Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 7
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
Нейтрофилы 11
Рецепторный аппарат нейтрофилов 12
FcR рецепторы 13
CR рецепторы 19
Взаимодействие FcR и CR в процессе фагоцитоза 26
Э гапы фагоцитоза. Киллинг микроорганизмов фагоцитами 28
Существующие методы оценки этапов фагоцитоза 32
Методы оценки хемотаксиса и адгезии фагоцитов 33
Методы оценки поглотительной активности фагоцитов 35
Методы оценки дегрануляции лейкоцитов периферической крови 37
Методы оценки бактерицидного потенцила фагоцитов 38
Косвенные методы оценки микробицидного потенциала фагоцитов 41
Методы оценки переваривающей способности фагоцитарных клеток 43
Оценка некоторых функциональных характеристик фагоцитов с
помощью проточной цитометрии 44
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 46
Характеристика обследованных групп населения 46
Реактивы и оборудование 47
Реак швы 47
Оборудование 48
Выделение лейкоцитов на желатине 49
Методика мечсиия микроорганизмов ФИТЦ для оценки поглотительной активности и ФЧ
фагоцитов 49
Методика определения поглотительной активности лейкоцитов периферической крови с
помощью ПЛЦ 50
Микроскопический метод оценки поглотительной активности и ФЧ лейкоцитов
периферической крови 51
Определение фагоцитарного числа лейкоцитов периферической крови по отношению к St.
aureus с помощью проточной цитометрии 51
Методика мечсиия микроорганизмов ФИТЦ для оценки бактерицидной активности
лейкоцитов 52
Методика оценки бактерицидной функции фагоцитов периферической крови человека
(внутриклеточный киллинг) 53
Методика оцеки фенотипа нейтрофилов с помощью ПЛЦ 53
Анализ хемилюминесценции лейкоцитов 54
Статистическая обработка результатов 54
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 55
Оценка фенотипа нейтрофилов с помощью ПЛЦ 55
Оценка фагоцитарной активности лейкоцитов периферической крови с помощью
проточнолазерной цитофлюориметрии 57
Корреляция между цитометрическим и микроскопическим методами оценки
фагоцитарной активности фагоцитов 60
Определение фагоцитарной активности лейкоцитов по отношению к St. aureus у
пациентов с различными патологиями 61
Фагоцитарная активность лейкоцитов периферической крови у пациентов с ХГБ по
отношению к St. aureus 61
Фагоцитарная активность лейкоцитов периферической крови у пациентов с
хроническим рецидивирующим фурункулезом и хроническим гематогенным
остеомиелитом в стадии обострения по отношению к St. aureus 62
Определение фагоцитарного числа лейкоцитов периферической крови по отношению к St.
aureus с помощью проточной цитометрии 63
Зависимость Geo Mean фагоцитировавших клеток от количества поглощенных
бактерий 65
Корреляционный анализ метода проточной лазерной цитометрии с бактериологическим
методом оценки фагоцитарного числа 68
Дифференциальный анализ поглощения и адгезии бактерий к лейкоцитам периферической
крови методом гашения внеклеточной люминесценции 69
Применение цитометрического метода оценки фагоцитарного числа лейкоцитов при
различных патологиях 71
Фагоцитарное число у пациентов с ХГБ 71
Фагоцитарное число у пациентов с хроническим рецидивирующим фурункулёзом
(ХРФ) 72
Фагоцитарное число у пациентов с хроническим гематогенным остеомиелитом ст.
обострения 73
Оценка бактерицидной функции фагоцитов периферической крови человека
(внутриклеточного киллинга бактерий) с помощью проточнолазерной
цитометрии 74
Показатели бактерицидной активности (внутриклеточный киллинг) лейкоцитов
периферической крови при различных
патологиях 77
Показатели киллинга St. aureus лейкоцитами периферической крови у пациентов с
ХГБ 77
Бактерицидная активность фагоцитов периферической крови пациентов с ХРФ...80
Бактерицидная активность фагоцитов периферической крови пациентов с хроническим
гематогенным остеомиелитом в стадии обострения 81
Определение индекса переваривающей способности лейкоцитов периферической крови
по отношению к St. aureus с помощью проточной цитометрии 83
Применение метода оценки переваривающей способности фагоцитарных клеток (ИПС) у
пациентов с различной патологией 86
ИПС у пациентов с ХГБ 86
Индекс переваривающей способности у пациентов с ХРФ и хроническим
гематогенным остеомиелитом 87
ВЫВОДЫ 89
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 91
ПРИЛОЖЕНИЯ 100
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Аг - антиген
АДФ - адениндинуклеотидфосфат
Ат — антитело
АТФ - аденозинтрифосфат
ВП - внутриклеточное переваривание
Г-КСФ - гранулоцит-колониестимулирующий фактор
ДМСО - диметилсульфоксид
ИЛ - интерлейкин
ИФН - интерферон
КОЕ - колонтеобразующая единица
ЛПС - липополисахарид
Мо - моноцит
МПА - мясопептонный агар
МПО - миел оперо ксидаза
Мф - макрофаг
НАДФН — никотинамидадениндинуклеотид фосфат восстановленный
НП - Непереваренные продукты
Нф - нейтрофил
ПВВП - переваривание с внеклеточным выбросом
ПИ - пропидиум иодид
РНК - рибонуклеиновая кислота
СОД - супероксиддисмутаза
ФИТЦ - флуоресцеин-5-изотиоцианат
ФЛАг - ПА - группа НА фосфолипазы Аг
ФНО - фактор некроза опухоли
ФСБ - фосфатно-солевой буфер
ХГБ - хроническая гранулематозная болезнь
ХРФ — хронический рецидивирующий фурункулез
DHR 123 - дигидрородамин
Dot Plot - точечный рисунок в системе координат х/у
FACS - флюоресцентно активированный клеточный сортировщик
FSC — прямое светорассеивание
G-CSF - гранулоцит колониестимулирующий фактор
HNP (Human neutrophils peptides) — пептиды нейтрофилов человека
ICAM - молекулы межклеточной адгезии (intracellular adhesion moleculars)
lg - иммуноглобулин
NF-кВ - ядерный транскрипционный фактор
N0 - окись азота
PI - пропидиум иодид
SSC - боковое светорассеивание
St. aureus - золотистый стафилококк
St. аигеш-ФИТЦ+ - ФИТЦ- меченный золотистый стафилококк
Н2О2- перекись водорода
Введение к работе
Актуальность темы диссертации
Систему фагоцитоза можно определить как совокупность клеток и гуморальных факторов, обеспечивающих базальный уровень структурного гомеостаза. [Маянский А.Н., Пикуза О.И., 1993] Центром системы фагоцитоза служат фагоциты. В этом термине отражается один из самых ярких функциональных признаков данных клеток — способность к поглощению и уничтожению чужеродного материала. Как сейчас установлено, фагоциты участвуют в клеточном взаимодействии, антигеном распознавании, процессинге и презентации антигенов. Конечным вариантом любого иммунного ответа является разрушение патогена или дефектных структур и их элиминация. Основные механизмы разрушения при гуморальном и клеточном вариантах иммунного ответа связаны с фагоцитозом. Дефекты функции фагоцитов могут существенно ухудшить эффективность и адекватность любого вариантов иммунного ответов. Как высокочувствительный индикатор нормы и патологии, фагоциты служат полезным инструментом не только иммунологической, но общеклинической диагностки. В организме человека фагоцитирующую функцию выполняют несколько типов клеток. Прежде всего, это те клетки, которые осуществляют защиту при каких-либо инфекциях и инвазиях - макрофаги, моноциты и нейтрофилы. В меньшей степени она представлена у эозинофилов и базофилов.
Одной из важных задач клинической иммунологии является всесторонняя оценка иммунного статуса. Она включает в себя следующий комплекс основных тестов: оценка фагоцитоза, гуморального иммунитета и системы комплемента, иммунофенотипировашш лимфоцитов, функциональная активность лимфоцитов и оценка интерферонового статуса [Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., 1992]. Изучение показателей фагоцитоза имеет значение в комплексном анализе диагностики как первичных таких как хронической гранулематозной болезни, синдрома Чедиака-Хигаси, дефицита миелопероксидазы, глюкозо-6-фосфатдегидроген.азы, синдроме «ленивых лейкоцитов», нарушение опсонизирующей активности сыворотки крови (дефицит компонента комплемента, гипогаммаглобулинемии) [Вельтищев Ю.Е., 1996, Йегер Л., 1990], так и вторичных иммунодефицитных состояний: часто рецидивирующие гнойные воспалительные процессы, длительно не заживающие раны, склонность к послеоперационным осложнениям [Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1995, Маянский А.Н., Пикуза О.И., 1993]. Но вместе с этим, методические подходы к оценке фагоцитоза являются довольно
трудоемкими и длительными, что не позволяет их широко использовать в клинической лабораторной практике. Современным подходом в изучении структуры и функции клеток является проточная цитометрия, её возможности позволяют также изучать и этапы фагоцитоза. Существующие методы оценки функциональной активности фагоцитов с использованием проточной цитометрии обобщены в ряде обзоров [Van Eeden S.F. et al., 1999, Bjerknes R., Bassoe C.F., 1989, Bassoe C.F., 1984]. Высокая точность, объективность скорость анализа, простота постановки реакции характеризуют изучение фагоцитоза с помощью автоматической проточной цитофлюориметрии.
Цель работы
Оптимизация существующих методов и создание новых подходов к оценке функциональной активности фагоцитов периферической крови с помощью проточной лазерной цитометрии
Задачи исследования:
Оценить значение исследования фенотипа нейтрофилов CD16, CDllb/18, CD32, CD35 в норме и при некоторых патологиях.
Разработать цитометрические методы определения фагоцитарного числа и индекса переваривающей способности лейкоцитов периферической крови в отношении St. aureus.
Отработать методики и оценить корреляцию определения фагоцитарного числа и индекса переваривающей способности фагоцитов по сравнению с классическими микроскопическими методами.
Исследовать фагоцитарное число и индекс переваривающей способности лейкоцитов периферической крови в отношении St. aureus у здоровых доноров in vitro для определения интервалов нормальных значений показателей.
Определить фагоцитарное число и индекс переваривающей способности у пациентов с наследственными и вторичными нарушениями фагоцитарного звена.
Оптимизировать метод оценки бактерицидной активности (внутриклеточный киллинг) фагоцитов с помощью проточной лазерной цитометрии, определить интервалы нормальных значений, оценить бактерицидную активность при наследственных и вторичных нарушениях фагоцитарного звена
Научная новизна
Впервые предложена и внедрена в клиническую практику модифицированная
цнтометрическая методика для оценки фагоцитарного числа лейкоцитов периферической
крови в отношении St. aureus - ФИТЦ+
Впервые предложена и внедрена в клиническую практику модифицированная
цитометрическая методика для оценки определения индекса завершенности фагоцитоза
лейкоцитов периферической крови в отношении St. aureus - ФИТЦ+
С помощью предложенных новых методов исследовано фагоцитарное число лейкоцитов
периферической крови в отношении St. aureus - ФИТЦ+, а также индекса
переваривающей способности фагоцитов в норме и при патологиях, а так же проведена
корреляция между предложенными методами и классическим микробиологическим
методом.
С помощью созданных методов было выявлено резкое снижение фагоцитарного числа
лейкоцитов периферической крови пациентов с ХГБ в отношении St. aureus - ФИТЦ+, при
нормальном уровне поглотительной активности (% фагоцитировавших клеток) и индексе
переваривающей способности. Цитометрические методы оценки фагоцитарного числа и
индекса переваривающей способности фагоцитов позволили выявить, что у пациентов,
страдающих хроническим рецидивирующим фурункулезом, фагоцитарное число ниже
нормы и у некоторых из них значительно снижен индекс завершенности фагоцитоза. При
обследовании пациентов с хроническим гематогенным остеомиелитом обнаружено резкое
снижение фагоцитарного числа лейкоцитов при крайне тяжелом течении заболевания, а
ИПС был снижен у большинства пациентов.
Установлена важность определения внутриклеточного киллинга в динамике, через 1 и 3
часа инкубации, что в ряде случаев позволяет выявить наличие дефекта в фагоцитарном
процессе.
Практическая значимость работы
Цитометрические методы оценки ФЧ и ИПС разработаны в «микроварианте», пригодном для использования в рутинных исследованиях. Получены нормативные значения исследуемых показателей. Высокая степень корреляции (г=0,8) с классическими микроскопическими методами оценки данных показателей свидетельствует об
информативности предложенной методики. Данные методы возможно использовать для поточных исследованиях в лабораториях оснащенных проточным цитофлюориметром или флюоресцентным микроскопом. Предлагаемые цитометрические методы позволяют оценить степень нарушения в функционировании фагоцитарного звена у пациентов с наследственными (первичными) и вторичными иммунодефицитами.
