Введение к работе
Актуальность проблемы. Эпидемия дифтерии 90-х годов в России, вызванная циркуляцией в популяции высокотоксигенного возбудителя и значительной неиммунной прослойки среди населения, характеризовалась манифестностью развития процесса, увеличением числа осложнений и летальных случаев (Максимова Н.М., Маркина С.С, 1995; Корженкова М.П., Малышев Н.А. и др. 1995; Galazka A.M., 1996; Костюкова Н.Н., 1999). Пассивная специфическая иммунотерапия больных дифтерией основывается на использовании антитоксической сыворотки, получаемой из крови гипериммунизированных лошадей. Особенности эпидемии требовали коррекции ургентной терапии, прежде всего увеличения доз и кратности введения антитоксина (от 100 тыс. до 2500 тыс. ME) в зависимости от тяжести заболевания и срока начала лечения (Корженкова М.П. и др., 1995, 1996, 2002; Платонова Т.В., Костинов М.П., 1997). Такие меры наряду с экстракорпоральной и инфузионной детоксикацией позволили в несколько раз снизить летальность при наиболее тяжелых вариантах токсической дифтерии, включая гипертоксическую, которая ранее в 80 - 100% случаев приводила к смерти (Берко А.И. и др. 2006).
Еще в 20-х годах прошлого века экспериментальным путем доказана целесообразность поддержания высокой концентрации антитоксина при заражении летальными дозами дифтерийного токсина (Гамалея Н.Ф., 1939). Однако, ряд специалистов резко возражают против увеличения доз противодифтерийной сыворотки (ПДС) при лечении наиболее тяжелых форм токсической дифтерии и связывают рост и тяжесть осложнений, развитие сывороточной болезни, запуск аутоиммунных механизмов, а также учащение случаев летального исхода, с длительным и многократным введением гетерологичного белка в виде ПДС (Матохина А.Г., 1996; Турьянов М.Х., 1996; Ющук Н.Д., 2003). На практике достаточность введенной больным сыворотки определяют по клинической картине - значительному
уменьшению токсикоза, отека слизистых оболочек, налетов и лимфаденита (Фаворова Л.А., 1988; Корженкова М.П. и др., 2002).
В связи с обозначенной проблемой создание метода, позволяющего оценить содержание гетерологичного антитоксина в крови пациентов, и выявление возможной взаимосвязи между этим показателем и тяжестью осложнений, представляется актуальным для коррекции объема и продолжительности лечения сывороткой.
Метод ИФА дает представление о содержании антител специфичных к различным эпитопам молекулы ДТ независимо от их эффекторных свойств, в то время как тест нейтрализации на биологической модели - клетках СНО (Chinese hamster ovary cells) свидетельствует об общей токсиннейтрализующей активности сыворотки независимо от видовой принадлежности антител. Результаты определения гетерологичного антитоксина в ИФА и эффекторной активности антител позволят выяснить уровень содержания и характер элиминации гетерологичного иммуноглобулина и протективных антител в зависимости от количества ПДС и тяжести интоксикации у больных токсической дифтерией.
Для лечения больных применяют ПДС разных производителей, поэтому представляет интерес сравнение образцов используемых лошадиных сывороток иммунохимическими методами. В настоящее время при контроле промышленного производства дифтерийного антитоксина используются метод Ремера на морских свинках и реакция флокуляции. Хотя для оценки дифтерийного антитоксина существуют более совершенные тесты (Miyamura К., 1974; Murphy J.R., 1978; Свиридов В.В., 1995).
Цель работы:
Изучение особенностей пассивного противодифтерийного иммунитета с помощью иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител (МкАт) и теста микроцитотоксичности у больных токсической дифтерией
Задачи исследования
1. Создать метод количественного определения лошадиного антитоксина в
сыворотке крови больных дифтерией, получавших специфическую
серотерапию:
а) получить МкАт к F(ab')2 фрагментам иммуноглобулинов лошади,
изучить их иммунохимические свойства;
б) синтезировать пероксидазный конъюгат на основе МкАт
в) изучить аналитические характеристики разработанного теста
-
Провести динамическое наблюдение за содержанием гетерологичного антитоксина и протективных антител в сыворотке крови больных дифтерией.
-
Сопоставить данные клинической эффективности серотерапии с уровнем дифтерийного антитоксина в сыворотке крови больных токсическими формами дифтерии в период развития осложнений.
-
Исследовать активность противодифтерийных лошадиных сывороток в культуральном и иммунохимических тестах.
Научная новизна
1. Получены моноклональные антитела специфичные к легким цепям
иммуноглобулина лошади.
2. Впервые разработан иммуноферментный анализ для оценки концентрации
гетерологичного противодифтерийного антитоксина в сыворотке больных,
подвергнутых серотерапии.
-
Установлено отсутствие зависимости между тяжестью осложнений и уровнем лошадиных антитоксических антител у больных токсической дифтерией в период риска развития дифтерийных осложнений.
-
Предложены способы оценки противодифтерийных антител в образцах ПДС с использованием иммунохимических (ИФА, иммуноблотинг) и культурального методов.
Практическая значимость работы
-
Моноклональные антитела к легким цепям лошадиного иммуноглобулина могут быть использованы для оценки свойств и дополнительной характеристики широкого спектра антитоксических препаратов, на основе лошадиного иммуноглобулина, а также для идентификации ряда бактериальных экзотоксинов с помощью соответствующих антитоксинов.
-
Разработанный иммуноферментный метод количественного определения гетерологичного антитоксина в сыворотке крови больных токсическими формами дифтерии в ходе серотерапии может быть использован для контроля содержания и оценки достаточности доз ПДС.
-
Получены подтверждения правомочности использования высокодозовой серотерапии больных токсической и гипертоксической дифтерией в сочетании с сеансами плазмафереза и общепринятой базовой терапией.
Публикации Основные положения диссертации отражены в 6 печатных работах.
Апробация работы Материалы, изложенные в диссертации доложены: на X Всероссийском научном форуме им. академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2006), на заседании секции медицинской и фармацевтической микробиологии московского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (2007), на IV объединенном иммунологическом форуме в Санкт-Петербурге (2008).
Диссертация апробирована на научной конференции отдела иммунодиагностики НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.
Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 97 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, пять глав результатов и их обсуждение, заключения, выводов и списка литературы, включающего 162 источника, из которых 106 на русском языке. Работа иллюстрирована 15 рисунками и 8 таблицами.
![Клинико-экспериментальное изучение нарушений иммунитета при гнойном холангите [Электронный ресурс]](/i/i/4277/200355.png "Клинико-экспериментальное изучение нарушений иммунитета при гнойном холангите [Электронный ресурс] Ярош Андрей Леонидович")
