Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Опыт медико-биологических исследований :видетельствует, что данные, полученные на традиционных эксперимен-альных моделях, т.е. на низших животных, имеют ограниченную ценность 1Ля медицинских экспериментов. В связи с этим особую актуальность іредставляют исследования на обезьянах - животных наиболее близких че-ювеку, образующих с ним отряд приматов.
Чаще всего при моделировании заболеваний человека используются )безьяны рода макак. Это обусловлено их относительно невысокой стои-юстью и удобством работы с небольшими животными. Особое значение по-гучили исследования на макак лапундерах, после того как в 1991 году ^следователями из Вашингтонского приматологического центра было пока-іано, что эти животные могут быть инфицированы HIV-1 [Agy et al., L992]. Однако проведение подобных исследований требуют подробной информации по всем показателям ферментных, иммунной и других систем ма-сак, в частности, альфа-1-антитрипсина (ААТ) - как важной системы ингибитора протеаз.
ААТ - основной ингибитор протеаз в сыворотке крови - обнаруживает гсолиморфность у человека. Локус, контролирующий синтез ААТ, обозначается как Protease ingibitor (Pi), а входящие в него аллели как Рі-сис-гема [Сох et al., 1980]. В исследованиях ААТ можно выделить два аспекта. Первый из них, медицинский, возник в результате обнаружения тесной ассоциации некоторых фенотипов ААТ с заболеваниями человека - прежде всего эмфиземой легких и ювенильныи циррозом печени [Laurell et al., 1963; Sharp et al., 1969]. Другой, биологический, связан с использованием данных о полиморфизме этого белка в работах по молекулярной сие-
тематике и эволюции приматов [Omoto et al., 1970; Weiss et al.. 1973; Nozava et al.. 1977; Melnick et al.. 1985].
Несмотря на то, что изучению полиморфизма ДАТ макак посвящены ряі исследований [Omoto et al., 1970; Nozava et. al.. 1977: Kueppers et. al., 1977; Tanaka, 1991], на сегодняшний день остается открытым вопрос о полиморфизме ЛАТ у обезьян. Это связано с тем, что данные основывались на электрофоретических картинах и не всегда проводилась идентификация белка.
Известно, что определение ААТ может основываться как на ферментативной активности этого белка, так и на его иммунологической реактивности. Существенным недостатком подхода, основанного на ферментативної активности, является его неспецифичность, так как он регистрирует общую антипротеазную активность, а последняя определяется не только ААТ, но и целым рядом других антипротеаз (альфа-2-макроглобулин, аль-фа-1-химотрипсин и др.). Поэтому несомненно преимущество иммунологического метода определения ААТ. Для последнего могут служить монокло-нальные антитела (МАТ), обладающие строгой специфичностью. Но несмотря на значительное сходство ААТ человека и обезьян [Kueppers et al., 1968], между ними существует и отличие. Техническим решением ЭТО) проблемы является получение штамма гибридных клеток, продуцирующих ИА' к антигенной детерминанте и реагирующих с ААТ как человека и обезьян Однако у нас такие МАТ пока на описаны и коммерчески не выпускаются Все это определяет актуальность данного научного исследования.
Получить гибридные клетки, продуцирующие MAT против антигенной де терминанты ААТ, общей для человека и обезьян и изучить полиморфизм АА у 9 видов макак различного происхождения.
ЗАДАЧИ:
1.Получить высокоспецифические моноклональные антитела к общей лтигенной детерминанте ААТ человека и обезьян.
2.Исследовать распространение различных фенотипов и частот алле-іей ААТ у макак, происходящих как из мест естественного обитания так и южденных в неволе.
3.Доказать реальность обнаруженных аллелей в семейном анализе.
4.Изучить микрогетерогенность исследуемого белка с последующим іммунологическим проявлением.
5.Определить перекрестную реактивность полученных МАТ в отношении 1АТ разных родов и видов приматов, а также разных аллельных вариантов шутри одного рода.
Автором впервые получены МАГ к общей антигенной детерминанте че-гсовека и обезьян. Полученные МАТ являются уникальными, т.к. они секре-гируют антитела, реагирующие с высокой эффективностью с ААТ как чело-зека, так и обезьян. Подобных штаммов в научной и патентной литературе тока'не описаны и получены впервые.
МАТ против ААТ человека, полученные ранее за рубежом и у нас, выпускаются рядом фирм. Однако, в отличие от МАТ, полученных в данной работе, они не охарактеризованы в отношении их реактивности с ААТ обезьян, что существенно ограничивает их использование в экспериментах яа обезьянах.
В настоящем исследовании впервые изучен полиморфизм ААТ у многих видов макак с использованием ранее не применявшихся подходов: изоэ-
лектрофокусирование (ИЭФ) в полиакриламидном геле в сочетании с иммунологической идентификацией ААТ и семейный анализ.
Особый интерес представляют исследования, касающиеся обезьян известного происхождения, т.е. рожденных в питомниках. Для этого были использованы данные зоотехнического архива питомников обезьян института экспериментальной патологии и терапии (ИЭПиТ, г.Сухум). Эти данные легли в основу проведения семейного анализа. Последний позволил подтвердить впервые реальность выявленных аллелей. Применение метода ИЭФ позволило постулировать существование новых аллелей у исследованных макак, которые не обнаруживались при традиционном подходе, т.е. электрофорезе в кислом крахмальном геле.
Тот факт, что большинство аллелей Ріяас, идентифицированных с помощью ИЭФ, являются видоспецифичными , изменяют существующее представление об общности аллелей Рігаас для различных видов макак.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ Результаты данной работы несомненно представляют практический интерес. Так, новые данные о частотах аллелей ААТ обезьян, разводимых і неволе, могут использоваться в популяционно-генетических исследована ях, работах по молекулярной систематике и эволюции приматов, а такж при контроле скрещивания обезьян.Уточненные частоты аллелей в природ ных популяциях обезьян могут быть использованы в последующем для оцен ки генетического расстояния между различными видами макак и времене их дивергенции.
Полученные МАТ могут применяться с высокой эффективностью дл определения ААТ как человека так и обезьян. Это позволяет отказатьс от дорогих импортных поликлональных антисывороток и отечественных низ кого качества.
Гибридомы, продуцирующие МАТ, депонированы во Всесоюзной коллек-ии клеточных культур (Институт цитологии АН СССР, г.Ленинград), (За-вка N4865393/13 (094966), получено авторское свидетельство на изобре-ение под N1756352 и опубликовано в бюллетени "Открытия. Изобретения", 31. 1992).
ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ Количественное определение ААТ с помощью МАТ внедрено в практику іитомников обезьян ИЭПиТ для контроля за состоянием обезьян во время їх акклиматизации. Предложена модифицированная версия Pimac-системы, источающая 18 аллелей, вместо описанных ранее пяти вариантов. Результаты исследования используются в лаборатории иммунологии и биотехнологии для конкретных экспериментальных и научных исследованиях.
