Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
Глава 2. Характеристика больных. Методы исследования
I. Группы обследованных больных 41
1.1. Группа больных, которым была проведена трансплантация аллогенного костного мозга в миелоаблативном режиме 42
1.2. Группа больных, которым была проведена ТКМ
в режиме пониженной интенсивности 43
II. Методы исследования гемопоэтического химеризма в различных клеточных популяциях 44
П. 1. Выделение клеточных популяций 44
П. 2. Используемые генетические маркеры 47
П. 3. Выделение ДНК 48
II. 4. Условия проведения ПЦР 49
II. 5. Анализ продуктов ПНР 50
П. 6. Оценка полученных данных 51
П. 7. Статистическая обработка данных 52
Глава 3. Результаты исследования 57
I. Результаты клинических исследований 57
I. 1. Результаты ТГСК после кондиционирования в миелоаблативном режиме 57
I. 2. Результаты ТГСК после кондиционирования в режимах пониженной интенсивности 65
II. Результаты лабораторных исследований 73
II. 1. Разделение клеточных популяций, выделение ДНК и выбор информативного молекулярного маркера
Список литературы
II. 2. Гемопоэтический химеризм в клеточных популяция у больных после аллогенной ТГСК
II. 3. Гемопоэтический химеризм и минимальная остаточная болезнь
Обсуждение
Заключение
- Группа больных, которым была проведена трансплантация аллогенного костного мозга в миелоаблативном режиме
- Выделение ДНК
- Результаты ТГСК после кондиционирования в миелоаблативном режиме
- Разделение клеточных популяций, выделение ДНК и выбор информативного молекулярного маркера
Введение к работе
Актуальность проблемы
Аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) широко используется как эффективный метод терапии гематологических заболеваний, солидных опухолей и ряда наследственных болезней с середины 80-х годов XX века. Наибольшее распространение этот метод получил влечении злокачественных заболеваний крови, таких как острые лейкозы, хронический миелолейкоз, лимфопролиферативные заболевания.
Успех аллогеннои ТГСК, тем не менее, ограничивают многочисленные пострансплантационные осложнения, в том числе те из них, которые возникают на фоне сложных клеточных взаимодействий между иммунокомпетентными клетками донора и реципиента, а также клетками органов-мишеней хозяина. К ним относятся отторжение трансплантата, развитие реакций «трансплантат против хозяина» (РТПХ), и «трансплантат против лейкоза» (РТПЛ), возникновение посттрансплантационных рецидивов основного заболевания. Каждое из перечисленных осложнений может привести к гибели больного. Поэтому изучение динамики приживления донорских гемопоэтических стволовых клеток (гемопоэтического химеризма) и определение ее связи с перечисленными осложнениями посттрансплантационного периода играет важнейшую роль для правильной оценки состояния больного и проведения дальнейших лечебных мероприятий.
Следует отметить, что особую актуальность исследование посттрансплантационного гемопоэтического химеризма приобрело в связи с развитием новых подходов к проведению аллогеннои ТГСК: а именно, развитием трансплантации после немиелоаблативных режимов кондиционирования или режимов пониженной интенсивности.
Несмотря на то, что исследование гемопоэтического химеризма после аллогеннои трансплантации проводится в течение многих лет, развитие новых методов ТГСК и использование трансплантации для лечения целого ряда новых патологий выявило, что до сих пор целый ряд вопросов остается нерешенным. Так, например, не определены стандартные сроки и частота исследования гемопоэтического химеризма. Нет так же единого мнения
о важности изучения и отдельного мониторирования химеризма в различных клеточных популяциях, в особенности - популяции Т-лимфоцитов, играющих основную роль в развитии таких посттрансплантационных реакций, как РТПХ и РТПЛ. Также не изучено значение химеризма в популяциях В-лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови после ТГСК и его влияние на персистенцию минимальной остаточной болезни при разных формах гемобластозов. Нет данных проспективных исследований, которые позволили бы выявить значение исследований химеризма ядросодержащих клеток костного мозга реципиентов после ТГСК в сравнении с химеризмом клеточных популяций лейкоцитов периферической крови.
Более того, до настоящего момента нет общего подхода и не выработана единая стратегия по лечению больных в зависимости от типа обнаруженного химеризма в разные сроки после ТГСК при различных заболеваниях. Нет единого мнения о сроках проведения таких терапевтических мероприятий, как отмена иммуносупрессии, трансфузии донорских лимфоцитов (ТДЛ) при обнаружении персистенции хозяйского кроветворения после аллогенной ТГСК.
Таким образом, актуальность работы заключается как в определении закономерностей установления гемопоэтического химеризма после аллогенной ТГСК в разных режимах кондиционирования, так и в детальном изучении роли различных клеточных популяций в течении посттрансплантационного периода у больных разными видами опухолевых заболеваний крови.
Цель исследования: динамическое исследование реконституции кроветворной и иммунокомпетентной ткани у больных гемобластозами после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток
Задачи исследования
1. Изучить зависимость установления типа гемопоэтического химеризма у больных гемобластозами после аллогенной ТГСК от режимов
предтрансплантационного кондиционирования, источника стволовых клеток, основного заболевания, вида профилактики РТПХ.
Определить тип химеризма и темпы его установления в различных клеточных популяциях периферической крови (Т, В- лимфоцитах, гранулоцитах) и в популяции мононуклеаров костного мозга реципиентов аллогенных гемопоэтических стволовых клеток.
Выявить влияние различных типов линейно-специфического химеризма на вероятность развития острой и хронической РТПХ и рецидив основного заболевания после аллогеннои ТГСК.
Изучить взаимосвязь между установлением различных типов химеризма и персистенцией минимальной остаточной болезни у пациентов, перенесших алло-ТГСК
Провести сравнение информативности исследований гемопоэтического химеризма в клеточных популяциях периферической крови и мононуклеарах костного мозга у больных после аллогеннои ТГСК.
Разработать алгоритм ведения пациентов с длительно сохраняющимся смешанным гемопоэтическим химеризмом или убывающим донорским химеризмом после аллогеннои ТГСК с целью профилактики развития посттрансплантационного рецидива.
Научная новизна
В настоящей работе проведено проспективное исследование линейно-специфического гемопоэтического химеризма у больных гемобластозами, перенесших аллогенную ТГСК. Выявлено влияние типа химеризма на развитие важнейших осложнений посттрансплантационного периода (острой и хронической РТПХ, рецидивов основного заболевания). Изучено влияние типа гемопоэтического химеризма на персистенцию остаточного лейкемического клона у больных после аллогеннои ТГСК.
Научно-практическая ценность
Разработан протокол исследования гемопоэтического химеризма и минимальной остаточной болезни у больных после аллогеннои ТГСК
в зависимости от основного заболевания и типа химеризма в разные сроки после трансплантации.
Предложен алгоритм ведения больных с персистирующим смешанным или убывающим донорским химеризмом с использованием отмены иммуносупрессии и проведением трансфузий донорских лимфоцитов (ТДЛ) как методов профилактики посттрансплантационного рецидива.
Положения, выносимые на защиту
Восстановление донорского гемопоэза после аллогенной ТГСК происходит во всех исследованных популяциях клеток вне зависимости от примененного режима кондиционирования (миелоаблативного или пониженной интенсивности).
Определение смешанного гемопоэтического химеризма в любой клеточной популяции является фактором высокого риска развития посттрансплантационного рецидива.
3. Исследование типа химеризма в раздельных клеточных популяциях
(а именно - в остаточной популяции мононуклеаров периферической крови)
позволяет выявить группу пациентов с наибольшим риском развития
посттрансплантационных рецидивов.
Быстрое установление полного донорского химеризма во всех клеточных популяциях и его длительное и продолжительное существование коррелирует с развитием острой РТПХ у подавляющего большинства пациентов.
Разработанный алгоритм ведения больных со смешанным гемопоэтическим химеризмом позволяет предотвратить развитие рецидива у большинства пациентов.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, 1 работа находится в печати.
Апробация диссертации
Основные положения работы доложены на Международной Гематологической школе «Лейкозы и лимфомы. Терапия и фундаментальные исследования». (Москва в 2003г, в 2005г, в 2007г.), Всероссийском декаднике по гематологии (Москва, 2006г.)
Объем и структура работы
Группа больных, которым была проведена трансплантация аллогенного костного мозга в миелоаблативном режиме
Таким образом, излучающий флюорохром освобождается из-под действия гасителя и может быть зарегистрирован прибором. С увеличением количества ПЦР-продукта с каждым циклом происходит соответствующее увеличение количества регистрируемых сигналов (99).
При исследовании химеризма метод РВ-ПЦР в основном используется для количественного анализа генов, расположенных на Y-хромосоме, что позволяет идентифицировать крайне малое количество мужской ДНК на фоне женской (64,118). По данным Thiede et al., чувствительность метода составила 1x105 (170). Такое повышение чувствительности позволяет определять клетки реципиента практически у всех пациентов после ТКМ. Однако, до сих пор неясно клиническое значение существования столь малого количества хозяйских клеток. Поэтому исследование химеризма только этим методом не может однозначно трактоваться неопытными клиницистами (118). Следует иметь в виду, что этот метод может быть использован только для пациентов мужского пола, которым проведена ТКМ от доноров-женщин, а частота таких трансплантации составляет менее 50% случаев.
В последние годы появились работы, авторами которых использовалась техника РВ-ПЦР для идентификации участков генома, отличающихся полиморфизмом по одному нуклеотиду (SNP). Для этих участков характерно биаллельное распределение, их частота встречаемости составляет 1 на каждые 1,3 кб. Alizadeh et al. первыми опубликовали работу, в которой с целью исследования химеризма использовали амплификацию в ПНР в реальном времени 11 таких локусов (12). Чувствительность метода позволила выявить 1 клетку реципиента на 100 клеток донора. Работы других исследователей подтвердили возможность использования данного метода для количественного изучения химеризма (71,119). Однако метод имеет существенные ограничения. Во-первых, с помощью ограниченного набора SNP идентификация различий оказалась возможной лишь для 90% пар донор/реципиент (55,117,172). Для увеличения информативности следует использовать более широкую панель SMP. Во-вторых, особенности метода позволяют проводить точную количественную оценку лишь в случаях очень малого содержания ДНК реципиента (донора) в образце. Коэффициент вариабельности от 30% до 50% при содержании более 5% клеток реципиента в образце не позволяет использовать этот метод, в принятом на сегодняшний день техническом исполнении, для динамических исследований химеризма после ТГСК. Совершенствование технологии РВ-ПЦР должно сделать маркеры SNP более привлекательными. //. 5. Исследование образцов костного мозга и/или периферической крови. Исследования фракционированных клеточных субпопуляций
До сих пор не существует единого мнения, какой же из материалов должен быть использован для изучения посттрансплантационного химеризма с целью достижения наибольшей эффективности и достоверности результатов. Существуют доводы в пользу исследования как образцов костного мозга, так и фракционированных популяций лейкоцитов периферической крови (14). С одной стороны считается, что анализ образцов костного мозга позволяет получить больше информации о возможной персистенции минимальной остаточной болезни (МОБ) в тех случаях, когда клетки злокачественного клона отсутствуют в периферической крови. При этом, все же, надо учитывать, что чувствительность большинства методов исследования химеризма в тотальной популяции клеток костного мозга пока не превышает 1%, и, таким образом, они не могут служить адекватной заменой методам специфической детекции аномального клона, таким, как ГЩР на характерные хромосомные аномалии или мультипараметрическая цитофлюорометрия. Более того, методы исследования химеризма не в состоянии отличить хозяйские клетки нормального гемопоэза от остаточных опухолевых клеток.
В пользу исследований фракционированных популяций клеток периферической крови говорит не только возможность изучения химеризма отдельных клеточных линий, но и существенное повышение чувствительности метода. Так, зачастую, у пациента после ТГСК количество Т-клеток в периферической крови может не превышать 10% (а в костном мозге -3%). В этой ситуации исследование нефракционированных образцов крови и/или костного мозга может не выявить смешанного химеризма в Т-клеточной популяции, который, по некоторым данным, может иметь существенное значение для развития посттрансплантационных рецидивов. Попытки найти особенности становления донорского химеризма в различных клеточных субпопуляциях предпринимаются в течение последних 10-15 лет. Одними из первых попытались изучить кинетику восстановления донорского химеризма по клеточным субпопуляциям Childs R и соавт. Исследователи посчитали необходимым проанализировать восстановление миелоидной и лимфоидной клеточных фракций у больных после аллоТГСК. Ими было показано, что полный донорский химеризм в популяции Т-лимфоцитов достигается раньше, чем в субпопуляции гранулоцитов. В то же время авторы показали, что при быстро нарастающем донорском химеризме в Т-клеточной популяции повышается риск развития РТПХ и усиливается РТПЛ (45). С другой стороны, Keil с коллегами проанализировали 38 пациентов с различными злокачественными гематологическими заболеваниями после кондиционирования флюдарабином и тотального облучения и оценили динамику установления Т-клеточного донорского химеризма на 28 день. Оказалось, что в этой группе больных полный донорский химеризм в Т-лимфоцитах возникает позже, чем во фракции гранулоцитов. Кроме того, авторы определили, что риск развития рецидива возрастает при определении смешанного химеризма в популяции Т-лимфоцитов в ранние сроки (98). Несколько позже Baron и соавторы продемонстрировали, что в первые несколько месяцев после алло-ТГСК различные клеточные субпопуляции, такие как Т-лимфоциты, моноциты, НК, восстанавливаются примерно с одинаковой скоростью, значительных различий найдено не было. Однако было обнаружено, что кинетика появления донорского химеризма в Т-клеточной популяции зависит от варианта злокачественного гематологического заболевания. Так, у пациентов с лимфоидными опухолями и ОМЛ достижение полного донорского химеризма отмечалось гораздо чаще и в более ранние сроки, чем у больных с МДС и ХМЛ (28).
Такое разнообразие данных может быть объяснено, в первую очередь, включением в каждое исследование небольшого количества пациентов. Кроме того, надо учитывать значительную разнородность групп (различные заболевания, режимы кондиционирования разной интенсивности, разный возраст больных).
Выделение ДНК
С целью изучения динамики приживления костного мозга и гемопоэтического химеризма у больных после аллогенной трансплантации в работе был использован метод амплификации гипервариабельных участков генома с помощью ПЦР.
Для исследования приживления костного мозга у больных после трансплантации были выбраны фрагменты ДНК, которые могли бы служить индивидуальными маркерами, позволяющими эффективно отличать клетки донора от клеток реципиента - гипервариабельные участки генома с изменяющимся числом копий (hypervariable number of tandem repeats - VNTR и short number of tandem repeats - STR) (33,147,181).
Исследовались 4 гипервариабельных локуса: APO-B - VNTR в 3 фланкирующем регионе гена аполипопротеина В на 2 хромосоме (2р23-р24), pYNZ 22 - VNTR в локусе D17 S30 на 17 хромосоме в локусе 17р13, рМСТ 118, находящийся в локусе D1S80 на 1 хромосоме, рЗЗ.6 , расположенный в локусе D1S11 на коротком плече той же хромосомы, а также гены, локализованные на 1 хромосоме (ZP3) и Y хромосоме (SRY), используемые при идентификации половой принадлежности исследуемых клеток (при разнополых трансплантациях). Выбор указанных участков определялся следующими условиями: 1) размер амплифицируемых фрагментов не должен превышать 2 Кб; 2) информативность каждого фрагмента (т.е. процент различий между аллелями у разных индивидуумов в исследуемой популяции) должна быть достаточно высока, чтобы позволить эффективно различать между собой ДНК донора и реципиента 3) степень гетерозиготности (т.е. число аллелей данного локуса в популяции) также должна быть достаточно высокой для определения различий между донором и реципиентом. Краткая характеристика каждого локуса и нуклеотидный состав праймеров представлены в таблице 5.
Кроме того, при отсутствии информативной метки по вышеуказанным VNTR исследовались 6 локусов, содержащих STR. Характеристика этих локусов представлена в таблице 6. Синтез праймеров проводился согласно описанным ранее методикам фирмой Syntol (Россия) (103). Правильность олигонуклеотидных последовательностей праймеров была проверена при помощи программы BLAST в GenBank fwww.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank.html).
Для выделения геномной ДНК использовались ранее изолированные субпопуляции лейкоцитов периферической крови и миелокариоциты костного мозга реципиентов и доноров костного мозга. Первое исследование выполнялось до проведения ТКМ с целью определения генетического маркера, достаточно информативного для дальнейшего наблюдения.
Выделение ДНК осуществлялось из упомянутых выше ядросодержащих клеток после селективного лизиса эритроцитов 0,8% раствором NH4CI; обработки клеточной суспензии в буфере STE додецил-сульфатом Na (0,5%) и дальнейшей инкубации в присутствии протеиназы К (200 мкг/мкл) в течение ночи в термостате при 37 С. Далее проводилась фенольная экстракция ДНК. После осаждения равным объемом изопропилового спирта в присутствии 0,1 объема ЗМ раствора ацетата Na (рН 2,5) и двукратного промывания 70% этанолом, ДНК подсушивалась и растворялась в деионизированной воде до концентрации 0,1-0,2 мкг/мл. Контроль концентрации ДНК проводился на спектрофотометре (Genesys 10 U/V, Thermo Electronic Corporation)
Объем реакционной смеси составлял 25-50 микролитров. В состав реакционного буфера входили: 50мМ Трис-HCl (рН 8,9 при 25С), 16мМ сульфата аммония, 10 мкМ ЭДТА, ЮмМ 2-меркаптоэтанола, 170мкг/мл БСА, смесь основных четырех dNTP с концентрацией 1мМ для каждого и по 30 мМоль/л каждого из праймеров. Концентрация MgCb варьировала и составляла от 4,0 мМоль/л для локуса АроВ, pYNZ2, рМСТ 118, ZP3, SRY, до 2,0 мМоль/л для локуса рЗЗ.6 и всех STR соответственно. В реакционную смесь вносилось 2-2,5 ЕД термостабильной полимеразы Taq (фирмы Promega) и 0,4-0,8 мкг исследуемой ДНК. Температурные режимы представлены в таблице 7. В ряде случаев использовалась методика hot-start, предусматривающая предварительную денатурацию ДНК от 5 до 10 мин и далее - продолжение амплификации после внесения смеси, содержащей праимеры и Taq-полимеразу. Этот метод использовался при амплификации всех STR и локуса YNZ22 и позволял избежать характерных для воспроизведения этих локусов погрешностей: неспецифической посадки праймеров, образования «петель», обусловленных схлестыванием продуктов амплификации за счет полной или частичной комплементарности конечных участков фрагментов. Амплификация проводилась с помощью автоматических термоциклеров "Hybaid Sprint" (Hybaid, Великобритания) и Терцик (ДНК-Технологии, Россия). В качестве контрольных образцов при каждой амплификации использовались: первичный материал донора, первичный материал реципиента, пустой контроль, не содержащий матрицы (для исключения ложноположительных результатов). Чувствительность метода определялась с помощью разведений от 100 до 0,5% исследуемой ДНК (например, реципиента) в другой ДНК (например, донора).
Результаты ТГСК после кондиционирования в миелоаблативном режиме
Для всех больных после ТКМ контрольными сроками для исследования клеточного происхождения кроветворения были +30, +60, +90 дни и далее каждые 3 месяца в течение первого года наблюдения. У каждого пациента забирались образцы костного мозга и периферической крови. Исследовались следующие клеточные популяции: гранулоциты, Т-лимфоциты (несущие маркер CD3), В-лимфоциты (несущие CD 19) и остаточная клеточная популяция мононуклеаров после отделения Т и В-лимфоцитов. Эти клеточные популяции выделялись из периферической крови. Также в исследовании использовался костный мозг без разделения на клеточные популяции. Таким образом, в каждый срок исследования у каждого больного проводилось определение химеризма 5 клеточных линий.
По необходимости (при отмене иммуносупрессии, трансфузиях донорских лимфоцитов, проведении ПХТ по поводу рецидива) образцы костного мозга и периферической крови забирались чаще. В среднем каждому больному было выполнено 8 исследований периферической крови и костного мозга (от 1 до 12).
Во всех случаях периферическая кровь была успешно разделена на клеточные популяции и было выделено достаточное количество ядросодержащих клеток для проведения ПЦР анализа. Среднее количество выделенных клеток составило 25,4 х106 (от 1,2 до 74 х 106). Данные выделения по фракциям приведены в таблице № 15. Также во всех случаях были успешно получены мононуклеары из костного мозга.
Первоначально (до проведения трансплантации) были обследованы донор и реципиент из каждой пары с целью поиска диагностической метки. Для исследования приживления костного мозга у больных после трансплантации было выбрано 10 гипервариабельных участков ДНК, а также гены, используемые для идентификации пола. Исследовались 4 гипервариабельных локуса VNTR: АРО-В, pYNZ, рМСТ 118, рЗЗ.6, а также гены, локализованные на хромосоме - zona pellucida gene (ZP3) и Y хромосоме - testis determination gene (SRY), используемые при идентификации половой принадлежности исследуемых клеток (при разнополых трансплантациях). При отсутствии информативной метки по вышеуказанным VNTR исследовались 6 локусов, содержащих STR. Подробное описание хромосомной локализации исследуемых локусов, последовательностей праймеров и условий ПЦР приведено в главе «Материалы и методы».
Поиск информативного локуса является ключевым моментом для анализа гемопоэтического химеризма после ТСКК. Идеальным вариантом считается выявление маркера, несущего аллели, специфические как для донора, так и для реципиента. В этом случае возможно достаточно точно определять в исследуемом образце присутствие ДНК донора и реципиента как качественно, так и количественно. Менее удачным считается обнаружение локуса, несущего одну аллель, общую для донора и реципиента, и другую, специфичную только для реципиента. В этом случае невозможно точно определить степень донорского химеризма, однако возможно выявление ДНК хозяйского типа на ранних этапах, что позволяет предположить отторжение трансплантата или рецидив заболевания. Третьим вариантом является идентификация локуса, имеющего аллель, специфичную для донора и общую аллель для донора и реципиента. В этом случае возможно судить о полном или частичном приживлении донорских стволовых клеток крови, однако невозможно выявить собственную ДНК хозяина (163). В нашей работе для оценки степени химеризма использовались только локусы, несущие индивидуальные аллели, характерные для донора и реципиента, или локусы, имеющие аллели, характерные для реципиента
Во всех случаях (31) были найдены информативные метки для оценки донорского приживления трансплантата. Информативность каждого молекулярного маркера была указана в таблице № 5 в главе материалы и методы. На следующей таблице показана частота встречаемости различных молекулярных маркеров в нашем исследовании. У пятерых человек было найдено по 2 информативных молекулярных маркера. Таблица № 16. Частота встречаемости выбранных информативных меток.
В результате проведенного исследования образцов костного мозга и клеточных фракций лейкоцитов периферической крови у 17 больных был выявлен полный донорский химеризм во всех клеточных популяциях с +30 дня в течение всего времени наблюдения. У 14 пациентов был выявлен смешанный химеризм хотя бы в одной из клеточных популяций, причем в одном из этих случаев был выявлен расщепленный химеризм.
С помощью статистического анализа мы пытались выявить зависимость наступления полного донорского или смешанного химеризма от ряда факторов, таких как пол, возраст, тип заболевания реципиента, режим кондиционирования, источник стволовых клеток, зависимость от ранее проведенных курсов химиотерапии. Также мы пытались найти связь между установлением смешанного или полного донорского химеризма и такими событиями после посттрансплантационного периода, как рецидив основного заболевания, развитие острой или хронической РТПХ, смерть. II. 2. 1. Зависимость типа гемопоэтического химеризма от предтрансплантационных факторов
Первоначально мы пытались установить зависимость типа гемопоэтического химеризма от таких важных факторов, как режим предтрансплантационного кондиционирования и основное заболевание пациента, однако, несмотря на некоторое преобладание случаев полного химеризма в группе больных после ТГСК в режимах пониженной интенсивности, статистически значимых различий выявлено не было. Полученные данные представлены в таблице № 17.
Разделение клеточных популяций, выделение ДНК и выбор информативного молекулярного маркера
Особое значение выявленная ассоциация полного донорского химеризма с развитием РТПХ имела для группы больных после ТГСК в низкодозном режиме кондиционирования. Как уже упоминалось ранее, хроническая РТПХ у этих пациентов имеет некоторые отличия от такого же осложнения у больных, перенесших ТГСК в стандартных режимах (поздние сроки возникновения, длительное торпидное течение). Высокая степень корреляции полного донорского химеризма с РТПХ послужила еще одним фактором в пользу модификации режима профилактики этого осложнения - добавлению третьего препарата (мофетил микофенолата) к стандартной схеме. Регулярный контроль гемопоэтического химеризма в этой ситуации имеет решающее значение. Похожие данные, полученные другими группами исследователей, также являлись поводом для изменения схемы профилактики РТПХ. В основном предлагается удлинение сроков иммуносупрессии при выявлении стабильного донорского химеризма (78,155).
Одной из задач исследования было также изучение влияния типа донорского химеризма на существование клеток остаточного леикемического клона, выявляемых с помощью молекулярно-биологических и цитогенетических методов. В группе обследованных больных минимальная остаточная болезнь могла быть отслежена менее чем в половине случаев — у 13 больных из 31. Причиной этого являлось либо отсутствие данных о возможных хромосомных аберрациях в клетках леикемического клона, либо отсутствие этих аберраций при первичном обследовании пациента. К сожалению, мы не имели возможности отслеживать МОБ у пациентов с помощью метода мультипараметрическои проточной цитофлюорометрии по тем же причинам.
При обследовании этой немногочисленной группы больных мы выявили высокую степень корреляции полного донорского химеризма с отсутствием признаков МОБ. У 8 пациентов с полным донорским химеризмом по всем клеточным популяциям в течение всего срока наблюдения никогда не выявлялись генетические аберрации, свойственные лейкемическому клону. Эти результаты, в целом, соответствуют данным литературы (122,192,193). Разумеется, малое количество больных не позволяет нам сделать однозначные выводы о возможной эрадикации лейкемических клеток у больных с полным донорским химеризмом после ТГСК, особенно учитывая данные, подтверждающие возможность рецидива болезни на фоне стабильного донорского химеризма. Следует отметить, что у всех этих пациентов отмечалось развитие хронической РТПХ, что может свидетельствовать об эффективном иммунологическом контроле над опухолевым клоном.
В то же время, у 5 больных со смешанным химеризмом исследование минимальной резидуальной болезни показало неоднозначные результаты. Так, у двоих пациентов с убывающим донорским химеризмом специфические аберрации определялись в течение всего времени существования смешанного химеризма. Хотя эти наблюдения можно отнести к единичным, тем не менее, они отражают, как нам кажется, важность динамического наблюдения за приживлением трансплантата. Корреляция выявления и нарастания МОБ одновременно с убыванием донорских клеток у пациентов со смешанным гемопоэтическим химеризмом была отмечена ранее в ряде исследовательских работ (19,20,142). Как правило, в дальнейшем у этих больных наступал рецидив заболевания, если не проводились определенные терапевтические манипуляции (отмена иммуносупрессии и ТДЛ). Одного из наших больных после отмены иммуносупрессии признаки МОБ определялись все время существования смешанного химеризма и перестали определяться в одно и тоже время с установлением полного донорского химеризма. У второго пациента не было ответа на терапию донорскими лимфоцитами, а признаки МОБ определялись постоянно, как и смешанный химеризм.
Учитывая полученные нами данные, мы попытались разработать рекомендации по срокам и показаниям исследования химеризма у пациентов после трансплантации аллогенного костного мозга.(схема №1)
Интересным феноменом является также обнаружение стабильного смешанного химеризма во всех популяциях кроме остаточной без признаков МОБ. Такую картину мы наблюдали у 3 пациентов с ХМЛ до 9 месяцев после ТГСК. Химерный транскрипт bcr/abl не определялся ни с помощью количественного (ПНР в реальном времени), ни с помощью качественного (гнездная ОТ-ПЦР) методов. Ни у одного из этих пациентов не возник рецидив заболевания и у всех из них к 12 месяцам после ТГСК установился полный донорский химеризм.
Подобные случаи были описаны в ряде публикаций (49,151,153). Однако значение этого феномена до сих пор не до конца ясно. Большинство исследователей сходится во мнении, что в условиях развития посттрансплантационной толерантности возможно временное существование нормальных гемопоэтических клеток хозяина в ранние сроки после ТГСК (151,153,166) и далеко не всегда оно ведет к развитию рецидива заболевания. Это более характерно для пациентов с заболеваниями с низкой кинетикой опухолевого клона, такими как ХМЛ, и при условии стабильного или нарастающего донорского химеризма (143). Тем не менее, всеми исследователями отмечается, что крайне важным является постоянное одновременное динамическое наблюдение как за гемопоэтическим химеризмом, так и за МОБ во все сроки после ТГСК.
Исследование химеризма в селектированных клеточных популяциях, в качестве суррогатного метода определения МОБ возможно, видимо, лишь в ограниченном числе случаев. Наиболее приемлемой является, скорее всего, селекция клеток с использованием специфических антител (CD 138 у больных множественной миеломой), или антител, выявляющих ранние клетки-предшественницы гемопоэза (CD 34+).
