Содержание к диссертации
СОКРАЩЕНИЯ, ПРИНЯТЫЕ В ТЕКСТЕ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
Открытие естественных регуляторных Т-клеток 9
Свойства и функция естественных регуляторных Т-клеток 11
Фенотип естественных регуляторных Т-клеток 11
Ген F0XP3 и его продукт - транскрипционный фактор FOXP3 13
Онтогенез и развитие естественных регуляторных Т-клеток в тимусе. 15 Развитие, активация и функция естественных регуляторных Т-клеток в
периферическом отделе иммунной системы 18
Развитие регуляторных Т-клеток в периферическом отделе иммунной
системы 18
Активация регуляторных CD4+CD25+FOXP3+Т-клеток 21
Проявления функциональной активности регуляторных Т-клеток 24
Место естественных регуляторных клеток в нормальных иммунных
процессах 27
Иммунологическая толерантность 27
Иммунный ответ 28
Беременность и развитие плода 30
Роль естественных регуляторных Т-клеток в патологии 31
Аутоиммунные процессы 33
Иммунодефицитные состояния 35
Злокачественные опухоли 36
Аллергия 37
Перспективы практического применения регуляторных Т-клеток 40
ГЛАВА П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 44
Характеристика обследованных больных 44
Общеклиническое обследование 45
Аллергологическое обследование 45
Реактивы, расходные материалы, оборудование 46
Источники клеток, выделение мононуклеаров и культивирование клеток... 47
Фенотипический анализ клеток на проточном цитофлуориметре 48
Фракционирование лимфоцитов при помощи иммуномагнитных микробу с 50
Оценка пролиферативного ответа 51
Оценка экспрессии мРНК FOXP3 и ряда цитокинов в клетках
периферической крови методом полимеразной цепной реакции 52
Оценка экспрессии мРНК FOXP3 (качественная реакция) 52
Оценка экспрессии мРНК FOXP3 и ряда цитокинов (IL-4, 6, 10, 17, TGF|3, INFy) методом ПНР в режиме «реального времени»
(количественная реакция) 53
Программное обеспечение 57
Методы статистической обработки 57
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 58
Клинико-анамнестическая характеристика и аллергологический статус
обследованных детей 58
Состояние Т-клеточного звена иммунитета, экспрессия цитокинов в норме и
при аллергии 61
Состояние Т-клеточного звена иммунитета и уровень эозинофилов .... 61
Исследование баланса ТЫ- и Тп2-лимфоцитов 62
Исследование естественных регуляторных Т-клеток и их молекулярного
маркера FOXP3 в норме и при аллергии 65
Исследование цитокинов, влияющих на экспрессию FOXP3 или зависящих
от этого фактора 72
Онтогенез естественных регуляторных Т-клеток и их молекулярного
маркера FOXP3 83
Выявление Treg в органах плодов человека 83.
Онтогенез Treg в постнатальном периоде в норме и при аллергии 86
Индукция фенотипа Treg в культурах клеток кроветворных органов плода.90
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 96
ВЫВОДЫ 100
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 101
БЛАГОДАРНОСТИ 119
СОКРАЩЕНИЯ, ПРИНЯТЫЕ В ТЕКСТЕ
ИГКС - ингаляционные глюкокортикостероиды
МНПК - мононуклеары периферической крови
МАТ - моноклональные антитела
ОТ - обратная транскрипция
ПКС - полная культуральная среда
ПНР - полимеразная цепная реакция
ТЭК - тимо-эпителиальные клетки
DEPC - diethyl pyrocarbonate (диэтилпирокарбонат)
EDTA - ethylenedinitnlotetraacetic acid (этилендиаминтетрауксусная кислота)
FCS - fetal calf serum (эмбриональная телячья сыворотка)
FITC - fluoresceine isothiocyanate (флюоресцеин-5-изотиоцианат)
GAPD - glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (глицеральдегид-3-фосфат
дегидрогеназа)
HPRT1 - hypoxanthine phosphoribosytransferase (гипоксантин
фосфорибозилтрансфераза)
IL - interleukin (интерлейкин)
INFy - interferon-gamma (интерферон-у)
PBS -phosphate buffer saline (фосфатно-солевой буфер)
РЕ - phycoerythrin (фикоэритрин)
PHA - phytohemagglutinin (фитогемагглютинин)
PMA - phorbol-12-myristat-13-acetate (форбол-12-миристат-13 -ацетат)
TBE Buffer- Tris-borate-EDTA buffer (трис-боратный буфер)
TGF(3 - transforming growth factor-beta (трансформирующий фактор роста-Р)
Treg - естественные регуляторные Т-лимфоциты
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Важную роль в предотвращении патологического иммунного ответа на собственные антигены организма и ограничении нежелательных форм иммунного ответа (на антигены плода, пищи и т.д.), играют регуляторные Т-клетки. Наиболее полно изучены естественные регуляторные Т-клетки (Treg), маркерами которых служат мембранные молекулы CD4, CD25, CTLA-4 и внутриклеточный транскрипционный фактор FOXP3. Основной мишенью Treg служат хелперные Т-лимфоциты.
Со времени открытия естественных регуляторных Т-клеток в. 1995 г. [144] они неизменно находятся в центре внимания исследователей. На международных иммунологических форумах им посвящается наибольшее число сообщений. Они являются предметом рассмотрения в. многочисленных обзорных статьях. Столь пристальное внимание исследователей к проблеме естественных регуляторных Т-клеток обусловлено не только важностью их функций, но и широким кругом практически значимых проблем, с которыми так или иначе связаны эти клетки. Основным проявлением тотального дефицита регуляторных Т-клеток является формирование полиспецифических аутоиммунных процессов с преимущественным поражением эндокринных органов и кишечника (ІРЕХ-синдром). Еще одним следствием их дефицита является нарушение нормального течения беременности и невынашивание плода. С другой стороны, избыточная активность регуляторных Т-клеток чревата повышением риска онкологических заболеваний и ослаблением противоинфекционной защиты.
Изучение Treg ведется чрезвычайно интенсивно во всех основных иммунологических центрах мира. Это в равной степени относится к фундаментальной и прикладной составляющей исследований. В последние годы четко определилась направленность этих исследований на применение Treg с целью иммунотерапии аутоиммунных заболеваний, а также предотвращения реакции трансплантат-против-хозяина при пересадках костного мозга (начаты клинические испытания). Исследование роли Treg в патогенезе аллергических заболеваний осуществляется в более ограниченном масштабе.
Таким образом, актуальность тематики работы обусловлена исключительно важной и разносторонней ролью, которую играют Treg в физиологии и патологии иммунной системы, их ключевым местом в патогенезе многих заболеваний и возможностью их использования как средства иммунотерапии этих заболеваний.
Цель исследования
Изучить содержание естественных регуляторных Т-клеток и закономерности экспрессии их молекулярного маркера FOXP3 и ряда цитокинов, влияющих на экспрессию FOXP3 или зависящих от этого фактора, в лимфоцитах крови в норме и при аллергии у детей.
Задачи исследования
Исследовать содержание естественных регуляторных Т-клеток и FOXP3 в норме и при аллергии у детей в периоды обострения и ремиссии, определить их функциональную активность.
Изучить влияние медикаментозного лечения (ингаляционных глюкокортикоидов) на содержание Treg.
Исследовать уровни цитокинов (IL-6, IL-10, IL-17 и TGFP), влияющих на экспрессию FOXP3 или зависящих от этого фактора.
Изучить онтогенез естественных регуляторных Т-клеток и их молекулярного маркера FOXP3 в норме и при формировании аллергии.
Усовершенствовать методы культивирования Treg; изучить возможность дифференцировки Treg из кроветворных и лимфоидных клеток-предшественников под влиянием эпителия тимуса.
Научная новизна работы
Работа содержит новые данные о дефекте субпопуляции Treg у детей с аллергией. Установлено, что при аллергических заболеваниях независимо от их конкретной нозологии, тяжести, сенсибилизации и уровня общего IgE в крови повышено процентное содержание естественных регуляторных Т-клеток при значительном снижении их функциональной активности. Показано, что у детей без аллергии содержание Treg постепенно снижается с возрастом, тогда как при
7 аллергии численность этих клеток снижается лишь до 6 лет, а затем стабилизируется. Впервые изучен уровень экспрессии гена FOXP3 у детей с аллергией.
Показано, что ингаляционное применение кортикостероидов при астме приводит к повышению экспрессии FOXP3, что может рассматриваться как один из механизмов их терапевтического действия.
Впервые установлены взаимоотношения экспрессии FOXP3 и генов цитокинов, участствующих в реализации действия регуляторных Т-клеток и препятствующих ему.
Высказана гипотеза, что первичное изменение Treg при аллергии состоит в ослаблении их функции; в тех случаях, когда этот дефект полностью или частично компенсируется за счет повышения численности клеток, развивается ремиссия; отсутствие компенсации обусловливает развитие обострений аллергических заболеваний.
Впервые воспроизведена дифференцировка естественных регуляторных Т-клеток из лимфоидных предшественников, присутствующих в органах гемопоэза человеческого плода, которые сами по себе лишены маркеров Treg, под влиянием сокультивирования с эпителием тимуса. С этой целью отработаны условия длительного культивирования функционально полноценных эпителиальных клеток тимуса человека.
Практическая значимость диссертации
В данной работе затронуто два аспекта исследования Treg, нацеленных на решение практически значимых научных задач. Первый аспект закладывает основы для создания новой методологии получения Treg для целей адоптивной иммуноцитотерапии. Второй аспект относится к обоснованию использования Treg как средства адоптивной иммуноцитотерапии аллергических заболеваний.
Разработанные методы выявления экспрессии FOXP3 и цитокинов, влияющих на экспрессию FOXP3 или зависящих от этого фактора (IL-6, IL-10, IL-17 и TGFP), предполагается рекомендовать к использованию в клинической практике в случаях необходимости уточнения патогенетической роли изменений Treg и оценке эффекта лечения.
8 Апробация результатов диссертационной работы
Материалы диссертации доложены на научной конференции молодых специалистов Института иммунологии (Москва, 2005), XI Всероссийском Форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2007), VIII конгрессе РААКИ (Москва, 2007), II международном конгрессе «Immune-mediated diseases: from theory to therapy» (Москва, 2007), Российском Медицинском Форуме - 2007 (Москва, 2007).
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, включающего 199 источников (7 отечественных и 192 зарубежных). Работа содержит 13 таблиц и 31 рисунок.
