Содержание к диссертации
Список использованных сокращений 4
Введение 5
Глава I. Обзор литературы. Современное состояние проблемы
введения лейкоцитов в холодовой анабиоз при температуре -20С
Функциональные свойства лейкоцитов 12
Методы получения лейкоцитного концентрата и его применение 19
1.3 .Сроки хранения лейкоцитов при различных температурах 22
1.4. Концепции и теории криоповреждения и криозащиты
плазматических мембран 23
1.5. Криопротекторы и криоконсерванты, используемые при
замораживании лейкоцитов 31
1.6. Методы криоконсервирования лейкоцитов 40
Глава II. Материалы и методы исследований 47
Глава III. Результаты экспериментальных исследований
3.1. Разработка метода введения лейкоцитов в холодовой анабиоз
при-20С 54
3.1.1. Применение экспоненциальной программы для замораживания
лейкоцитов до -20С 54
Выбор оптимального состава хладоограждающего раствора 55
Изучение влияния длительности хранения применяемого хладоограждающего раствора на сохранение его криозащитных
свойств.... 61
3.2. Исследование функциональных и морфологических свойств лейкоцитов
крови человека до введения в холодовой анабиоз.(—20С) и после выхода из
него 62
3.2.1. Действие криозащитного раствора на сохранность лейкоцитов 62
ф
Определение оптимального срока хранения лейкоцитов 65
Исследование функциональных и морфологических
свойств лейкоцитов крови человека при оптимальном сроке хранения
с разными вариантами хладоограждающего раствора 75
3.3. Изучение биологических особенностей разработанного
хладоограждающего раствора для лейкоцитов 78
Изучение «острой токсичности» хладоограждающего раствора 78
Изучение «хронической токсичности» хладоограждающего раствора 79
Изучение пирогенности хладоограждающего раствора 85
Изучение переносимости экспериментальными животными трансфузий концентрата лейкоцитов, замороженных с
разработанным хладоограждающим раствором 85
Глава IV. Обсуждение результатов экспериментальных исследований 88
Выводы 99
Список использованной литературы 101
Список опубликованных работ по теме диссертации 121
;*
Список использованных сокращений
АФК - активные формы кислорода
БТШ - белки теплового шока
ГМБТОЭМ - гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина
ГМФШ - гексозомонофосфатный шунт
ГФ - Государственная Фармакопея
ГЭК - гидроксиэтилкрахмал
ДМАЦ - диметилацетамид
ДМСО - диметилсульфоксид
ЛД5о- средняя летальная доза
ЛК - лейкоцитный концентрат
МПО - миелопероксидаза
НАДФ - никотинамиддинуклеотидфосфат
НСТ - нитросиний тетразолий
ОМЭПС - оксиметилэтилпиридина сукцинат
ПВП - поливинилпирролидон
ПД - пропандиол
ПОЛ - перекисное окисление липидов
РНИИГТ - Российский НИИ гематологии и трансфузиологии
ТМД - трансмембранные дефекты
ФАН - фагоцитарная активность нейтрофилов
ФИ - фагоцитарный индекс
ЭДТА Na2 - динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты
ЭКГ - электрокардиограмма
CDF - цитратфосфатдекстроза
'A
Введение к работе
Актуальность темы.
В настоящее время многими исследователями (Zhang Q., Tiersch T.R., 1995; Svedentsov Е.Р. et al., 1998; Goltsev A.N. et al, 2000; Halle P. et al, 2001; Nishimura M. et al, 2001; Сведенцов Е.П. и соавт., 2000, 2003, 2004;Осташко В.Ф., Осташко Ф.И., 2004; Смольянинова Е.И.и соавт., 2004) активно изучаются механизмы криоповреждения и криозащиты клеток животного происхождения. Большое внимание уделяется изучению физиологии клеток крови после воздействия различных стресс-факторов, в том числе отрицательных температур (Терентьева Э.И. и соавт., 1966; Цуцаева А.А. и соавт., 2004). Ядерные клетки крови обладают сложной внутренней
& организацией, повышенными процессами метаболизма и являются весьма
неустойчивыми к действию факторов холодового стресса (Белоус A.M., Грищенко В.И., 1994). Необходимость исследования физиологических свойств белых клеток крови человека и разработки способов сохранения их в
іф} биологически полноценном состоянии, прежде всего, связана с расширением
показаний к применению лейкоцитных концентратов (ЛК). Трансфузии ЛК являются эффективным средством профилактики и лечения инфекционного менингита, разлитого перитонита, сепсиса, лучевой болезни и других заболеваний (Ермолович СВ., 1981; Рыжков СВ. и соавт., 1992, 1995; Мельникова В.Н. и соавт., 1993; Cairo M.S. et. al., 1992; Bhatia S. et. al., 1994; Ханевич М.Д., Маринин A.B., 1995; Мирошниченко А.Г. и соавт., 1996; Neppert J., 1996; Herzog R., 1999; Балашов Д.Н., 2001).
На протяжении многих лет (Абезгауз Н.Н., Леонтович В.А., 1966; Пушкарь Н.С и соавт., 1978; Ермолович СВ., 1981; Аграненко В.А. и соавт., 1982; Утемов СВ. и соавт., 1995, 1999; Сведенцов Е.П. и соавт., 1999, 2000, 2004) ведется поиск оптимальных методов замораживания и хранения лейкоцитов в состоянии холодового анабиоза. Накопленный опыт
свидетельствует о том, что сохранить в биологически полноценном состоянии лейкоциты при положительной температуре (+4С) можно до 24 часов (Цуцаева А.А., 1983), при температуре от 0С до -4С - до 48 часов (Белоус A.M., Грищенко В.И., 1994), при -5С в условиях гипербарии (при 400 атм) - до 3 недель (Павленко Р.А. и соавт., 1988), при -60С --80С - до 12 месяцев (Лаврик С.С., Когут Г.И., 1971; Утемов СВ., 1995; Galmes A., et al., 1996; Halle P. et al., 2001), а при -196C - в среднем до 20 месяцев (Лобынцева Г.С. и соавт., 1974; Пушкарь Н.С. и соавт., 1974; Аграненко В.А. и соавт, 1982, 1997).
Анализ данных литературы позволяет заключить, что существующие методы замораживания до -196С и хранение при данной температуре, хотя и являются наиболее результативными, но в тоже время требуют применения дорогостоящего криогенного оборудования, жидкого азота и привлечения высококвалифицированного обслуживающего персонала, что делает технологию криоконсервирования сложной, громоздкой и экономически неэффективной, существенно затрудняет ее использование в криобиологической практике.
Поэтому весьма актуальным является создание простого, эффективного и экономичного метода введения лейкоцитов в холодовой анабиоз без использования жидкоазотной технологии при других температурах, в том числе субумеренно-низких (-15С-^-28С), тем более, что в отечественной и зарубежной литературе метод сохранения лейкоцитов в функционально полноценном состоянии при температуре -20С не описан.
Для защиты различных клеток организма от неблагоприятного воздействия холодового стресса используют различные криопротекторы: глицерин, диметилсульфоксид (ДМСО) и другие, которые не являются абсолютно безвредными для организма и требуют удаления перед их применением с помощью отмывания (Аграненко В.А., Тибилова Н.Н.,1997). Менее токсичный криопротектор диметилацетамид (ДМАЦ) в нашей стране
не производится. Поэтому необходима разработка нетоксичного, эффективного и не требующего отмывания хладоограждающего раствора. С другой стороны, для сохранения функциональной активности клеток
^ требуется применение щадящей и нетрудоемкой программы охлаждения.
Данным условиям отвечает экспоненциальная программа замораживания (Гордиенко Е.А., Пушкарь Н.С., 1994).
Таким образом, для изучения физиологических особенностей лейкоцитов, перенесших холодовой анабиоз при -20С, актуальной остается разработка технологии замораживания и хранения их в условиях субумеренно-низких температур.
Разработка данного метода сохранения лейкоцитов в полноценном состоянии имеет и большое теоретическое значение, так как касается
v у высокодифференцированных со сложными функциями клеток организма.
Выяснение условий введения таких клеток в холодовой анабиоз при данной температуре и выведения из него создаст теоретическую основу для разработки подобных методов в отношении высокоорганизованных клеток и
'^ тканей организма млекопитающих и человека.
Цель исследования - определить функциональную активность лейкоцитов, перенесших холодовой анабиоз при -20С, достигнутый применением экспоненциальной программы охлаждения и нового криозащитного раствора.
Задачи исследования:
1. С целью выбора оптимального хладоограждающего раствора провести
, >, сравнительную характеристику влияния трех вариантов растворов (№№
1, 2, 3) на сохранение жизнеспособности и функциональной активности лейкоцитов крови человека, замороженных по экспоненциальной программе до -20С и хранившихся в условиях холодового анабиоза в течение 24 часов
(і>
*
2. Изучить жизнеспособность и морфологический состав лейкоцитов,
фагоцитарную и метаболическую активность нейтрофилов и моноцитов,
перенесших криоанабиоз (-20С) продолжительностью 1-90 суток под
Ф защитой оптимального варианта хладоограждающего раствора.
3. Оценить в опытах на животных острую и хроническую токсичность и
пирогенность оптимального хладоограждающего раствора и установить
переносимость аутологичных лейкоцитных концентратов после их
хранения в течение 1 суток при -20С.
Научная новизна. В лабораторно-экспериментальном исследовании
впервые изучены функциональные и морфологические свойства лейкоцитов,
вышедших из холодового анабиоза при -20С, достигнутого с
использованием оригинального хладоограждающего раствора и
экспоненциальной программы замораживания, показано, что в этих условиях
сохранить фагоцитарную активность нейтрофилов и моноцитов, целостность
плазматической мембраны лейкоцитов, стабильность их морфологического
'^ состава и их общее количество на высоком уровне возможно в течение 21
суток.
Теоретическая и практическая значимость. Результаты работы
расширяют представления о механизмах криоповреждения и криозащиты
лейкоцитов крови человека, в том числе о высокой жизнеспособности
лейкоцитов в условиях применения гексаметиленбистетраоксиэтилмочевины
(ГМБТОЭМ) и оксиметилэтилпиридина сукцината (ОМЭПС) при -20С.
у Дано научное обоснование криозащитных свойств разработанного
хладоограждающего раствора, ингредиентами которого являются вещества отечественного производства - криопротектор смешанного действия ГМБТОЭМ и мембраностабилизирующее и антиоксидантное вещество -ОМЭПС. На данный раствор получен патент на изобретение № 2240000
(РФ) от 20.11.2004 года. Кроме того, в опытах на экспериментальных животных доказана безвредность этого раствора на клеточном и организменном уровнях. Для высокой функциональной и морфологической
ф сохранности лейкоцитов крови человека, подвергнутых холодовому анабиозу
при-20С, предложен эффективный недорогостоящий и доступный метод, включающий в себя применение хладоограждающего раствора, медленной экспоненциальной программы охлаждения, быстрого отогрева. Доказано, что применение экспоненциальной программы замораживания лейкоцитов обеспечивает высокую эффективность криоконсервирования и является более предпочтительной, т.к. она значительно сокращает продолжительность и трудоемкость процедуры замораживания, подходит для взвеси, содержащей разные популяции клеток. Установлено, что для осуществления
v; данной процедуры замораживания не требуется применение дорогостоящей
жидкоазотной технологии, возможно использование электрического морозильника для осуществления экспоненциальной программы и не требуется высокой квалификации обслуживающего персонала. На основе
^ данных об отсутствии пирогенности, острой и хронической токсичности
оригинального хладоограждающего раствора, о полноценной
морфофункциональной сохранности замороженных с ним клеток дано заключение о возможности и безопасности внедрения его в работу научных лабораторий и криобиологическую практику.
Основные положения, выносимые на защиту:
Функциональная активность и морфологическая полноценность лейкоцитов, введенных в холодовой анабиоз при -20С, сохраняются на высоком уровне в течение 21 суток.
Хладоограждающий раствор, содержащий ГМБТОЭМ и ОМЭПС, и являясь нетоксичным, апирогенным, не требующим отмывания после
оттаивания биообъекта, способствует сохранению функциональной
активности лейкоцитов, подвергнутых криоанабиозу при -20 С.
3. Экспоненциальная программа введения лейкоцитов в холодовой анабиоз
ф способствует сохранению их жизнеспособности и потому наряду с
разработанным хладоограждающим раствором может использоваться для замораживания лейкоцитов при температуре -20С.
Апробация работы. Результаты работы доложены на Всероссийской
научной конференции «Актуальные проблемы регионального экологического
мониторинга: теория, методика, практика» (Киров, 2003), на заседании
Кировского отделения физиологического общества имени И.П. Павлова
(Киров, 2004), на научной сессии Кировского филиала Российской Академии
Естествознания (Киров, 2004), Ученом Совете Института физиологии Коми
НЦ УрО РАН (Сыктывкар, 2004), Международной конференции
«Сохранение генетических ресурсов» (Санкт- Петербург, 2004), заседании
Кировского областного научного общества гематологов и трансфузиологов
^ (Киров, 2005).
Личное участие автора в получении результатов. Автором были выполнены все исследования по изучению функциональных свойств нативных и размороженных лейкоцитов и проведена статистическая обработка результатов исследования. Автор принимал участие в разработке метода введения лейкоцитов в холодовой анабиоз при -20С, в проведении биологических испытаний криозащитного раствора и в написании статей.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 3 в центральной печати; имеется 1 патент.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 122
машинописных страницах, состоит из «Введения», четырех глав (обзор
литературы, материалы и методы исследований, результаты
экспериментальных исследований, обсуждение результатов
экспериментальных исследований), «Выводов», «Списка использованной литературы» (203 источника, в т.ч. 70 зарубежных авторов), «Списка работ, опубликованных по теме диссертации». Диссертация содержит 28 таблиц, 13 рисунков.
