Введение к работе
з
Актуальность проблемы
Гемоглобинопатии - это гетерогенная группа заболеваний, которая характеризуется качественным (аномальные НЬ) или количественным (талассемии) нарушением синтеза гемоглобина. Они являются наиболее распространёнными моногенными заболеваниями, создающими главную проблему здравоохранения во многих странах мира. По данным ВОЗ, к 2000 году частота носителей глобиновых аномалий достигнет 7% - от популяции земного шара. Наиболее часто встречающиеся и наиболее тяжелые формы - это серповидноклеточная анемия, гемолитическая анемия, обусловленная нестабильным гемоглобином, большая форма 6-тапасемии, НЬ Н заболевание и Hb Bart's водянка плода (Weatherall D.J. and Clegg J.B., 1981; Токарев Ю.Н., 1983; Bunn H.F. and Forget B.G., 1986). Диагностика гемоглобинопатии быстро совершенствуется. В 60-е годы диагноз базировался на клинических данных, но уже начиная с 70-х к диагностическим тестам присоединяется электрофорез НЬ и исследование.биосинтеза глобиновых цепей, что позволило выявить гетерогенность в группе талассемии (гетерозиготные и гомозиготные формы В или р )(Weathera!l D.J. и Clegg J.В., 1981). Начиная с 1930 года существенным дополнением в диагностике стало исследование ДНК (Kazazian Н.Н., Jr. и др., 1980; Poncz М. et з!, 1982; Saiki R.K. et a!, 1G38; Diaz-Chico J.C. et al, 1988; Molchanova T.P., 1994). Использование молекулярно-биологических методов в изучении гемоглобинопатии внесло значительный вклад а понимание генетических механизмов заболеваний этой группы и их эпидемиологию. Начиная с 90-х годов отмечается тенденция использования информационной РНК (и-РНК) для более детального исследования молекулярных осноз гемоглобинопатии и попытки создания ряда диагностических тестов на этой оснозе (Thein S.L et а!, 1990; Urn S-K. et ai, 19Э2; Hall G.W., Thein S.L, 1994). Настоящее исследование базируется на новейшей технологии с использованием обратной транскрипции и полимеразной цепной' реакции (RT-PCR), что может значительно ускорить молёкулярно-биологическую диагностику данной группы заболеваний.
Цель исследования
Целью настоящей работы является создание легко воспроизводимого молекулярно-диагностического теста на основе использования и-РНК и уточнение молекулярных механизмов тяжелых форм гемоглобинопатии.
Задачи исследования
-
определить . относительный уровень глобиновых и-РНК в ретикулоцитах здоровых и больных с различными формами гемоглобинопатии;
-
проанализировать связь между уровнем и-РНК и клиническим течением гемоглобинопатии.
Научная новизна
Проанализирована динамика PCR, что проззолило стандартизировать и усовершенствовать ранее описанные, экспериментальные условия и добиться высокой воспроизводимости результатов и экономии дорогостоящих реактивов.
Разработан новый метод на базе RT-PCR для определения относительного количества различных глобиновых и-РНК, дающий возможность быстро и с большой воспроизводимостью анализировать образцы крови больных различными формами гемоглобинопатии и оценить вожможную тякесть заболевания.
Описано присутствие удлиненной а2 и-РНК при а-талассемиях вследствие мутаций в терминирующем кодоне или поли(А) сигнале а2 глобинового гена. Показано, что ее количество не одинаково при указанной патологии; повышение до 90% от уровня общей а2 и-РНК значительно смягчает клиническую картину заболевания за счет участия данной молекулы и-РНК в синтеза а глобиновой цепи, что в свою очередь уменьшает дисбаланс глобиновых цепей.
Показано, что область меиоду 2- и ч»С;-гло5иновыми генами несет регуляторную функцию, подавляя или усиливая экспрессию ^2-глобинового гена. Трансляция С, и-РНК у пациентов с Hb Н заболеванием имеет низкую эффективность.
Предложено объяснение тяжести течения 'домининтной" формы р-та-лассемии.
Впервые продемонстрированно, что и-РНК, кодирующая синтез нестабильной глобиновой цепи, является стабильной. Уровень у и-РНК у пациентов с нестабильными гемоглобинами зависит от тяжести персистирующей анемии.
Описано две абсолютно новые мутации и одна большая делеция в области В глобинового локуса, приводящие к В-талассемии.
Научно-практическая значимость
Оптимизированы и стандартизированы условия RT-PCR, позволяющие высокоэффективно использовать и-РНК для анализа образцов крови больных различными формами гемоглобинопатии, что ускоряет время молекулярной диагностики гемоглобинопатии и экономит дорогостоящие реактивы.
Разработанный метод исследования и-РНК можно использовать в качестве дополнительного теста в диагностике В-тапассемий, а-талассемий и их совместного наследования.
Оптимизирован ранее созданный метод молекулярной диагностики некоторых делеционных а-талассемий на основе PCR, что позволило использовать микроколичества ДНК и значительно понизить ошибку эксперимента.
Внедрение результатов работы в практику
Результаты работы используются в отделе Патологии Эритрона и Обмена Железа, НИИ Детской Гематологии (Москва, Россия); в отделе Биохимии и Молекулярной биологии, Медицинского колледжа Джорджии (Агаста, США); в отделе Педиатрии, медицинского факультета Кувейтского университета (Сафат, Кувейт). Результаты данной диссертации опубликованы в 18 печатных работах.
Апробация работы
Работа обсуждалась на XIII конференции Международного общества
гематологов, Европейское и Африканское отделение (Стамбул, Турция, сентябрь
1995), съезде Американского общества гематологов г(Сиетл, США, декабрь 1995) и
ч на семинаре в отделе экспериментальной гематологии Эразмус университета
(Роттердам, Голандия, июль 1996).
Материалы работы апробированы на совместной конференции сотрудникої клинических и лабораторных отделов НИИ Детской Гематологии МЗ и МП РФ і сентябре 1996г.
Структура и объём диссертации
Диссертация включает следующие разделы: введение, обзор литературы описание используемых материалов и методов исследований, главы, посвященноі результатым собственных исследований, обсуждение полученных результатов выводы, правтические рекомендации, список литературы. Работа содержит 1
таблиц и 23 рисунков и схем, занимает страниц машинописного текста
Библиография включает источников отечественной и 190 источникое
иностранной литературы.
Работа выполнена в отделе Патологии Эритрона и Обмена Железа НИИ ДГ РФ (руководитель - заслуженный деятель науки РФ, профессор Ю.Н.Токарев) и е лаборатории Белковой Химии отдела Биохимии и Молекулярной Биология Медицинского Колледжа Джорджии, США и Международном Центре по Идентификации Аномальных Пемоглобинов (руководитель - доктор наук, профессор T.H.J.Huisman).
![Состояние системы цитокинов и специфического иммунного ответа у детей и подростков с туберкулезом органов дыхания в Приморском крае [Электронный ресурс]](/i/i/4478/175304.png "Состояние системы цитокинов и специфического иммунного ответа у детей и подростков с туберкулезом органов дыхания в Приморском крае [Электронный ресурс] Середа Виктор Григорьевич")
