводится большинству больных на всех этапах терапии ОМЛ: индукции, консолидации и поддержания ремиссии [Савченко, 1999]. Одним из прогрессивных методов лечения ОМЛ считается применение высоких доз цитарабина, благодаря чему удается существенным образом увеличить процент общей и безрецидивной выживаемости пациентов [Cassileth, 2005]. Использование высоких или средних доз цитарабина в сочетании с митоксантроном и идарубицином наиболее эффективно у больных с рецидивами и резистентными формами ОМЛ [Савченко, 2004; Tallman, 2005]. Поскольку основным в тактике современной химиотерапии острых лейкозов является принцип интенсификации лечения, риск возникновения различных осложнений со стороны многих органных систем (нервной системы, желудочно-кишечного тракта, печени и т.д.), включая сердечно-сосудистую, возрастает.
Сосудистый эндотелий является одной из основных тканевых систем организма человека. Покрывая всю поверхность сосудистого русла, эндотелий характеризуется высокой функциональной активностью и участвует в обменных процессах, регуляции пролиферации и дифференцировки различных типов клеток, формировании новых сосудов, работе свертывающей-противосвертывающей системы крови и т.д. [Cines, 1998]. Воздействие различных неблагоприятных факторов приводит к "дисфункции" эндотелия, следствием чего могут являться нарушения сосудистого тонуса, проявление признаков провоспалительных и протромботических изменений [Esper, 2006; Endemann, 2004].
В условиях in vivo эндотелий обладает сравнительно низкой пролиферативной активностью и относится к медленно обновляемым тканям [Hopson, 1984]. Однако, скорость его регенерации в отдельных участках сосудистого русла при некоторых состояниях (как патологических, так и физиологических) и воздействиях может значительно возрастать и достигать десятков процентов в сутки [Schwartz, 1977; Folkman, 1995]. По всей видимости, пролиферирующие и, в меньшей степени, покоящиеся эндотелиальные клетки могут становиться потенциальной мишенью для цитостатических препаратов, применяемых в терапии лейкозов. Кроме того, являясь внутренней оболочкой сосудов, эндотелий первым контактирует с препаратами, вводимыми в кровеносное русло: пиковые концентрации цитостатических препаратов, по-видимому, могут оказывать прямое повреждающее действие на эндотелиальные клетки. В то же время, эндотелий может обладать
чувствительностью и к более низким концентрациям препаратов, длительное время находящихся в кровотоке [de Vos, 2004].
Спектр сосудистых осложнений, возникающих на фоне применения химиотерапевтических препаратов, достаточно широк: от асимптоматических флебитов до потенциально смертельных васкулопатий (вено-окклюзионная болезнь, тромботическая микроангиопатия) [Shahab, 2006]. При этом индуцированное токсическое воздействие на эндотелий сосудов в той или иной мере усугубляется в случае его исходной неполноценности [Баркаган, 2001]. Несмотря на то, что клинические проявления сосудистой патологии для многих препаратов хорошо известны, детальные механизмы ее развития в большинстве случаев изучены недостаточно.
В настоящее время лабораторная диагностика поражений сосудистого эндотелия в основном заключается в определении в крови растворимых маркеров, специфичных для эндотелиальных клеток (фактор Виллебранда, тромбомодулин, эндотелин-1, растворимые формы молекул клеточной адгезии и др.). Однако их содержание может зависеть от ряда сопутствующих патологий, не связанных с поражением эндотелия, что указывает на недостаточную достоверность их анализа [Borawski, 2001; Woywodt, 2004; Endemann, 2004]. Одним из перспективных методов диагностики сосудистых заболеваний является определение уровня циркулирующих эндотелиальных клеток [Dignat-George, 2000]. Детекция клеток эндотелия в крови по совокупности специфичных маркеров позволяет оценить не только функциональные изменения и степень поражения эндотелия, но также и последующее его восстановление.
Цель исследования:
Основной целью данного исследования явилось изучение некоторых механизмов развития сосудистой патологии, обусловленной возможным повреждением эндотелиальных клеток в процессе цитостатической терапии.
Для достижения этой цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:
Разработать экспериментальную модель для оценки эффектов цитостатических препаратов с использованием культивируемых эндотелиальных клеток человека.
Изучить влияние цитостатических препаратов с различным механизмом действия на пролиферацию, жизнеспособность эндотелиальных клеток и организацию монослоя эндотелия.
Исследовать функциональные изменения культивируемых эндотелиальных клеток при воздействии цитозин-арабинозида и даунорубицина, включая экспрессию различных классов молекул клеточной адгезии и взаимодействие эндотелия с клетками периферической крови.
Исследовать основные механизмы репарации эндотелия после применения цитостатических препаратов in vitro.
Отработать методические приемы и исследовать в динамике содержание циркулирующих эндотелиальных клеток в крови здоровых доноров и больных ОМЛ в процессе лечения.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые охарактеризовано влияние основных цитостатических препаратов (цитарабина и даунорубицина) и их сочетаний, применяемых в терапии больных ОМЛ, на структурные и функциональные особенности клеток эндотелия с использованием культивируемых эндотелиальных клеток человека. Оценено влияние препаратов на целостность монослоя и жизнеспособность клеток в зависимости от концентрации и продолжительности воздействия.
Впервые установлено, что инкубация культивируемых клеток с цитозин-арабинозидом вызывает ряд изменений, имеющих провоспалительную направленность: усиливается экспрессия различных классов молекул клеточной адгезии (Е- и Р-селектинов, ICAM-1, VCAM-1 и РЕСАМ-1) и возрастает адгезивность эндотелия для клеток периферической крови.
В ходе экспериментов in vitro удалось прояснить основные способы репарации поврежденного монослоя эндотелиальных клеток после воздействия цитостатических препаратов.
Отдельный раздел исследования был посвящен изучению повреждающего действия проводимой химиотерапии на эндотелий сосудов больных ОМЛ. Впервые методом проточной цитометрии проведено динамическое исследование содержания циркулирующих эндотелиальных клеток с фенотипом CD54+/CD45-, CD34+/CD45-, CD146+/CD45- в крови больных ОМЛ на фоне разных программ лечения. Установлено, что введение цитостатических препаратов сопровождается увеличением содержания циркулирующих эндотелиальных клеток в периферическом кровотоке, что подтвердило данные, полученные в экспериментальной модели in vitro.
Впервые установлено, что после цитостатического воздействия в период миелотоксического агранулоцитоза в крови больных ОМЛ выявляются клетки-предшественники эндотелия, появление которых может быть связано с процессами регенерации поврежденного эндотелия. Доказательством жизнеспособности и функциональной активности этих клеток явились результаты культивирования мононуклеарных клеток крови, показавшие наличие колониеобразующих единиц эндотелия (КОЕ-Энд).
Полученные экспериментальные данные позволили расширить существующие представления о механизмах развития сосудистой патологии у больных на фоне проводимой химиотерапии. Детекция циркулирующих эндотелиальных клеток может иметь
практическое значение в диагностике поражения эндотелия при использовании различных цитостатических препаратов в онкологической практике. Кроме того, определение исходного числа эндотелиальных клеток и динамический контроль их содержания в крови могут быть использованы в практическом здравоохранении для оценки эффективности противоопухолевого лечения.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на заседании Проблемной комиссии ГУ ГНЦ РАМН (04.03.2008); 46-й Ежегодной конференции Американского общества гематологов (США, 2004); 25-й Международной гематологической школе (Москва, 2004); Ежегодной сессии Международной ассоциации по клеточной терапии ISCT (Берлин, 2006); Международном конгрессе «Моделирование болезней крови» (Лион, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 3 тезисных сообщения.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы», «Список литературы». Работа изложена на 118 страницах и включает 22 рисунка, 4 таблицы и список литературы, содержащий 239 ссылок.
Положения, выносимые на защиту:
Препараты, применяемые в терапии острых лейкозов (цитозин-арабинозид и даунорубицин), оказывают различное по характеру повреждающее действие на эндотелиальные клетки человека in vitro.
Воздействие цитозин-арабинозида приводит к изменениям функциональных параметров культивируемых эндотелиальных клеток.
Цитостатическая терапия острых лейкозов индуцирует повреждение эндотелия in vivo, проявлением чего является выявление в крови пациентов циркулирующих эндотелиальных клеток.
Регенерация эндотелия после повреждения химиотерапевтическими препаратами in vitro и in vivo происходит за счет различных механизмов: изменения формы и размеров дифференцированных эндотелиальных клеток, а также пролиферации и вступления в дифференцировку колониеобразующих единиц эндотелия.
