Изменение показателей пролиферации и апоптоза в условиях лимфопении и восстановления Т-клеточного пула после аутологичной трансплантации стволовых кроветворных клеток [Электронный ресурс] Пронкина Наталья Викторовна

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Пронкина Наталья Викторовна. Изменение показателей пролиферации и апоптоза в условиях лимфопении и восстановления Т-клеточного пула после аутологичной трансплантации стволовых кроветворных клеток [Электронный ресурс] : Диссертация ... кандидата медицинских наук : 14.00.36

Содержание к диссертации

Введение

ЧАСТЫ. Обзор литературы

Глава 1. Процессы апоптоза и пролиферации иммунокомпетентных клеток в норме 11

1.1. Понятие Т-клеточного гомеостаза. И

1.2. Пролиферация и апоптоз в формировании популяции Т-лимфоцитов . 11

1.3. Механизмы гомеостатического контроля иммунокомпетентных клеток в периферических отделах иммунной системы 16

Глава 2. Процессы апоптоза и пролиферации иммунокомпетентных клеток при лимфопении 26

2.1. Гомеостаз Т-и В-клеток в условиях лимфопении. 26

2.2. Индукция апоптоза Т-лимфоцитов . 32

Глава 3. Патологии с нарушением показателей апоптоза и пролиферации Т-клеточного звена иммунной системы 33

3.1. Индукция апоптоза и клиническое значение нарушений Т-клеточного звена иммунной системы при проведении химиотерапии и ТСКК. 33

3.2. Нарушения клеточного и гуморального звеньев иммунной системы и индукция апоптоза при ВИЧ-инфекции 37

ЧАСТЬ II. Материалы и методы исследования 42

Глава 1. Характеристика больных 42

/./. Характеристика больных гемобластозами 42

1.2. Характеристика ВИЧ-инфицированных больных. 43

Глава 2. Методы лабораторных исследований 45

2.1. Получение лейковзвеси из периферической крови 45

2.2. Определение количества лимфоцитов. 45

2.3. Определение относительного количества CD4+CD45RO+-, CD4+CD45RA+-, CD8+CD45RO+- и CD8+CD45RA+-лимфоцитов 46

2.4. Определение клеточного цикла в Т-лимфоцитах, моноцитах и CD34+-клетках 47

2.5. Определение внутриклеточных цитокинов в субпопуляцих Т-лимфоцитов 48

Глава 3. Методы статистических и информационных исследований 51

ЧАСТЬ III. Результаты собственных исследований 55

Глава 1. Результаты исследований группы доноров 55

1.1. Количественная характеристика, показатели апоптоза и фаз клеточного цикла иммунокомпетентных клеток и соотношение Т1/Т2 иммунного ответа в группе доноров. 55

1.2. Корреляционные взаимосвязи в группе доноров 58

Глава 2. Результаты исследований больных гемобластозами до и после АТПСКК з

2.1. Количественная характеристика Т-клеток в группе больных гемобластозами до и после АТПСКК. 60

2.2. Показатели апоптоза и фаз клеточного цикла Т-клеток в группе больных гемобластозами до и после АТПСКК. 63

2.3. Соотношение наивных Т-клеток и Т-клеток памяти в группе больных гемобластозами до и после АТПСКК. 70

2.4. Корреляционные взаимосвязи в группе больных гемобластозами до и после АТПСКК. 73

2.5. Относительное количество Т-клеток, продуцирующих цитокины первого и второго типа в периферической крови больных гемобластозами до и после АТПСКК. 78

2.6. Ассоциация показателей иммунного статуса с развитием раннего рецидива в течение года после АТПСКК у больных гемобластозами 80

2.7. Ассоциация показателей иммунного статуса с развитием осложнений на этапе восстановления кроветворения после АТПСКК у больных гемобластозами 84

2.8. Оценка показателей клеточного цикла CD34+-клеток продукта сепарации у больных гемобластозами 87

Глава 3. Результаты исследований ВИЧ-инфицированных пациентов до начала курса антиретровирусной терапии 89

3.1. Количественная характеристика иммунокомпетентных клеток в группе ВИЧ-инфицированных пациентов 89

3.2. Показатели апоптоза и фаз клеточного цикла в субпопуляциях иммунокомпетентных клеток ВИЧ-инфицированных пациентов 90

3.3. Корреляционные взаимосвязи в группе ВИЧ-инфицированных пациентов 92

Обсуждение 94

Заключение 107

Выводы: 110

Практические рекомендации 111

Список литературы

Пролиферация и апоптоз в формировании популяции Т-лимфоцитов
Индукция апоптоза Т-лимфоцитов
Нарушения клеточного и гуморального звеньев иммунной системы и индукция апоптоза при ВИЧ-инфекции
Корреляционные взаимосвязи в группе доноров

Введение к работе

Актуальность. Постоянство численности клеток лимфоидных популяций обеспечивается балансом их образования (за счет пролиферации) и гибели (как правило, по механизму апоптоза) (Freitas A , et al 2000) Баланс между двумя этими процессами определяет Т-клеточный гомеостаз в организме Интенсивность пролиферации наивных Т-лимфоцитов (GTMSRA"¹} у взрослых людей минимальная С помощью определения маркера пролиферирующих клеток Кі-67 установлено, что in vivo пролиферирует около 1% наивных Т-клеток - в равной степени CD4 и CD8⁺ (Hazenberg М D, 2003, Sachsenberg N ,1998) Количество наивных Т-клеток определяется выработкой IL-7 и содержанием дендритных клеток, несущих молекулы МНС классов I и II, а соотношение последних определяет баланс наивных Т-клеток CD8⁺ и CD4⁺ (Fry Т J, et al 2001, Vivien L , et al 2001, Mackall CrL,etal 2001, Kirberg J, et al 2001) Гомеостаз CD8⁺- клеток памяти реализуется с участием цитокинов, среди которых основная роль принадлежит IL-15, а вспомогательная IL-7 (Melchionda F , et al 2005, Alpdogan О , et al 2005) Гомеостаз клеток памяти (CD45RO⁺) минимально зависит от молекул МНС (Tanchot С , et al 1997, Cho В К , et al 2000) Механизмы гомеостатического контроля СЕ)4⁺-клеток памяти мало изучены В условиях Т-лимфопении механизмы пополнения наивных Т-клеток отличаются от таковых при нормальном содержании Т-клеток Они проявляются в форме гомеостатической пролиферации, которая сопровождается сменой мембранного и функционального фенотипа на фенотип клеток памяти без промежуточного этапа активации и без дифференцировки в эффекторные клетки (Tough D F , et al 1994, Wu Z , et al 2003, Mahajan V S , et al 2005)

Численность ежедневных мигрантов из тимуса и Т-клеток, новообразованных в результате периферической экспансии, должна уравновешиваться числом Т-клеток, подвергающихся апоптозу (Tanchot С , et al 1997, Romanyukha A A , et al 2003) Зрелые Т-лимфоциты, подвергшиеся селекции, в покоящемся состоянии лишены мембранного Fas-рецептора и экспрессируют протоокоген Вс1-2, что определяет их устойчивость к индукторам апоптоза (Karawajew L, et al 2000) Положение меняется на обратное при активации лимфоцитов соответствующим антигеном или митогеном Активированные лимфоциты могут подвергнуться апоптозу при различных воздействиях -повторной стимуляции через перекрестное сшивание рецепторов или недостатке факторов роста (IL-2) и т д (Dooms Н , et al 2004, Karas М, et al 1999) Апоптоз может развиться и в процессе активации - например, в случае предварительного связывания молекул CD4, при отсутствии костимуляции Т-клеток через CD28 (Prhc М, et al 2001) После дифференцировки Т-лимфоцитов в эффекторные клетки и Т-клетки памяти в них также экспрессируется Вс1-2, и они временно приобретают устойчивость к индукторам апоптоза В реализации и контроле апоптоза участвуют многочисленные внутриклеточные факторы и от его осуществления зависят многие важные процессы, реализуемые на уровне организма (Badley A D, et al 2000)

Изучению процессов, поддерживающих клеточный гомеостаз, посвящено много отечественных и зарубежных исследований, что в значительной степени определяется потребностью в точных знаниях о закономерностях восстановления популяций и субпопуляций лимфоцитов, что находит огражение в их функциональном состоянии, включая и соотношение Т1/Т2-ответов (Jameson SC 2002, Guimond М, et al 2005, Yusuf I, et al 2003) Это характерно при

заболеваниях (СПИД), после действия повреждающих факторов (облучение, химиопрепараты), а также после пересадки костного мозга При патологии изменяется процент клеток, подвергшихся апоптозу и процент клеток, вступивших в периферическую экспансию, а также изменяются взаимосвязи этих двух процессов Большой интерес вызывают процессы восстановления Т-клеток после их деплеции По данным литературы на апоптоз Т-клеток при ВИЧ-инфекции могут влиять моноциты (Oyaizu N, et al 1993, Sperber К, et al 2003), поэтому вызывает интерес параллельное исследование процессов гомеостаза моноцитов и Т-лимфоцитов Кроме того, интенсивно изучаются механизмы восстановления субпопуляций Т-лимфоцитов CD4⁺- и СВ8⁺-клеток, которые отличаются по скорости восстановления Как известно, С04⁺-клетки восстанавливаются через год и более после трансплантации костного мозга, а СВ8⁺-клетки - уже через 6 месяцев (Guillaume Т , et al 1998, Mackall Cr L et al 1997) Восстановление клеточного пула после ТКМ происходит в основном за счет клеток памяти, а они, как известно, более подвержены апоптозу, чем наивные клетки (Porrata L F , et al 2001, Mackall Cr L et al 2005) Являясь наиболее радикальным способом лечения гемобластозов, АТПСКК, тем не менее, не всегда приводит к излечению, и уже в течение первого года в 22 — 40% случаев возникает рецидив заболевания Возникновение рецидива связано со многими причинами Совокупность факторов, таких как, статус заболевания (полная, частичная ремиссия или резистентное течение) на момент трансплантации, его стадия, предлеченность, нозология заболевания и возраст больного имеет определенное прогностическое значение в исходе трансплантации (Cortelazzo S , et al 1999) В доступной нам литературе, тем не менее, нет данных о зависимости процессов восстановления Т-клеточного пула с исходом трансплантации, однако в литературе есть данные о разной репопулирующей способности CD34 -клеток в зависимости от стадии клеточного цикла (Uchida N, etal 1997, Voermans С , et al 2001)

Изучение взаимосвязей между пролиферацией и апоптозом CD4⁺- и CD8⁺-клеток у больных гемобластозами до и после АТПСКК (в разных временных точках восстановления гемопоэза), а также у ВИЧ-инфицированных пациентов, актуально для понимания процессов восстановления Т-клеточного гомеостаза Цель исследования Исследовать взаимосвязь апоптоза и пролиферации CD4⁺- и СБ8⁺-клеток периферической крови с процессами восстановления количественных и функциональных характеристик Т-лимфоцитов при лимфопении различного генеза и после аутологичной трансплантации периферических стволовых кроветворных клеток Задачи исследования

Исследовать показатели апоптоза и фаз клеточного цикла CD4⁺- и С08⁺-клеток и моноцитов у больных гемобластозами до и после АТПСКК и у ВИЧ-инфицированных пациентов
Оценить особенности показателей апоптоза и фаз клеточного цикла CD4⁺- и CD8⁺-ioieTOK у пациентов с благоприятным и неблагоприятным течением заболевания после АТПСКК
Исследовать показатели фаз клеточного цикла стволовых кроветворных клеток продукта сепарации у больных гемобластозами с благоприятным и неблагоприятным течением заболевания после АТПСКК
Исследовать показатели наивных Т-клеток и Т-клеток памяти в периферической крови у больных гемобластозами до и после АТПСКК

5 Определить относительное количество CD4⁺ и CD8" Т-лимфоцитов

периферической крови, продуцирующих IFN-y и IL-4 в ответ на

неспецифическую поликлональную стимуляцию у больных гемобластозами до

и после АТПСКК и относительно здоровых доноров

Научная новизна В работе впервые показано, что как в норме, так и у больных

гемобластозами после химиотерапии и у ВИЧ-инфицированных пациентов

количество иммунекомпетентных клеток (CD4 -, CD8 -клеток и моноцитов) в

S,G2/M фазах клеточного цикла прямо взаимосвязаны между собой При этом

положительная корреляционная взаимосвязь между показателями апоптоза и

пролиферации CD4⁺-toieTOK характерна только для группы здоровых лиц

Показано, что пролиферативная активность СЕМ⁺-клеток прямо зависит от

выраженности лимфопении как у ВИЧ-инфицированных больных, так и у

больных гемобластозами до АТПСКК

Впервые показано, что у больных с ранним рецидивом основного заболевания после АТПСКК, по сравнению с больными о благоприятным течением, при исследовании до курса мобилизации более выражена CD4⁺-лимфопения, повышено количество С04⁺-клеток в в,02/М-фазах клеточного цикла, повышено количество CD4⁺CD45RA⁺-ioieTOK, а также количество CD34⁺-клеток в S,G2flVI-фазах клеточного цикла среди трансплантируемых клеток Показано также, что для этих больных характерно прогрессирующее снижение количества наивных CD4⁺CD45RA⁺-ioieTOK после АТПСКК

Научно-практическая значимость работы Полученные данные

продемонстрировали однотипность изменения взаимосвязей апоптоза и пролиферации CD4⁺-icneTOK в условиях лимфопении различного генеза Важным итогом работы явилось также положение о разном соотношении механизмов восстановления Т-клеточного пула (гомеос гатической пролиферации, лимфопоэза, тимопоэза) при благоприятном исходе АТПСКК и при развитии раннего рецидива заболевания, которому предшествует недостаточное (по сравнению с благоприятным течением) восстановтение Т-клеток в количественном и функциональном плане

Результаты исследования обосновывают важность проведения у больных гемобластозами на этапах подготовки к АТПСКК дополнительных лабораторных исследований, включая показатели апоптоза и клеточного цикла субпопуляций иммунокомпетентных клеток Выявление различий механизмов восстановления Т-клеточного пула у больных гемобластозами с разным исходом трансплантации дает возможность прогноза эффективности АТПСКК и риска развития инфекционных осложнений в период восстановления кроветворения Основные положения, выносимые на защиту

Повышение показателей апоптоза и S,G2/M фаз клеточного цикла Т-лимфоцитов периферической крови отражает активацию пролиферации клеток в процессе восстановления Т-клеточного пула как при лимфопении (при ВИЧ-инфекциии и после ПХТ при гемобластозах), так и после аутологичной трансплантации периферических стволовых кроветворных клеток
Благоприятный исход АТПСКК при гемобластозах характеризуется восстановлением Т-клеточного пула с участием наивных клеток и характеризуется возрастанием количества ТІ-клеток (Th и Тс), тогда как развитие рецидива основного заболевания после АТПСКК происходит на фоне

прогрессирующего снижения количества наивных СЕМ⁺-клеток и срыва

восстановления количества ТІ-клеток (Th и Тс) 3 Различия механизмов восстановления Т-клеточного пула после АТПСКК

ассоциированы с его состоянием до трансплантации и с пролиферативной

активностью трансплантируемых СБ34⁺-клеток Апробация работы Материалы диссертации доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции посвященной 15-летнему юбилею Красноярского Краевого Центра по профилактике и борьбе со СПИД и другими инфекционными заболеваниями «Дни иммунологии в Сибири» (Красноярск 2005), на 7-ой отчетной конференции ГУ НИНКИ СО РАМН «Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека от эксперимента к клинике» (Новосибирск 2006) Апробация диссертации состоялась 3 апреля 2007г на семинаре клинического отдела ГУ НИИ Клинической Иммунологии СО РАМН

Публикации По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для опубликования результатов работ соискателей ученой степени кандидата биологических наук

Объем и структура работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов Материал изложен на 129 страницах машинописного текста, включающего 15 рисунков и 23 таблицы Прилагаемая библиография содержит ссылки на 156 литературных источников, из них 139 зарубежных

Пролиферация и апоптоз в формировании популяции Т-лимфоцитов

Формула мембранного фенотипа клеток-предшественников, мигрирующих в тимус, такова: CD2"3"4lo57+8"25 16+44+45+. Кроме того, они несут на своей поверхности интегрин VLA-4, а-цепь рецептора IL-7, а также у-цепь, общую для рецепторов IL-7, 2, 4, 15, 9. Попав в субкапсулярную зону тимуса, эти клетки медленно пролиферируют. На стадиях непосредственно предшествующих началу перестройки генов антигенраспознающих рецепторов CD44+CD25+ про-Т-клеток, экспрессируется Вс1-2, и клетки приобретают устойчивость к индукторам апоптоза, что означает их выход из пула малодифференцированных клеток-предшественников. На этой стадии пролиферация останавливается (Ashton-Rickardt P.G.,et al. 1994).

Далее следует этап драматических перестроек генов Т-клеточного рецептора (TCR), важной составляющей которых являются разрывы и рекомбинации нитей ДНК. Это само по себе может служить сигналом к развитию апоптоза (с участием фактора р53) (Чумаков П.М. 2000), однако высокий уровень экспрессии Вс1-2 и Bcl-XL препятствует этому. Экспрессия перестроенного гена 3-цепи существенна для дальнейшего развития Т-клеток (Osborne B.A. 2000). Вследствие контакта с неизвестным лигандом, локализующимся на поверхности эпителиальных клеток, в преТ-клетку подается сигнал, который вызывает их пролиферацию, обозначаемую как (3-селекция. Эта волна пролиферации обеспечивает поддержку клеток, в которых успешно осуществился первый этап реаранжировки генов TCR. Она важна и для достижения достаточной численности предшественников Т-лимфоцитов, позволяющей сформировать разнообразный рецепторный репертуар. Лишь в случае неудачной реализации перестройки рецепторных генов клетка подвергается апоптозу. После завершения перестроек и экспрессии рецепторов (TCR на Т-лимфоцитах) происходит резкое снижение экспрессии Вс1-2 и Bcl-XL (Lanzavecchia A., et al. 1999). Это событие означает начало процесса селекции клонов - выбраковки ненужных и опасных для организма клонов лимфоцитов.

Процесс селекции достаточно полно изучен для Т-клеток (Spits Н. 2002). Объектом селекции являются кортикальные тимоциты, слабо экспрессирующие рецепторный комплекс TCR-CD3 и несущие одновременно корецепторы CD4 и CD8. Эти клетки практически лишены Вс1-2 и Bcl-XL, но содержат на своей поверхности Fas-рецептор. Такое соотношение факторов, препятствующих и способствующих развитию апоптоза, обрекает их на гибель в отсутствие специальных факторов защиты (Thompson СВ., et al. 1999). Источником защитных сигналов для них служит взаимодействие их рецептора (TCR) с молекулами главного комплекса гистосовместимости (Major Histocompatibility Complex - МНС), которые экспрессируют эпителиальные клетки микроокружения глубоких слоев коры тимуса -распознавание аутологичных молекул МНС. Если клетка несет рецептор, способный распознать эти молекулы (при этом роль встроенного в них пептида пока неясна), она получает "поддерживающий" сигнал, который приводит к усилению экспрессии рецептора TCR, активации и пролиферации клетки. Остальные клетки "игнорируются", что означает для них неизбежное развитие апоптоза. Пока не вполне ясно, что служит непосредственным сигналом к развитию апоптоза в данном случае: действие глюкокортикоидов и пуриновых нуклеотидов, присутствующих в микроокружении, или активные воздействия со стороны окружающих эпителиальных клеток - всех или определенных их субпопуляций (Ashton-Rickardt P.G., et al. 1994; Surh Ch. D., et al. 2000).

Положительная селекция сопряжена с дифференцировкой тимоцитов на субпопуляции CD4+CD8" и CD4 CD8+ клеток, основой которой является выбор способа распознавания антигенных пептидов - в составе молекулы МНС I класса (в их распознавании участвует молекула CD8) или молекул МНС II класса (распознаваемой с участием CD4). При этом экспрессия корецептора CD4 в сочетании с TCR, распознающим пептид в контексте молекул МНС I класса (не комплементарных корецептору), приводит к апоптозу клетки, так же как экспрессия CD8 в сочетании с TCR, распознающим пептид в контексте молекул МНС II класса. Причиной развития апоптоза в этом случае может служить "неполнота" сигнала от распознавания молекул МНС, который оказывается недостаточным для включения защиты от апоптоза (Osborne В.А., 1996).

После положительной селекции тимоциты подвергаются второму туру отбора - отрицательной селекции (пока неясно, как соотносится во времени этот этап селекции и дифференцировка на субпопуляции). На этой стадии выбраковываются аутореактивные клетки, т. е. тимоциты, чьи рецепторы распознают аутологичные пептиды в составе аутологичных молекул МНС. "Проба" на распознавание осуществляется при контакте тимоцитов, прошедших положительную селекцию и содержащих на своей поверхности больше молекул TCR-CD3, чем на предыдущем этапе развития, с дендритными клетками, богатыми мембранными молекулами МНС обоих классов. Этот процесс осуществляется в мозговом слое и кортико-медуллярной зоне тимуса. В случае распознавания аутологичного комплекса возникает летальный сигнал, приводящий к развитию апоптоза, т. е. к удалению потенциально аутореактивных клонов. Распознавание аутологичных молекул на поверхности эпителиальных клеток защищает тимоциты от апоптоза, а их распознавание на мембране дендритных клеток индуцирует апоптоз тимоцитов. Предполагается, что исход зависит от интенсивности воздействия, определяемой степенью сродства рецептора по отношению к распознаваемому комплексу и плотности молекул TCR и МНС на поверхности клеток. Поскольку не все антигены представлены в тимусе, процесс выбраковки аутореактивных клонов и формирования аутотолерантности продолжается после эмиграции Т-клеток из тимуса (Marleau A.M., et al. 2005; Baccala R., et al. 2005). Однако в этом случае значительная часть аутоспецифических клеток не погибает, а блокируется вследствие индукции анергии и подавления их активности супрессорными клетками. Общая продолжительность развития тимоцитов составляет примерно 20 суток (in vitro 5-7 суток) (Osborne В.А., 1996, 2000).

Зрелые Т-клетки покидают тимус через сосуды кортико-медуллярной зоны. У взрослых людей из тимуса ежедневно мигрирует 107-108 клеток, что составляет около 1% общего числа тимоцитов и 0,1% от общего числа зрелых Т-клеток (Hazenberg M.D., 2003; McFarland R.D., et al. 2000).

Индукция апоптоза Т-лимфоцитов

Результаты диссертационной работы получены с использованием комплекса методов описательной, структурной и многомерной статистики, различные аспекты, применения которых в медицинской и биологической информатике детально изложены в ряде отечественных и зарубежных публикаций (Гублер Е.В.,1978; Славин М.Б., 1989; Ластед Л., 1971; Браверман Э.М., Мучник И.Б., 1983). Статистические исследования проводили по общепринятым математическим алгоритмам, с использованием пакетов программ "Statistica V. 6.0" (Боровиков В.П., Боровиков И.П., 1997), "Snedecor V. 4.0"( Южаков А.И., Сорокин О.Д., 2000; Сорокин О.Д., 2004), "Иммунотип" (Гельфгат Е.Л. и др., 1992).

Методы описательной статистики применялись на предварительном этапе сопоставления клинико-иммунологических показателей различных групп больных. В зависимости от типа варьирования показателя, численности выборок, а также закономерности его распределения использовали параметрические либо непараметрические методы извлечения средних величин (М, Me), а также соответствующих им значений стандартных отклонений и ошибок (SD, т) (Лакин Г.Ф., 1990). При нормальном типе распределения признака для оценки достоверности различий средних величин независимых выборок использовали t- критерий Стьюдента (Pst). При распределении, отличающимся от нормального, и малом объеме выборок непараметрические критерии Уилкоксона-Манни-Уитни (PJJ) (Лакин Г.Ф., 1990). При изучении качественных признаков с бинарным распределением (по типу «есть/нет»), а также анализе встречаемости отдельных диапазонов количественных показателей с непрерывным распределением, использовали показатели частоты событий (Р%). Для суждения о достоверности различий встречаемости качественных признаков и частоты событий в различных 2 диапазонах количественных показателей, применяли критерий % (Ру) и точный метод Фишера для малых выборок (Ptmf) (Кендалл М.Дж., Стьюарт А., 1976). Для оценки взаимосвязи количественных показателей с качественными альтернативно распределенными признаками, применяли коэффициент ранговой корреляции Спирмена (Лакин Г.Ф., 1990). При изучении силы взаимосвязи между качественными признаками и частотами событий в отдельных диапазонах количественных показателей использовали коэффициент ассоциации К.Пирсона (тетрахорический показатель связи). Для оценки достоверности коэффициентов ассоциации между 2 качественными признаками и частотами событий применяли критерий % для альтернативного распределения (Р ) (Плохинский Н. А., 1970). Раздел структурного анализа включал методы квантильно-ранговой классификации непрерывно распределенных количественных показателей и методы оценки информативности признаковых диапазонов. Квантильно-ранговая классификация признаков использовалась для нахождения границ качественно отличающихся между собою диапазонов иммунологических показателей. Реализация этого подхода по алгоритму, предложенному Мостеллером и Тьюки (Мостеллер Ф., Тьюки Дж., 1982), позволяла проводить однотипное выделение различных диапазонов вариабельности признаков независимо от характера их распределения и наличия случайных статистических «выбросов», обусловленных техническими погрешностями исследований.

В процессе проведения анализа для каждого исследованного количественного показателя вычислялись вероятностные границы квантилей эмпирических распределений - X(qi). С использованием последних выборки больных гемобластозами делились на 5-11 групп, упорядоченных по возрастанию признака. Число квантильных диапазонов (К) на которое разбивался общий размах вариации признака, вычислялся исходя из объема минимальной выборки (Nmin) по формуле Стерджеса (Лакин Г.Ф., 1990).

В случае выделения 11 ранговых интервалов, структурные (статистические) границы квантильных диапазонов задавали значениями 3-ей, 5-ой, 10-ой, 15-ой, 25-ой, 50-ой, 75-ой, 90-ой, 95-ой и 97-ой центилей (Гублер Е.В., 1978; Лакин Г.Ф., 1990). Каждый из этих структурных элементов вариационного ряда представляет собою некоторую конкретную величину анализируемого показателя, меньше которой в выборках больных гемобластозами соответственно встречается 3%, 5%,..., 95%, 97% от общего числа обследованных пациентов.

На основе квантильного разбиения вариационных рядов выделялись качественно отличающиеся между собою диапазоны признаков, типичные для больных гемобластозами с «низкой», «средней» и «высокой» величиной исследованных показателей. В соответствии с общепринятыми подходами (Гублер Е.В., 1978; Лакин Г.Ф., 1990) в класс «средних» величин включались диапазоны признаков внутри интервала значений от 10% до 90% центилей. В классы «низкой» и «высокой» величины соответственно относились значения показателей, принадлежащие диапазонам ниже и выше значений 10% и 90% центилей соответственно.

Для поиска информативных значений количественных показателей, пригодных для прогноза раннего рецидива или осложнений после АТПСКК, анализировалась частота встречаемости каждого из центильных диапазонов у больных опытной и контрольной групп. Частотные характеристики признаковых диапазонов (Р (xij), а также вычисляемые на их основе показатели дивергенции (расхождения) распределения признаков по различным центильным диапазонам (Dxi) у больных опытной (Aі) и контрольной (А2) групп: D(x і) = 0.5 [ Р (х ij/Al) - Р (xij/A2)], где xij - номер каждого конкретного дентальным диапазона изучаемого показателя, использовались для расчета комплекса общепринятых статистических и информационных мер.

Статистические характеристики включали показатели достоверности различий частот встречаемости событий (Рч } Ptmf) и коэффициент ассоциации Пирсона (Rp) (см. выше). В качестве критического уровня достоверной дивергенции частот событий в группах опыта и контроля принимали величину Ptmf меньшую 0,05.

Для оценки диагностической и прогностической значимости рассчитывали показатели относительно риска («соотношения шансов») - RR, чувствительности - Sn и специфичности - Sp бинарных клинических признаков и конкретных квантилей вариационной изменчивости количественных показателей. Об их информативной ценности судили по величине диагностического коэффициента (DK) и показателю информативности Шеннона в модификации Быховского (Ізд). Для расчета вышеназванных показателей использовали общепринятые подходы, детально изложенные в руководствах по вычислительным методам распознавания патологических процессов и оценке диагностической ценности клинических показателей (Губл ер Е.В., 1978).

Нарушения клеточного и гуморального звеньев иммунной системы и индукция апоптоза при ВИЧ-инфекции

Через 6 месяцев после АТПСКК исчезают корреляции между показателем пролиферации СБ4+-клеток и количеством наивных клеток и клеток памяти в этой субпопуляции, но появляется обратная корреляционная связь между количеством С04+-клеток памяти и показателем апоптоза CD8+-клеток. При этом появляется положительная корреляционная связь между показателем апоптоза С08+-клеток и количеством СБ4+-клеток, находящихся в S,G2/M фазах клеточного цикла. Все остальные связи сохраняются, восстанавливается связь между показателями наивными СБ4+-клетками и С08+-клетками памяти.

Было установлено, что группа больных гемобластозами до трансплантации характеризуется наличием отрицательной корреляционной взаимосвязи между относительным количеством CD4+- и С08+-клеток в S,G2/M фазах клеточного цикла и процентной долей СЭ4+-клеток в периферической крови. Этот факт подчеркивает связь лимфопении с уровнем Т-клеток в S,G2/M фазах клеточного цикла. После трансплантации эта зависимость исчезает. В течение всего периода исследования группа больных гемобластозами характеризуется наличием положительной корреляционной взаимосвязи между показателями пролиферации CD4+- и С08+-клеток, такая взаимосвязь характерна и для группы доноров. Вероятно, это объясняется уровнем цитокинов в периферической крови, которые поддерживают процессы выживания и гомеостатической пролиферации Т-клеток. Но в тоже время группа больных гемобластозами характеризовалась наличием положительной корреляционной взаимосвязи между показателями апоптоза CD4+- и CD8+-icieTOK, которая сохранялась весь период исследования. Наличие такой корреляционной взаимосвязи в группе доноров выявлено не было. Наличие этой корреляции в группе больных гемобластозами, вероятно, объясняется апоптотическим действием ПХТ.

В следующем разделе предпринимается попытка ответить на вопрос, отражается ли лимфопения на функциональном состоянии Т-клеток, и в какой степени это выражено у больных гемобластозами с разным исходом трансплантации. Для того чтобы охарактеризовать состояние Т1/Т2 баланса у больных гемобластозами до и после АТПСКК, было исследовано относительное количество продуцентов IFN-y и IL-4 среди CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов.

До АТПСКК в группе с ремиссией отмечается достоверное повышение количества (38,13±19,02) Т-хелперов 1 типа в сравнении с группой доноров. Таблица 15 Относительное количество Т-клеток, продуцирующих цитокины первого и второго типа в периферической крови больных гемобластозами после АТПСКК в сравнении со здоровыми донорами

Через 3 месяца после АТПСКК в группе А резко возрастает процент Т-хелперов 1 типа, в группе В происходит постепенное нарастание этого показателя в отличие от группы доноров. Группа В через 1 месяц после АПТСКК достоверно отличается по количеству Т-хелперов 2 типа от группы доноров. Через 6 и 9 месяцев после АТПСКК две подгруппы пациентов достоверно отличаются от группы доноров по показателям относительного количества Т-клеток, продуцирующих цитокины второго типа. Также через 3 месяца после АТПСКК в группе больных с последующим ранним рецидивом происходит достоверное увеличение количества Т-цитотоксических клеток 1 типа (51,88±6ДЗ) в сравнении с группой доноров (25,10±9,67). В группе больных в длительной ремиссии после АТПСКК количество Т-цитотоксических клеток 1 типа достоверно повышается через 6 месяцев после АТПСКК. Также в этой группе наблюдается достоверное снижение Т-цитотоксических клеток 2 типа весь период наблюдения после АТПСКК. В группе больных с последующим ранним рецидивом заболевания достоверное

снижение Т-цитотоксических клеток 2 типа наблюдается только через 6 месяцев после АТПСКК (Табл.15).

Было установлено, что наиболее выраженные изменения в соотношении Т-клеток, продуцирующих цитокины 1 и 2 типов, происходят через 3 месяца после АТПСКК в двух группах больных гемобластозами. При этом наблюдаются выраженные различия в количестве Т-клеток 1 типа у больных гемобластозами с разным исходом трансплантации. В группе больных с благоприятным исходом трансплантации наблюдается тенденция увеличения Т-клеток, продуцирующих цитокины 1 типа, в то время как в группе больных с последующим рецидивом основного заболевания через 6 месяцев после трансплантации происходит резкое снижение количества этих клеток.

Для нахождения критических значений показателей иммунного статуса, ассоциированных с достоверно повышенным/сниженным риском развития рецидива в течение года у больных гемобластозами после АТПСКК, нами проанализированы 11 диапазонов каждого признака, на которые каждый из показателей был предварительно разбит с использованием алгоритма квантильного анализа по Мостеллеру и Тьюки (см. раздел «Материалы и методы»). Вычисление критических значений показателей основывалось на сравнительном статистическом анализе групп пациентов в ремиссии (класс Ai) и с рецидивом в течение года (класс А2). Критические значения показателей иммунного статуса, полученные в результате проведенного анализа, представлены в табл. 16. Таблица 16

CD8+IL4+ через 1 месяцпосле АТПСКК: 0,63% (п-5) 83,3% (п=3) 30,0% 0,0559 0,05 0,39 ± 0,22 0,05 11,7 Ai - пациенты в ремиссии; А2 - пациенты с рецидивом в течение года; Ptmf -достоверность различий встречаемости признака точным методом Фишера; Р_ % 2 достоверность различий встречаемости признака методом % 2; R - коэффициент корреляции Пирсона; Р - достоверность коэффициента корреляции Пирсона; RR -относительный риск развития рецидива в течение года.

Как видно из данных, обобщенных в таблице, развитие рецидива в течение года после АТПСКК достоверно взаимосвязано с большинством исследуемых нами показателей (р 0,01). Коэффициент положительной ассоциации Пирсона между показателями иммунного статуса и развитием рецидива достигает весьма заметной величины (0,30-0,46). Это свидетельствует о том, что найденные нами критические значения показателей имеют несомненное диагностическое и прогностическое значение. В частности, относительный риск развития рецидива в течение года после АТПСКК при наличии ряда критических значений показателей пролиферативной активности Т-клеток может повышаться в 20 раз по сравнению с общей выборкой больных гемобластозами.

Также для оценки прогностической значимости признаков вычислялась информативность каждого диапазона признака по соотношению двух вероятностей (P(Xij/ Al) и (P(Xij/ А2), где А] и А2 - соответственно группы пациентов в ремиссии и с ранним рецидивом после АТПСКК. Данные оценки информативности лабораторных признаков для распознавания пациентов с риском развития раннего рецидива после АТПСКК представлены в табл.17..

Корреляционные взаимосвязи в группе доноров

Для прогноза развития раннего рецидива на этапах до АТПСКК из полученных нами данных можно использовать следующий комплекс лабораторных показателей: относительное количество СБ4+-клеток в S,G2/M фазах клеточного цикла; относительное количество CD4+- и С08+-клеток памяти и концентрация IgM в сыворотке крови. Использование данного комплекса позволяет прогнозировать развитие раннего рецидива после АТПСКК еще на этапах подготовки больного к трансплантации. Несмотря на то, что группы больных гемобластозами достоверно не отличались по общепринятым критериям предлеченности, изначально в подгруппах больных перечисленные выше показатели были различны, поэтому применяемый нами комплекс показателей может выступать в роли дополнительных критериев в раннем прогнозе развития рецидива в течение года после АТПСКК. Вероятно, что различия в степени лимфопении, интенсивности пролиферации Т-лимфоцитов и в соотношении наивных Т-клеток и Т-клеток памяти в подгруппах больных гемобластозами отражают разную чувствительность к курсам ПХТ. Через 3 месяца после АТПСКК диагностическое значение в развитии раннего рецидива имеет относительное количество СЭ8+-клеток в S,G2/M фазах клеточного цикла и относительное количество СБ8+-клеток в апоптозе. Абсолютное количество С016+-клеток до АТПСКК более 151 кл/мкл является признаком благоприятного исхода АТПСКК.

В литературе последних лет есть данные, что ар-Т-клетки и NK-клетки могут сдерживать гомеостатическую пролиферацию у8-Т-клеток. Вероятно, что подавление гомеостатической пролиферации в рассматриваемой ситуации обусловлено конкуренцией за IL-15 (French J.D., et al. 2005). По нашим данным, увеличение абсолютного количества NK-клеток выше 151 клЛмкл до трансплантации является диагностическим признаком благоприятного исхода АТПСКК. Периферическая экспансия у8-Т-клеток -это внетимусный путь восстановления кроветворения. Только в условиях микроокружения тимуса может сформироваться рецептор для распознавания антигена - TCR а3-типа. Мы установили, что относительное количество СБ4+-клеток в S,G2/M фазах клеточного цикла более 21,4% до АТПСКК имеет очень высокий диагностический коэффициент (10,2) в прогнозе развития раннего рецидива, при этом абсолютное количество NK-клеток до АТПСКК выше 151 клЛмкл является признаком благоприятного исхода АТПСКК. Можно предположить, что высокая пролиферативная активность Т-клеток до АТПСКК в группе пациентов с рецидивом связана с небольшим количеством NK-клеток в периферической крови, которые не способны в полном объеме ингибировать внетимусную гомеостатическую пролиферацию Т-клеток. Как уже говорилось выше, NK-клетки обладают противоопухолевой активностью и видимо, поэтому их увеличение является благоприятным признаком у больных гемобластозами.

Из полученных нами данных следует, что риск развитие раннего рецидива в течение года после трансплантации у больных гемобластозами может зависеть от показателей клеточного цикла Т-клеток до АТПСКК.

Анализируя информативность параметров иммунного статуса для прогноза развития осложнений в процессе восстановления кроветворения у больных гемобластозами после АТПСКК, мы видим, что к прогностически значимым показателям добавляются параметры гуморального и макрофагального звеньев иммунной системы. При этом повышенное количество фагоцитирующих гранулоцитов и моноцитов, но со сниженной продукцией перекиси водорода является риском развития осложнений. Группа больных, у которых не было осложнений в период восстановления кроветворения после АТПСКК, характеризуется низким процентом фагоцитов, способных захватить чужеродные частицы, но с повышенной продукцией перекиси водорода. В то же время больные, у которых процесс восстановления проходил с осложнением, характеризуются более высоким процентом фагоцитирующих клеток, но уровень продукции перекиси водорода снижен. Также мы установили, что снижение сывороточного IgA и повышение количества Th2 увеличивают риск развития осложнений в процессе восстановления клеточного пула после АТПСКК.

Учитывая полученные нами данные, следует думать, что для прогноза развития осложнений в процессе восстановления кроветворения у больных гемобластозами после АТПСКК наиболее диагностически информативными признаками являются показатели фагоцитарного звена иммунной системы и показатели клеточного цикла С08+-клеток.

Анализируя корреляционные взаимодействия между показателями апоптоза и пролиферации, мы выяснили, что показатели пролиферации разных субпопуляций исследуемых клеток прямо взаимосвязаны между собой во всех исследованных нами группах. Положительная корреляция между показателем апоптоза и пролиферации С04+-клеток характерна только для группы доноров. Для группы больных гемобластозами характерна положительная корреляционная связь между показателями апоптоза CD4+- и С08+-клеток. Можно предположить, что показатели пролиферации и апоптоза иммунокомпетентных клеток в организме связаны между собой общим цитокиновым статусом. Основной гуморальный фактор выживания и гомеостатической пролиферации наивных Т-клеток - это IL-7 (Brink M.R.M., et al. 2004), вспомогательный фактор гомеостатической пролиферации наивных Т-клеток и основной фактор гомеостатической пролиферации CD8+ 107 клеток памяти - IL-15 (Hasan M.S., et al. 2000; Hakim F.T., et al. 2005). Также вспомогательными факторами гомеостатической пролиферации наивных Т-клеток являются IL-4 и IL-12, а СЭ8+-клеток памяти - IL-12 и IL-18 (Haynes B.F., et al. 2000). При этом IL-2 ингибирует гомеостатическую пролиферацию CD8+-KJieTOK памяти (конкурирует с IL-15) и подавляет гомеостатическую пролиферацию наивных Т-клеток, отменяя эффект IL-12 (Khaled A.R., et al. 2002). Также, по данным литературы баланс между IL-2 и IL-7 определяет способность клеток к пролиферации или повышение чувствительности клеток к Fas опосредованному апоптозу (Jaleco S., et al. 2003; Fry Т.J., et al. 2001). Существует обратная корреляция между концентрацией IL-7 в сыворотке крови больных СПИДом и выраженностью ГП их Т-клеток, отсутствующая у здоровых людей (подобной корреляции с уровнем IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-15 не обнаружено) (McCune J.M., et al. 2000). Подобная корреляция обнаружена также в процессе восстановления численности Т-клеток при их трансплантации облученным реципиентам (Hellerstein М., et al. 1999), при идиопатической недостаточности СБ4+-клеток, а также после химиотерапии (McCune J.M., et al. 2000). Это позволяет предположить, что концентрация в сыворотке перечисленных цитокинов во многом определяет различия нормальных и патологических взаимоотношений апоптоза и пролиферации Т-клеток и моноцитов.