Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. РОЛЬ В ИММУНОНОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЯХ 9
1.1. В-клетки-супрессоры. 10
1.2. В-клетки-хелперы 14
ГЛАВА 2. ИНАКТИВАЦИЯ КРОВЕТВОРНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
АЛЛОГЕННЫМИ ЛИМФОЦИТАМ ZL
Роль Т- и В-лимфонитов в инактивации аллогенных стволовых клеток 24
ГЛАВА 3. ФИЗИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТИВНЫЕ МЕГ ОВД РАЗДЕЛЕНИЯ
КЛЕТОК , 33
3.1. Разделение клеток по размеру 34
3.2. Разделение клеток по плотности 40
3.3. Адгезия клеток 42
3.4. Разделение клеток по заряду 44
3.5. Сравнительная характеристика биологических методов разделения клеток. 56
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ЛИТЕРАТУРНОМУ ОБЗОРУ. ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ
СОБСТВЕННОГО ИСШЩЦШАНИЯ 59
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА УСТАНШКИ И МЕТОДИКИ ДЛЯ ПРЕПАРА
ТИВНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА МЕТОК В СТАЦИОНАРНОМ
ГРАДИЕНТЕ ПЛОТНОСТИ 62
4.1. Разработка конструкции. 62
4.2. Подбор растворов для электрофореза 70
ГЛАВА 5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 79
ГЛАВА 6. РАЗДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА СУЕПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ 89
ГЛАВА 7. ИЗУЧЕНИЕ ИНАКТИВИРУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ ЛИМФОПИ-
Т(В С РАЗЛИЧНОЙ ЭФП 96
ГЛАВА 8. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В- ж Т-ЛИШО-ЦЙГШ РАЗЛИЧНОЙ Ш В РЕАКЦИИ ИНАКТИВАЦИИ НЕСИНГЕННЫХ СТВОЯШЫК КЛЕТОК 103
ГЛАВА 9. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТШ ИЗ
ВЫВ ОДЫ 125
ЛИТЕРАТУРА 127
- В-клетки-супрессоры.
- Роль Т- и В-лимфонитов в инактивации аллогенных стволовых клеток
- Разделение клеток по размеру
- Разработка конструкции.
- РАЗДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА СУЕПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ
Введение к работе
Предметом этой работы является исследование взаимодействия В-лимфопитов с различными субпопуляциями Т-лимфоцитов в реакции инактивации несингеяных стволовых клеток. "Феномен инактивации несингенных стволовых клеток "был открыт Р.В. Петровым и Л.С. Сеславиной в 1967 г. и раскрывает одну из сторон взаимодействия лимфоцитов и кроветворных стволовых клеток. Он имеет крайне важное значение при трансплантации клеток костного мозга, так как ее эффективность зависит от приживления именно стволовых клеток трансплантата. Главными отличительными чертами феномена инактивации является отсутствие необходимости в предварительной сесибилизации и детерминированность как генами главного комплекса гистосовместимости, так и генами вне его. Последнее обстоятельство дает возможность утверждать, что данный феномен является также одним из основных механизмов иммунологического надзора и элиминации соматических мутаций.
Актуальность темы. Феномен инактивации несингенных стволовых клеток является удобной экспериментальной моделью для изучения клеточных механизмов трансплантационного иммунитета, поэтому представляется важным исследование роли различных субпопуляций лимфоцитов в феномене и характера их взаимодействия друг с другом. Такого рода исследования позволяют, с одной стороны, раскрыть неизвестные закономерности указанного феномена, а, с другой стороны, представляют дополнительные возможности для целенаправленного воздействия на проявления трансплантационного иммунитета. Ранее было установлено, что инактивация аллогенных стволовых клеток осуществляется Т-лимфоцитами (В.М. Манько и Т.Б. Руднева, І975; Т.Б. Руднева и др., 1978). Позднее была выяснена роль различных субпопуляций Т-лимфоцитов, участвующих в феномене инактивации (Г,А. Игнатьева, 1980; В.М. Маяько и др., 1981). При исследовании роли В-лимфоцитов было показано, что они не обладают инактивирущей активностью, но могут выполнять вспомогательную роль в реакции инактивации, оказывая помощь Т-лимфо-цитам (В.М. Манько и др., 1978). Однако полной ясности относительно роли В-лимфоцитов и их взаимодействия с Т-лимфоцитами не было главным образом из-за отсутствия подходящих методов препаративного разделения Т- и В-лимфоцитов. Вопрос о роли В-лимфоцитов в реакции инактивации и стал предметом нашего исследования.
Дель и задачи исследования. Целью данной работы было изучение роли В-лимфоцитов в феномене инактивации яесиягенных стволовых клеток и характера их взаимодействия с Т-лимфоцитами различной электрофор етической подвижности (ЭШ). В связи с этим были поставлены следующие задачи:
Разработать конструкцию установки и методику для препаративного разделения живых клеток по ЭШ.
Отработать методику разделения по ЭШ Т- и В-лимфоцитов из лимфатических узлов мыши.
Определить инактивирующую активность фракций Т-лимфоцитов различной ЭШ.
Исследовать принципиальяуго возможность, характер и основные условия проявления взаимодействия между В-лимфоцитами и субпопуляциями Т-лимфоцитов различной ЭШ.
В результате исследований, проведенных с использованием установки для препаративного клеточного электрофореза собственной конструкции, было установлено, что Т-лимфоциты различной ЭШ обладают неодинаковой инактивирующей активностью и могут быть объединены в три субпопуляции: I) низкоактивную с низкой дШ; 2) высокоактивную со средней ЭФП и 3) низкоактивную с высокой ЭШ. В-лимфоциты выполняют роль клеток-хелперов, оказывая помощь слабоотвечающим Т-лимфоцитам с низкой ЭШ в реакции инактивации несингенных стволовых клеток. Взаимодействие стволовых клеток костного мозга с аллогенными лимфоцитами лимфатических узлов носит двухфазный характер: при высоких отношениях киллер-мишень наблюдается инактивация, а при низких - активация коло-ниеобразования.
Практическое значение работы» Изучение роли различных субпопуляций лимфоцитов и, в частности, В-лимфоцитов в феномене инактивации несингенных стволовых клеток представляет не только теоретический, но и чисто практический интерес. На основании результатов данной работы возможно препаративное отделение популяции В-лимфоцитов и, в зависимости от задачи, целенаправленный поиск средств, стимулирующих или подавляющих их вспомогательную активность. Так, для успешного приживления чужеродного костного мозга, когда необходимо ослабить эффект инактивации, целесообразь но подавление вспомогательной активности В-лимфоцитов. Напротив, для повышения эффективности иммунологического надзора, при котором Т-лимфоциты обеспечивают генетическое постоянство организма, целесообразно повышение указанной активности В-лимфоцитов. Практическое значение данной работы выходит за рамки исследования только явления инактивации, поскольку разработанные в ней установка и методика препаративного электрофореза могут быть использованы после небольших изменений для разделения клеток любых видов, различающихся ЭШ, при исследовании самого широкого круга вопросов. Лоэтэдлу представляется целесообразным внедрение в практику прибора для препаративного электрофореза клеток, создание которого входит в качестве этапа задания в Государственную программу по иммунологии и медицинской генетике 0.69.07 (под номером 02ЩН2).
В-клетки-супрессоры
При исследованиях in vivo Р.В. Петровым и др. (1976а ) была обнаружена супрессия гуморального иммунного ответа клетками костно-мозгового происхождения. При совместной трансплантации мышам линии СВА интактяых сингеяных клеток костного мозга совместно с эритроцитами барана (ЭБ) наблюдалась супрессия продукции антителообразующих клеток в селезенке по сравнению с введением одних ЭБ. Кроме клеток костного мозга супрессивной активностью по отношению к антителопродуцентам обладают клетки лимфатических узлов и селезенки. Показано, что клетки-супрессо-ры относятся к В-ряду и в определенных условиях могут оказывать антигенспецифическое и антиген-неспецифическое супрессор-ное действие на развитие гуморального иммунного ответа, следовательно могут играть роль негативных регуляторов в иммунной системе (Р.В. Петров и др., 19766; Petrov , Khaitov , 1977). Аналогичные данные по костномозговой супрессии In vivo были получены в экспериментах Duwe, Singhat (1978). С.С. Гамбаров и др. (1980) показали, что в лимфатических узлах нормальных мышей содержатся супрессорные клетки, обладающие основными поверхностными характеристиками В-лимфоцитов и угнетающие гуморальный иммунный ответ адоптивно перенесенных клеток селезенки от В-мышей. В селезенках мышей, иммунизированных тринитрофенолом (ТНФ), конъюгированным с бычьим иммуноглобулином, обнаружена антигениядуцированная В-супрвссоряая активность, влияющая на иммунный ответ к ТНФ, конъюгированному как с Т-зависимым, так и с Т-независимым носителем ( de Kruiyff ei at, ,1981). В работе А.Г. Калинковича с соавторами (1984) рассмотрены некоторые свойства антигениндуцированяых В-клеток-супрессоров, полученных при иммунизации мышей ЭБ.
Сутрессорное действие В-лимфопитов проявляется не только в гуморальном иммунитете, но также и в клеточном. Продемонстрировано присутствие в лимфатических узлах и селезенке мшпей, иммунизированных пикрилхлоридом, В-супрессоров, угнетающих контактную кожную гиперчувствительность замедленного типа (Zembata et xt,, 1976). При нанесении на кожу мыши пикрилхло-рида и последующем (через 8 суток) внутривенном введении пикрил-сулъфояовой кислоты наблюдалось появление В-клеток, подавляющих развитие Т-клеток-супрессоров гиперчувствительности замедленного типа ( Aubsrson et а., 1982),
При исследованиях In ritro было показано, что непосредственное добавление клеток костного мозга в культуры лимфоид-ных клеток подавляет продукцию антител к различных антигенам ( Singhat et a.,I972; Adter et al.f 1976 ; P.B. Петров и др., 1977а). Вместе с тем, в ряде исследований показано, что клетки костного мозга оказывают стимулирующее влияние на антителоге-нез как в индуктивной (Duwe, Sinohal , 1976), так и в продуктивной фазе (А.А. Михайлова и др., I97I;Petrov , Mikhatiova , 1972; Pet го v et ad., 1975). Для разделения стимулирующего и супрессирутощего эффектов костного мозга было произведено культивирование в двухкамерных флаконах in vitro клеток селезенки (источник антителопродуцентов) и костного мозга в смеси или разделенными миллипоровой мембраной с добавлением во все культуры ЭБ (Р.В. Петров и др., 1977а). Авторы показали, что стимулирующее воздействие клеток костного мозга на продукцию антител не требует прямого контакта между клетками костного мозга и селезенки. Супрессирующее же воздействие на продукцию антител осуществляется в результате прямого контакта клеток костного мозга с активно пролиферирующими антигенстимулированными лим - 12 фоцитами селезенки. Обработка костного мозга анти-MBLA или анти-Icj сыворотками и комплементом значительно снижает супрессорную активность клеток костного мозга (Р.В. Петров и др., 19776). Наиболее вероятным кандидатом на роль костномозговой клетки-су-прессора считается предшественник В-лимфопита, который является 1+ - делящейся клеткой (Р.В. Петров и др., 1938; Р.И. Ата-уллаханов, 1978).
class2 ИНАКТИВАЦИЯ КРОВЕТВОРНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
АЛЛОГЕННЫМИ ЛИМФОЦИТАМ class2
Роль Т- и В-лимфонитов в инактивации аллогенных стволовых клеток
Изучение ияактивирующей способности клеток различных лимфоидных тканей показало, что наибольшей инактивирующей способностью обладают клетки лимфатических узлов интактяых мышей. По способности подавлять пролиферацию колониеобразующих единиц в селезенке (К0Ес) ближе всего к интактным лимфоцитам находятся кортизонрезистентяне клетки тимуса. Для инактивации К0Ес интак-тными клетками тимуса требуются большие дозы лимфоцитов (В.М.Манько, Т.Б. Руднева, 1975; Т.Б. Руднева и др., 1978),
Для выяснения собственной ияактивирующей активности субпопуляций Т-лимфоцитов было использовано фракционирование тимопи-тов по тропности к лимфатическим узлам и селезенке в летально облученных мышах (модель Т-мышей). Эти мыши были использованы в качестве доноров Т-лимфоцитов лимфатических узлов и селезенки. Оказалось, что Т-лимфоциты в условиях дефицита В-клеток способны осуществлять инактивацию KQEL, то есть являются эффектора-ми инактивации стволовых клеток (Т.Б. Руднева и др., 1978;В.М. Манько, Т.Б. Руднева, 1975). По инактивирующей активности субпопуляции Т-лимфоцитов можно расположить следующим образом: кортизонрезистентные тимоциты Т-клетки из лимфатических узлов Тчшши Т-кдетки из селезенки Т-мыши иятактяые тимоциты (Т.Б. 1 уднева, І979).
Эффекторная роль Т-лимфоцитов в реакции инактивации была также подтверждена экспериментами по трансплантации облученным в летальной дозе мышам (СВА х C57BL )Fj клеток костного мозга мышей C57BL в смеси с лимфоцитами интактных мышей СВА, обработанными in vitro специфическими аятисыворотками (Т.Б. Руднева и др., 1978; Т.Б. Руднева, 1979). Были использованы следующие антисыворотки: анти-MTLA (анти-Т) сыворотка, анти-ТЬуІ сыворотка, антилимфоцитарная сыворотка. В качестве комплемента использовалась сыворотка морских свинок или кроликов. Было показано, что обработка лимфоцитов in vitro анти-Т сывороткой и комплементом или антилимфоцитарной сывороткой и комплементом полностью отменяет инактивацию несиягенных стволовых клеток по сравнению с инактивацией КСЕС 97-99$ в контроле. В то же время клетки лимфатических узлов интактных мышей СВА, обработанные in vitro анти-Тлу Г сывороткой и комплементом, частично сохра - 26 вяли способность подавлять колояиеобразование. Индекс инактивации стволовых клеток составлял 26,9$ по сравнению с инактивацией 97,1$ КШС в контрольных опытах (Т.Б. Руднева и др., 1978). Авторы объясняют меньшую активность аятиhyI сыворотки по сравнению с анти-Т сывороткой низкой плотностью Thyl -антигена на периферических Т-лимфоцитах по сравнению с его концентрацией на тимоцитах и неполной элиминацией таких клеток из популяции лим-фоидных элементов лимфатических узлов.
class3 ФИЗИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТИВНЫЕ МЕГ ОВД РАЗДЕЛЕНИЯ
КЛЕТОК class3
Разделение клеток по размеру
Из всех методов разделения клеток по размеру наибольшее распространение получили методы, основанные на седиментации.
Скорость равномерного движения сферической частицы в жидкости определяется формулой Стокса: где г - радиус частипы, р р{- плотности частипы и жидкости, в которой они оседают, соответственно, - скорость оседания частипы, л - вязкость среды, g - ускорение силы тяжести. Если плотность среды (j I,00 г/см3) существенно отличается от плотности клеток (р « 1,05-1,09 г/см3), то различия в скоростях седиментации определяются прежде всего различиями их размеров, так как скорость седиментации в этом случае определяется квадратом радиуса клетки. Таким образом, разделение клеток по скорости седиментации основано в первую очередь на различии их размеров. Но в литературе в качестве характеристики клеток, разделяемых данным методом, чаще всего используют не размер, а скорость оседания клеток, которую измеряют в мм/час.
Седиментация в гравитационном поле Земли (Ig ). Наиболее простая и эффективная установка для разделения клеток седиментацией под названием Staput ("стабильное положение") была описана в работе Peterson и Evans (1967), а ее модификация - в работе Hitter и Vhittipu (1969). Главным узлом установки является цилиндрическая камера диаметром 240 мм (диаметр можно варьировать), переходящая к низу в конус. К вершине конуса подсоединена трубка, через которую в камеру вводится суспензия клеток и стабилизирующий градиент плотности. В качестве сред для градиента плотности использовались сыворотка новорожденного теленка в фосфатном буферном растворе ("Peterson , Evans ,1967), раствор бычьего сывороточного альбумина (Miller , VhllllpS , 1969) или раствор фикола (Тибр , Bout, 1975).
Процесс разделения в камерах типа itaput длится от двух до пяти часов при температуре +4С. Клетки распределяются в камере в зависимости от скорости седиментации (размера) и по окончании разделения выводятся вместе с градиентом плотности через нижнее отверстие и фракционируются.
class4 РАЗРАБОТКА УСТАНШКИ И МЕТОДИКИ ДЛЯ ПРЕПАРА
ТИВНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА МЕТОК В СТАЦИОНАРНОМ
ГРАДИЕНТЕ ПЛОТНОСТИ class4
Разработка конструкции
Вследствие того, что целью препаративного метода разделения является получение живых, функционально активных клеток, основным требованием к установке в целом и к конструкции в частности является отсутствие повреждающего действия на клетки в процессе разделения. Повреждающее действие могут оказывать среды, в которых находятся разделяемые клетки (о требованиях, предъявляемых к средам см. 4.2), продукты распада, образующиеся в процессе электролиза и диффундирующие от электродов в камеру. Кроме того, поскольку среды, в которых идет процесс разделения клеток, не вполне физиологичны, разделение должно проводиться при пониженной температуре и поэтому установка должна обеспечивать возможность поддержания в камере постоянной температуры в пределах +4 +7С в течение всего эксперимента. Последнее требование к установке отпадает, если она находится в "холодной комнате".
Следующая группа требований относится к главной функции установки, а именно, к функции разделения. Первое требование состоит в том, что постоянное электрическое поле в камере для разделения должно быть однородным в области движения клеток, в противном случае клетки, находящиеся в одном и том же поперечном сечении камеры, будут двигаться с разными скоростями, что может привести к значительному снижению точности разделения. Второе требование заключается в том, что напряженность электрического поля в камере разделения должна быть достаточно высокой, чтобы разделение клеток проходило за приемлемый промежуток времени (не более 5 часов).
Третье требование относится к подготовке установки для работы и состоит в том, что конструкция должна обеспечивать формирование точного градиента плотности и тонкого плоского слоя с клетками наверху этого градиента. Точность градиента плотности определяется отклонениями от заданной его формы (градиент может быть линейным или нелинейным) и неоднородностями в поперечных сечениях. Градиент плотности при разделении клеток необходим по двум причинам: во-первых, для того, чтобы упорядочить движение клеток при разделении и исключить влияние таких возмущающих факторов, как температурная конвекция, вибрация и, во-вторых, для того, ятобы при фракционировании исключить возможность перемешивания различных слоев разделенной клеточной суспензии. Очевидно, что как для процесса разделения, так и для фракционирования точность градиента плотности имеет первостепенное значение.
Четвертое требование связано с предыдущим и заключается в том, что конструкция должна обеспечивать точное фракционирование градиента плотности и суспендированных в нем разделенных клеток, то есть выведение из камеры без перемешивания слоев жидкости (с суспендированными в ней клетками), отличающихся по плотности, и разливание равных ее объемов по пробиркам.
Пятое требование относится к производительности установки и состоит в том, что она должна обрабатывать такое количество, клеток, которого достаточно для проведения биологических экспериментов.
Разделение и характеристика суепопуляций лимфоцитов
Выше описаны разработанная нами установка и методика для препаративного электрофореза клеток в градиенте плотности. Преимуществами установки являются относительная легкость ее изготовления и высокая точность разделения клеток, не уступающая зарубежным образцам.
Препаративный электрофорез на данной установке использовался преимущественно для разделения лимфоцитов из лимфатических узлов мышей.линии СВА. Суспензию клеток с концентрацией 5 10х 10 кл/мл объемом 10 мл наслаивали на фиколо-сахарозный градиент плотности и разделяли электрофорезом в течение 3 часов. Электрофорез проводился в режиме стабилизации тока при плотности тока 14 а/м2 и напряжении 330 350в при температуре +4С. При фракционировании разделенная суспензия разливалась в большинстве экспериментов на 16 18 фракций объемом 3,0 мл. Содержание клеток во фракциях определяли подсчетом в камере Горяе-ва. По полученным данным строили просаль распределения клеток по фракциям (электрофореграмму).
Оказалось, что форма профиля зависит от объема фракции. Так, при фракционировании разделенной суспензии клеток лимфатических узлов по 2 мл наблюдается профиль, состоящий из двух "горбов" (см. рис.7а); типичный профиль, получаемый при фракционировании по 3,0 мл, показан на рис. 7в.
Жизнеспособность клеток после электрофореза определялась но окрашиванию трипановым синим и составляла 95-97$.
В качества теста функциональной активности лимфоцитов использовалась реакция подавления -экзогенного колониеобразова-яия в системе родитель-гибрид (Р.В. Петров, I.G. Сеславияа, 1967; Л.С. Оеславина, 1969). Для проверки функционально! активности лимфоцитов после электрофореза использовали смесь клеток, полученную объединением всех фракций. Сказалось, что инактиви-рующая активность лимфоцитов, подвергнутых процедуре электрофореза, не отличается от ияактивирующей активности интактных лимфоцйтов. Таким образом, электрофорез не оказывает какого-либо повреждающего или угнетающего действия на разделяемые клетки.
Для оценки возможностей нашей установки был поставлен эксперимент по разделению клеток селезенки мышей линии СВА, подобный эксперименту, проведенному на аналогичном оборудовании за рубежом ( PEatsoucas et a?., 1976). Такой выбор объекта разделения был обусловлен тем, что эдектрофореграмма разделенных клеток селезенки обладает весьма характерной чертой - наличием семи различающихся пиков, положение которых строго повторялось от эксперимента к эксперименту (всего в указанной работе было проведено шесть таких экспериментов), и крайне маловероятным является получение такой картины за счет каких-либо артефактяых явлений, например, случайного расслоения клеточной суспензии при ее введении в камеру. Поэтому получение подобной электрофореграммы свидетельствовало бы об одинаковой разрешающей способности рассматриваемых установок.
Условия разделения были максимально приближены к условиям аналога за счет использования подобного градиента плотности и подбора режима электрофореза (плотность тока - 14 а/яг, время разделения - 4 часа). После разделения суспензию разлили по фракциям объемом 2,0 мл. В результате разделения был получен профиль распределения клеток по фракциям, подобный профилю, приведенному в указанной работе. В нашем случае на профиле также были представлены семь различающихся пиков (рис.8), положение которых было близким к положению пиков в этой работе. Это говорит о том, что точность разделения на нашей установке, по-видимому, не ниже точности разделения, ползгчаемои на установке группы PEatsoucas.
