Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Особенности проведения программы вспомогательных репродуктивных технологий у супружеских пар, где мужья являются носителями микроделеций в azf локусе хромосомы Y (обзор литературы) 13
1.1. Основные принципы и подходы к проведению стимуляции суперовуляции у пациентов в программе ВРТ 13
1.2. Роль мужского фактора в формировании бесплодия у супружеских пар 17
1.3. Современные аспекты проблемы мужского бесплодия, ассоциированного с мутацией в AZF локусе хромосомы Y 25
1.4. Персонифицированная терапия в рамках программы ВРТ посредством применения преимплантационной генетической диагностики (ПГД) у супружеских пар с микроделецией AZF локуса хромосомы Y 38
Глава 2. Материал и методы исследования 41
2.1. Материал исследования 41
2.2. Методы исследования 43
2.2.1. Общеклинические методы исследования 45
2.2.2. Гормональное исследование 46
2.2.3. Ультразвуковое исследование органов малого таза 47
2.2.4. Спермиологическое исследование эякулята 48
2.2.5. Анализ микроделеций в AZF локусе хромосомы Y 50
2.2.6. Исследование кариотипа пациентов 52
2.2.7. Схемы стимуляции функции яичников 52
2.2.8. Трансвагинальная пункция яичников 54
2.2.9. Метод интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит и культивирование дробящихся эмбрионов in vitro 54
2.2.10. Перенос эмбрионов в полость матки 56
2.2.11. Поддержка посттрансферного периода 56
2.2.12. Преимплантационная генетическая диагностика 57
2.2.13. Статистический анализ полученных данных 58
Глава 3. Результаты собственных исследований 60
3.1. Клинико-анамнестическая характеристика супружеских пар, включенных в исследование 61
3.1.1. Возрастная характеристика супружеских пар 62
3.1.2. Характеристика менструальной функции женщин 64
3.1.3. Характеристика супружеских пар по репродуктивному анамнезу 65
3.1.4. Характеристика женщин по перенесенным гинекологическим заболеваниям и оперативным вмешательствам 68
3.1.5. Характеристика мужчин по типу патозооспермии 70
3.2. Результаты клинико-лабораторного обследования пациентов 71
3.2.1. Анализ микроделеций в AZF локусе хромосомы Y у
мужчин с различными отклонениями в показателях спермограммы 71
3.2.2. Сравнительный анализ параметров гормонального статуса, фолликуло-, оогенеза и раннего эмбриогенеза у супружеских пар, включенных в программу ЭКО/ИКСИ 76
3.2.3. Сравнительный анализ результатов генетической диагностики эмбрионов супружеских пар, включенных в программу ЭКО/ИКСИ с ПГД 84
3.2.3.1. Анализ структуры и частоты анеуплоидии половых хромосом у эмбрионов 97
3.2.3.2. Анализ структуры и частоты анеуплоидии хромосомы 13 у эмбрионов 101
3.2.3.3. Анализ структуры и частоты анеуплоидии хромосомы 18 у эмбрионов 103
3.2.3.4. Анализ структуры и частоты анеуплоидии хромосомы 21 у эмбрионов 106
3.2.4. Анализ выживаемости эмбрионов после проведения преимплантационной генетической диагностики . 110
3.2.5. Анализ исходов программ ЭКО/ИКСИ в обследованных группах 117
Глава 4. Обсуждение результатов. Заключение . 129
Выводы 140
Практические рекомендации . 142
Список сокращений . 143
Список литературы . 145
- Основные принципы и подходы к проведению стимуляции суперовуляции у пациентов в программе ВРТ
- Метод интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит и культивирование дробящихся эмбрионов in vitro
- Характеристика женщин по перенесенным гинекологическим заболеваниям и оперативным вмешательствам
- Анализ выживаемости эмбрионов после проведения преимплантационной генетической диагностики
Введение к работе
Актуальность проблемы
Проблема бесплодного брака была и остается приоритетной в наше время (Серебренникова К.Г., 2010; Калинина Е.А., 2012). По данным статистики примерно 15% супружеских пар в популяции бесплодны, при этом на долю мужского фактора приходится около 50% случаев (Сухих Г.Т., Божедомов В.А., 2009; Вартанян Э.В., Петрин А.Н., 2010; Poongothai J., 2009; , 2010).
Микроделеции AZF локуса хромосомы Y (del AZF) – одна из главных генетических причин мужского бесплодия (Mafra F.A., 2011; , 2012; , 2012; , 2012). Распространенность данной мутации среди мужчин с выраженными отклонениями в показателях спермограммы широко варьирует в различных популяциях (Вартанян Э.В., Петрин А.Н., 2010; Ferlin A., 2007; Fu L., 2012; Chellat D., 2013; Choi D.K., 2013,), в среднем составляет 7,6% (Stouffs K., 2005).
По данным многочисленных исследований доказано, что делеции AZF локуса хромосомы Y могут передаваться от отца сыну, что впоследствии может привести к нарушению репродуктивной функции у потомства (Ferlin A., 2007; Gambera L., 2010; , 2012). Ряд исследователей предполагают, что наличие микроделеции в AZF локусе хромосомы Y приводит к общей нестабильности этой хромосомы и впоследствии может явиться пусковым механизмом в возникновении анеуплоидии у эмбрионов таких пациентов (интерхромосомный эффект). Результаты проведенных исследований указывают на то, что пациенты с del AZF входят в группу риска по рождению ребенка с хромосомной патологией вследствие наличия у них высокого уровня нуллисомии и дисомии гоносом в сперматозоидах (Ceylan C., 2010; Patrat С., 2010; Li L., 2013).
Проведение преимплантационной генетической диагностики (ПГД) в рамках программы вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) с исследованием не только комплекса половых хромосом, но и аутосом, с целью выбора для переноса в матку эмбрионов женского пола без генетической патологии может способствовать повышению эффективности программы ВРТ у таких пациентов.
В настоящее время литературные данные относительно исходов программ ВРТ у супружеских пар с del AZF немногочисленны, представлены на малых выборках, освещены недостаточно полно и противоречивы (Van Golde R.T.J., 2001; Gambera L., 2010; Patrat С., 2010; Wu W., 2011; Kim M.J., 2012). Поэтому представляется актуальной комплексная оценка исходов программ ЭКО/ИКСИ и определение целесообразности применения ПГД для оптимизации программы ВРТ у данного контингента пациентов.
Цель исследования: оптимизация программы ЭКО/ИКСИ у супружеских пар с микроделецией AZF локуса хромосомы Y.
Задачи исследования
-
Оценить распространенность и структуру микроделеций AZF локуса хромосомы Y у пациентов с патозооспермией, планирующих проведение программы ЭКО/ИКСИ.
-
Провести сравнительную оценку параметров клинического и гормонального статуса у супружеских пар с делецией в AZF локусе хромосомы Y и без нее.
-
Изучить особенности фолликуло-, оогенеза и раннего эмбриогенеза у супружеских пар с микроделецией AZF локуса хромосомы Y и без нее.
-
Оценить хромосомный набор эмбрионов (частоту и структуру распространенных анеуплоидий) у супружеских пар с микроделецией AZF локуса хромосомы Y и без нее и выявить возможные корреляции с применяемыми протоколами стимуляции суперовуляции.
5. Провести сравнительную оценку результатов программ ЭКО/ИКСИ и исходов
беременностей у супружеских пар с мутацией в AZF локусе хромосомы Y при проведении
ПГД и без нее и определить роль ПГД в оптимизации исходов программы ВРТ у данной
категории пациентов.
6. Разработать практические рекомендации по реализации программы ВРТ у данного
контингента больных.
Научная новизна По результатам проведенного исследования научно обоснована необходимость персонифицированного подбора протоколов для стимуляции функции яичников у супружеских пар с del AZF. Проведен анализ влияния протоколов стимуляции суперовуляции на развитие анеуплоидии у эмбрионов таких больных.
Определена частота хромосомных нарушений и получены новые данные о структуре анеуплоидии хромосом 13, 18, 21 и гоносом у эмбрионов супружеских пар с del AZF и без нее. Методом бинарной логистической регрессии впервые установлены факторы, достоверно влияющие на выживаемость эмбрионов у данной категории пациентов.
Проведена сравнительная оценка результативности программ ЭКО/ИКСИ и исходов беременностей у супружеских пар с del AZF с проведением ПГД и без нее. Представлена и научно обоснована целесообразность проведения ПГД в рамках программы ВРТ у данного контингента больных.
Практическая значимость
На основании проведенного исследования определена необходимость проведения медико-генетического консультирования с исследованием AZF локуса хромосомы Y на этапе подготовки к программе ВРТ всем супружеским парам с бесплодием, обусловленным мужским фактором.
В результате исследования выявлена высокая частота хромосомной патологии (как половых хромосом, так и аутосом) у эмбрионов супружеских пар с del AZF, что определяет целесообразность проведения ПГД в рамках программы ВРТ у данной категории пациентов.
Полученные данные по эффективности программ ЭКО/ИКСИ выявили высокий риск самопроизвольного прерывания беременности у супружеских пар с del AZF. Анализ результатов исследования показал, что применение ПГД в рамках программы ЭКО/ИКСИ у данной категории пациентов позволяет достоверно снизить частоту репродуктивных потерь и увеличить частоту родов.
Адекватное проведение стимуляции функции яичников с персонифицированным подбором протоколов стимуляции и последующим проведением ПГД с переносом в матку эмбрионов женского пола без распространенных анеуплоидий для оптимизации программы ВРТ способствуют повышению результативности программы и увеличивают вероятность рождения здорового ребенка у супружеских пар с del AZF. Разработаны практические рекомендации по реализации программы ВРТ у таких пациентов.
Положения, выносимые на защиту
-
Наличие микроделеции в AZF локусе хромосомы Y у мужчин супружеских пар с бесплодием оказывает влияние на развитие эмбрионов уже в период первых трех суток после ИКСИ, вследствие чего 31,5% эмбрионов, потенциально пригодных для переноса в матку или для проведения генетической диагностики, останавливаются в своем развитии, что влияет на эффективность программы ЭКО/ИКСИ.
-
Пациенткам из супружеских пар с делециями в AZF локусе хромосомы Y следует персонифицировано подбирать протоколы стимуляции в рамках программы ЭКО/ИКСИ. Основной принцип выбора протокола заключается в получении большего количества фолликулов и ооцитов «хорошего» качества с целью увеличения количества эмбрионов для диагностики и переноса в матку при минимизации побочных эффектов и циклов с отменой переноса эмбрионов.
-
Выявленный у эмбрионов супружеских пар с мутацией AZF локуса хромосомы Y высокий уровень анеуплоидии (59,7%) с преобладанием в структуре патологии мутаций, при которых эмбрионы имеют высокий потенциал к имплантации и дальнейшему развитию, а также отсутствие взаимосвязи между морфологическими характеристиками эмбриона и наличием у него хромосомной патологии, свидетельствуют о необходимости проведения ПГД в рамках программы ВРТ для исключения переноса в матку эмбрионов с анеуплоидией по исследованным хромосомам и минимизации риска рождения больного ребенка.
-
Перенос эмбрионов женского пола без распространенных анеуплоидий в рамках ПГД у супружеских пар с мутацией в AZF локусе хромосомы Y способствует повышению эффективности программы ВРТ и увеличению количества родов в 7 раз, что указывает на целесообразность использования данной методики у таких пациентов.
Личный вклад автора Автор непосредственно участвовал в выборе направления исследования, разработке цели и задач исследования, обобщении, анализе, статистической обработке полученных результатов. Автором лично произведено обследование супружеских пар и участие во всех этапах лечения методом ЭКО, в анализе результатов генетической диагностики эмбрионов.
Соответствие диссертации паспорту полученной специальности
Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.01.01 – «акушерство и гинекология». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 4 и 5 паспорта акушерства и гинекологии.
Апробация материалов диссертации
Основные положения диссертации и результаты работы представлены и доложены на 4t h Asia Pacific Congress on Controversies in Obstetrics Gynecology and Infertility (COGI): Building Consensus in Gynecology, Infertility and Perinatology (BCGIP) (Bangkok, 2011); VI Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2012 г.); XIII Всероссийском научном Форуме «Мать и Дитя» (Москва, 2012); научно-практической конференции «Прошлое, настоящее и будущее ВРТ (памяти профессора Б.В. Леонова)» (Москва, 2013). Работа обсуждена на межклинической конференции отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия (22.11.2013) и заседании апробационной комиссии ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России (02.12.2013).
Внедрение результатов исследования в практику
Исследование AZF локуса хромосомы Y у супружеских пар с бесплодием, обусловленным мужским фактором, и применение ПГД в рамках программы ВРТ у данного контингента пациентов внедрены в практическую деятельность отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России.
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из которых 4 статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации
Основные принципы и подходы к проведению стимуляции суперовуляции у пациентов в программе ВРТ
Проблема бесплодного брака была и остается приоритетной в наше время [5, 19, 20]. По данным статистики примерно 15% супружеских пар в популяции бесплодны, и тенденции к снижению этого показателя не наблюдается. Следует подчеркнуть, что меняется сама структура бесплодия. Если 20 лет назад в структуре бесплодия мужской фактор составлял примерно 30%, то в настоящее время на его долю приходится уже 50% случаев [1, 21, 95, 108].
Современные подходы к диагностике и лечению супружеских пар с бесплодием основаны на достижениях фундаментальных наук в области изучения молекулярно-генетических процессов, заложенных в основе реализации процесса репродукции у человека. Расшифровка механизмов гормональной регуляции репродуктивной системы способствовала созданию и эффективному использованию различных соединений, воздействующих на ее различные уровни.
За последние десятилетия гонадотропины заняли лидирующие позиции в линейке препаратов для лечения бесплодия. За время применения менопаузальных гонадотропинов (ЧМГ) были разработаны, тщательно изучены и внедрены в широкую клиническую практику различные схемы стимуляции функции яичников с использованием комбинированных препаратов, содержащих фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) и лютеинизирующий гормон (ЛГ), а также препаратов, в которых содержится только ФСГ [4].
В 1985 году успешный синтез человеческого ФСГ открыл новые перспективы в лечении бесплодия методом ЭКО. Рекомбинантный ФСГ (рФСГ) обладает рядом несомненных преимуществ – не содержит вирусных белков, углеводов и стероидных примесей, обладает высокой биологической активностью. Кроме того, в препарате отсутствует даже следовая активность ЛГ. Однако, несмотря на явные качественные преимущества рФСГ, в течение многих лет не утихают споры относительно сравнительной эффективности и безопасности применения мочевых и рекомбинантных препаратов [4, 65, 113].
В ретроспективном исследовании типа случай-контроль Petanovski Z., и соавторы (2011) провели сравнительную оценку результатов применения рФСГ и ЧМГ. Было выявлено, что при применении рФСГ результативность проведения стимуляции суперовуляции выше (большее количество ооцитов при лучшем их качестве), при этом возможен подбор индивидуальной дозировки препарата. Следовательно, авторы делают вывод, что применение для стимуляции функции яичников рФСГ является более оптимальным, чем ЧМГ, что согласуется с данными других авторов [112, 113].
Химическая структура гонадотропин-рилизинг гормона (ГнРГ) была расшифрована в 1971 году Schally F. и Guillemin B. За это открытие ученые получили Нобелевскую премию. Так, начался новый период в репродуктивной гинекологии, ознаменованный использованием в клинической практике препаратов – аналогов ГнРГ – агонистов ГнРГ (а-ГнРГ) и антагонистов ГнРГ (ант-ГнРГ). При продолжительном воздействии ГнРГ и его аналоги связываются с рецепторами, что приводит к уменьшению секреции ФСГ и ЛГ [27]. Несмотря на то, что оба эти препарата имеют общие клинические показания, механизмы их действия различаются. А-ГнРГ обладают высоким сродством к рецепторам ГнРГ в гипофизе, детерминируют интернализацию комплекса лиганд/рецептор, с первоначальной их активацией, а затем уменьшением количества рецепторов, при этом гипофиз становится устойчивым к стимулирующему действию эндогенного ГнРГ, в результате чего продукция гонадотропных гормонов снижается, приводя к снижению синтеза половых гормонов [79]. Ант-ГнРГ являются конкурентными ингибиторами рецепторов ГнРГ и вызывают их прямой дозозависимый обратимый блок без периода активации [79, 80]. На протяжении многих лет для подавления гонадотропной функции гипофиза в программах ВРТ широко применялись протоколы с а-ГнРГ, в то время как ант-ГнРГ стали применяться в клинической практике лишь в последние десятилетия в качестве доступной альтернативы классического протокола в основном у пациенток с высоким риском СГЯ или при «бедном» ответе яичников [10, 11, 78, 80, 115].
Целью стандартных протоколов является индукция роста множества фолликулов для получения большего количества ооцитов и, соответственно, большего количества эмбрионов для выбора лучших по качеству для переноса в матку. Очевидными преимуществами «длинного» протокола с а-ГнРГ являются эффективность и управляемость процесса стимуляции, что практически сделало этот протокол стандартом при проведении программы ЭКО.
Результаты многочисленных исследований показали, что стимуляция суперовуляции в рамках «длинного» протокола не только способствует более интенсивному росту фолликулов, но и приводит к увеличению частоты наступления беременности (ЧНБ) [40, 62, 72].
Однако следует отметить ряд недостатков при применении протоколов с аналогами ГнРГ. К ним относятся длительный режим стимуляции функции яичников, значительные финансовые затраты на лечение, возникновение осложнений в виде синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ) и многоплодной беременности. Кроме того, негативное влияние протоколов с а-ГнРГ на самочувствие женщин провоцирует высокую частоту отказов от лечения [52, 71, 80, 87].
На сегодняшний день в рамках программы ВРТ применяются оба протокола, однако в последние годы чаще отдается предпочтение протоколам с ант-ГнРГ в связи с меньшей длительностью, лучшей переносимостью и высокой эффективностью лечения по данной схеме [71, 77, 78].
Целью протоколов с ант-ГнРГ является предупреждение преждевременного пика ЛГ при сохранении максимального числа ооцитов путем снижения эффекта подавления а-ГнРГ на рецепторный аппарат яичников. При этом отсутствует супрессия яичников на начальных этапах созревания фолликулов. Во время проведения стимуляции суперовуляции введение ант-ГнРГ необходимо на непродолжительный период времени, при вступлении фолликулов в финальную фазу роста, когда присутствует риск преждевременного выброса ЛГ. Действие ант-ГнРГ обратимо, и функция гипофиза быстро возвращается к норме после отмены препарата. Так как подавление выработки эндогенного ФГС происходит лишь в позднюю фолликулярную фазу, требуется меньшая суммарная доза препарата ФСГ для стимуляции функции яичников [87]. Дальнейший прогресс в области репродуктивной медицины позволил сфокусировать внимание специалистов на разработке более безопасных и приемлемых для пациента протоколов стимуляции функции яичников, которые позволили бы при минимизации побочных эффектов терапии увеличить вероятность рождения живого здорового ребенка при одноплодной беременности [6, 98]. Значительные финансово-экономические - 17 затраты на лечение СГЯ и осложнений, развивающихся при многоплодной беременности, а также успехи в области фармацевтической промышленности (синтез новых препаратов) и достижения современной эмбриологии, привели к переоценке имеющихся протоколов стимуляции функции яичников с внедрением в клиническую практику модифицированных, или «мягких», протоколов стимуляции [9, 12, 26].
Метод интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит и культивирование дробящихся эмбрионов in vitro
ТВП яичников проводилась через 35-36 часов после введения овуляторной дозы ХГ под внутривенной анестезией и ультразвуковым контролем в условиях малой операционной отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия. Аспирация фолликулярной жидкости производилась под отрицательным давлением в диапазоне 90-100 мм водного столба в стерильные пробирки, содержащие 0,5 мл гепарина (2500 ЕД/мл). Полученную фолликулярную жидкость незамедлительно передавали эмбриологу для последующей идентификации ооцитов и культивирования эмбрионов.
На эмбриологическом этапе идентифицированные ооциты помещались в среду для культивирования и маркировались, проводилась оценка качества и степени зрелости полученных ооцитов. При этом наличие рыхлого комплекса ооцит-кумулюс и диспергированного лучистого венца свидетельствовало о зрелости ооцита. Оплодотворение полученных ооцитов производили через 4-5 часов после ТВП яичников. Для оплодотворения ооцитов у всех групп пациентов применялся метод ИКСИ. Непосредственно перед процедурой ИКСИ проводилось ферментативное очищение ооцитов от клеток кумулюса с помощью фермента гиалуронидазы, после чего ооциты отмывали в забуфференной среде HEPES. Сперму мужа подвергали центрифугированию, флотированию и обработке в специальной среде. Процедура ИКСИ состояла из нескольких этапов:
- иммобилизация сперматозоида с помощью микроиглы;
- аспирация сперматозоида в микроиглу при помощи создания отрицательного давления в специальном инъекторе;
- ориентация и закрепление ооцита определенным образом, чтобы полярное тельце находилось в положении 6 или 12 часов;
- инъекция ооцита микроиглой, содержащей сперматозоид, и аспирация небольшого количества ооплазмы;
- инъекция сперматозоида вместе с аспирированной ооплазмой в ооцит. Оплодотворение расценивали как нормальное при наличии двух пронуклеусов через 14-16 часов после ИКСИ. В случае отсутствия двух пронуклеусов оплодотворение считали несостоявшимся. В случае определения одного или более двух пронуклеусов оплодотворение расценивали как аномальное.
Оценку качества эмбрионов производили на 3-и сутки после ИКСИ на основании совокупности их морфологических характеристик. При этом учитывались показатели скорости дробления эмбрионов, оценивалась симметричность бластомеров, их моно-/мультинуклеарность и степень цитоплазматической фрагментации. В соответствии с классификацией, представленной в исследовании Cruz M., с соавторами (2011) [67], эмбрионы распределяли на следующие группы:
I класс (А) – эмбрионы с наибольшей скоростью дробления, состоящие из 7-8 симметричных мононуклеарных бластомеров и имеющие менее 10% цитоплазматической фрагментации;
II класс (В) – эмбрионы, состоящие из 7-8 симметричных мононуклеарных бластомеров и имеющие 11-25% цитоплазматической фрагментации;
III класс (С) – эмбрионы, имеющие в своем составе менее 6 бластомеров несимметричной формы и содержащие 26-35% цитоплазматической фрагментации без явлений мультинуклеарности;
IV класс (D) – эмбрионы, имеющие в своем составе 6 и менее бластомеров с цитоплазматической фрагментацией более 35% и явлениями мультинуклеарности.
На основании оценки морфологических критериев эмбрионами «хорошего» качества считали те, которые на 3-и сутки содержали 7 и более бластомеров или имели признаки компактизации, при этом степень фрагментации цитоплазмы составляла не более 25% (классы А и В). Бластоцисту, имеющую примерно 150-200 клеток, компактную внутреннюю клеточную массу и хорошо структурированную трофэктодерму, оценивали как имеющую «хорошее» качество.
Перенос эмбрионов в полость матки осуществлялся посредством одноразового катетера на 3 и/или 5 сутки культивирования in vitro в программах без ПГД и на 4 сутки в случае проведения ПГД. Количество перенесенных эмбрионов в одном цикле ЭКО/ИКСИ не превышало 3.
Поддержка посттрансферного периода осуществлялась по общепринятой схеме препаратом микронизированного прогестерона или дидрогестероном. Терапию назначали через 24 часа после проведения ТВП в возрастающей дозировке 300-600 мг/сутки или 30/40 мг/сутки.
Диагностика наступления беременности осуществлялась на основании определения концентрации -субъединицы ХГ в сыворотке крови через 14 дней после переноса эмбрионов в полость матки. Тест на беременность считался положительным при уровне -ХГ более 20 МЕ/л («биохимическая беременность»). Ультразвуковая диагностика клинической беременности проводилась через 21 день после переноса эмбрионов.
Характеристика женщин по перенесенным гинекологическим заболеваниям и оперативным вмешательствам
Данные о ранее перенесенных гинекологических заболеваниях у женщин, включенных в исследование, отражены в табл. 13. Как видно из представленной таблицы, в исследуемых группах женщины не различались по частоте и структуре гинекологической патологии. Наиболее часто в анамнезе женщин отмечались воспалительные заболевания придатков матки (суммарно 33,3%) и инфекции, передающиеся половым путем (суммарно 31%).
Гинекологические операции, включая гистероскопию, имели в анамнезе 29 из 84 пациенток (34,5%). 19 женщин (22,6%) перенесли от 1 до 2 лапароскопических вмешательств. 13 пациенткам (32,1%) ранее были произведены гистероскопии с раздельным диагностическим выскабливанием стенок полости матки и цервикального канала.
Данные о количестве и характере перенесенных оперативных вмешательств у женщин, включенных в исследование, представлены в табл. 14.
Как видно из представленных данных, у мужчин, включенных в исследование, наиболее часто нарушения сперматогенеза проявлялись в виде ОАТ. Этот вид патозооспермии определялся в 50% случаев.
Однако следует отметить, что структура патозооспермии несколько отличалась в трех группах. Так, в группах пациентов с делецией AZF локуса хромосомы Y в 8,3% и 18,2% случаев выявлялась азооспермия, в то время как у пациентов без делеции этот вид патологии не встречался.
На первом этапе нашего исследования проводили оценку распространенности мутаций AZF локуса хромосомы Y среди мужчин с патозооспермией, нуждающихся в лечении бесплодия методом ЭКО/ИКСИ. Исследование ДНК на наличие del AZF хромосомы Y было проведено 439 мужчинам с различными отклонениями в показателях спермограммы (табл. 16). Для выявления микроделеций в AZF локусе хромосомы Y была применена методика мультиплексной амплификации, позволяющая исследовать следующие Y-специфические маркеры: sY84, sY86, sY615 – для AZFa субрегиона, sY127, sY142, sY134, sY 1197 – для AZFb субрегиона, sY254, sY255, sY242, sY157, sY 1125, sY 1192 , sY 1206, sY 1291 – для AZFc субрегиона, SRY, ZFY в качестве контролей (рис. 8).
Наличие микроделеций в AZF локусе хромосомы Y было выявлено у 72 пациентов. Таким образом, общая распространенность данной мутации среди пациентов с различными отклонениями в показателях спермограммы составила 16,4%, что сопоставимо с результатами, полученными Ceylan G.G., и соавторами [42]. Однако согласно данным многочисленных исследований общая распространенность del AZF хромосомы Y широко варьирует в различных популяциях [60], при этом в среднем этот показатель составляет 7,6% [127]. Наиболее часто мутации AZF локуса хромосомы Y выявлялись при НОА (26,8%), а также при тяжелых формах сочетанной патологии сперматогенеза – ОАТ и АТ (19,5% и 16,7%, соответственно). При обструктивной азооспермии, изолированных астено- и олигозооспермии микроделеций в AZF локусе хромосомы Y выявлено не было (рис. 9).
Частота встречаемости мутаций в AZF локусе хромосомы Y при различных видах патозооспермии
Самой распространенной мутацией в AZF локусе хромосомы Y была del sY 1192, которую выявлили в 40 наблюдениях в минорном состоянии и в 7 случаях – в комплексе с другими микроделециями, что составило 65,3% (47 наблюдений из 72). Среди пациентов с del AZF нарушения сперматогенеза в виде сочетанной ОАТ были выявлены в 32 наблюдениях из 72, что составило 44,4%. Выявленные виды микроделеций хромосомы Y и результаты спермограмм при этих мутациях представлены в таблице 17.
Анализ выживаемости эмбрионов после проведения преимплантационной генетической диагностики
В нашей работе оценку выживаемость эмбрионов после биопсии бластомера в рамках ПГД проводили на следующий день поле процедуры.
В основной группе (del AZF с ПГД) из 235 эмбрионов на 4 сутки продолжали развиваться 120 эмбрионов, таким образом, общая выживаемость эмбрионов в этой группе составила 51,2%. В группе сравнения I (с ПГД) уровень выживаемости эмбрионов был статистически значимо выше и составил 84,2% (219 эмбрионов из 260), ((1)=62,91, р 0,0001; ОШ=5,1, 95% ДИ: 3,3-8,0) (рис. 40). Таким образом, наличие у супружеских пар мутации AZF локуса хромосомы Y достоверно увеличивает в 3 раза риск остановки развития эмбрионов после проведения биопсии бластомера по сравнению с эмбрионами пациентов без этой мутации (ОР=3,1, 95% ДИ: 2,3-4,2).
Следует отметить, что выживаемость эмбрионов до стадии морулы/бластоцисты составила 45,7% в основной группе (del AZF с ПГД) и 79,6% в группе сравнения I (с ПГД).
Известно, что ряд факторов могут оказывать влияние на выживаемость эмбрионов после проведения процедуры биопсии бластомера. Так, на момент проведения данной процедуры важное значение имеет соответствие состояния эмбриона по морфологическим критериям третьему дню развития, а также наличие хромосомной патологии у эмбриона.
Некоторые исследователи доказали наличие статистически значимой взаимосвязи между морфологическим состоянием эмбриона третьего дня развития, то есть его качеством, и способностью к дальнейшему благополучному развитию после проведения генетической диагностики (р 0,01). Таким образом, «хорошее» качество эмбриона на третьи сутки после ИКСИ может в последующем определить его развитие к пятому дню до стадии ранней бластоцисты. Кроме того, авторами было показано, что после проведения биопсии одного бластомера от каждого эмбриона 51,6% (829/1608) эмбрионов в последующем достигали стадии бластоцисты. Кроме того, 47% (767/1633) эмбрионов продолжили развитие до данной стадии в случае аспирации двух бластомеров [61].
В данном исследовании также провели анализ наличия взаимосвязи между качеством эмбрионов третьего дня развития и их выживаемостью после биопсии бластомера в рамках ПГД у супружеских пар с делецией в AZF локусе хромосомы Y и без нее (рис. 41).
Рисунок 41. Выживаемость эмбрионов после биопсии бластомера в зависимости от их качества у супружеских пар в группах с ПГД
Статистический анализ полученных данных выявил наличие взаимосвязи между качеством эмбрионов третьего дня развития и их выживаемостью после проведения процедуры биопсии бластомера как в основной группе (del AZF с ПГД) ((1)=17,22, р 0,0001), так и в группе сравнения I (с ПГД) ((1)=6,62, р=0,01). Так, эмбрионы «хорошего» качества имели больший потенциал к развитию после биопсии бластомера по сравнению с эмбрионами «плохого» качества.
В основной группе (del AZF c ПГД) 58,4% эмбрионов «хорошего» качества (59 эмбрионов из 101) продолжали развиваться после биопсии бластомера, при этом, в группе сравнения I (с ПГД) этот показатель был статистически значимо выше и составил 86,2% (173 эмбриона из 203) ((1)=26,81, р 0,0001).
Из 134 эмбрионов «плохого» качества в основной группе (del AZF с ПГД) 42 продолжали развиваться после биопсии бластомера, что составило 31,3%. В группе сравнения I (с ПГД) процент выживаемости эмбрионов «плохого» качества был достоверно в 2 раза выше и составил 71,4% (50 эмбрионов из 70) ((1)=29,84, р 0,0001).
Большая часть эмбрионов «плохого» качества (68,7%) в основной группе (del AZF с ПГД) после проведения ПГД остановилась в развитии, в группе сравнения I (с ПГД) лишь 28,6% эмбрионов «плохого» качества прекратили развиваться.
Выживаемость эмбрионов после биопсии бластомера в зависимости от наличия у них хромосомной патологии в группах с ПГД
Также была произведена оценка влияния наличия/отсутствия анеуплоидии у эмбрионов на их выживаемость после проведения процедуры биопсии бластомера в рамках ПГД в исследуемых группах (рис. 42).
Статистический анализ полученных данных выявил наличие взаимосвязи между наличием/отсутствием анеуплоидии у эмбрионов и их выживаемостью после биопсии бластомера как в основной группе (del AZF с ПГД) ((1)=35,06, р 0,0001), так и в группе сравнения I (с ПГД) ((1)=15,04, р 0,0001). Следовательно, эмбрионы без анеуплоидии по исследованным хромосомам имеют больший потенциал к дальнейшему развитию после биопсии бластомера, чем эмбрионы с анеуплоидией.
Так, в обеих группах эмбрионы без распространенных анеуплоидий в превалирующем проценте случаев продолжали развиваться после проведения процедуры биопсии бластомера (в основной группе (del AZF с ПГД) – 84,4%, в группе сравнения I (с ПГД) – 92,7%). Однако следует отметить, что процент остановившихся в развитии эмбрионов без анеуплоидии по исследованным хромосомам в основной группе (del AZF с ПГД) была в 2 раза выше, чем в группе сравнения I (c ПГД) и составил 15,6% против 7,3%, хотя данные различия не достигли уровня статистической значимости (р=0,09). Возможно, эти различия могли быть обусловлены «плохим» качеством эмбрионов в группе супружеских пар с мутацией в AZF локусе хромосомы Y или наличием у эмбрионов анеуплоидии других хромосом, анализ которых не поводился в данном исследовании, вследствие чего эмбрионы остановились в своем развитии.
В отношении выживаемости эмбрионов с хромосомной патологией были определены некоторые различия в исследованных группах. Так, в основной группе (del AZF c ПГД) большая часть эмбрионов с анеуплоидией (63,2%) остановились в своем развитии на следующие сутки после проведения процедуры биопсии бластомера. Тем не менее, выживаемость эмбрионов с хромосомной патологией в этой группе составила 36,8% (35 из 95 эмбрионов). В группе сравнения I (с ПГД) выживаемость эмбрионов с анеуплоидией была достоверно в 2 раза выше, чем в основной группе (del AZF с ПГД) и составила 71,4% ((1)=20,39, р 0,0001; ОШ=4,3, 95% ДИ: 2,1-8,6). Исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что у супружеских пар с микроделецией AZF локуса хромосомы Y достоверно в 2 раза выше риск остановки развития эмбрионов с анеуплоидией по сравнению с эмбрионами пациентов без делеции (ОР=2,2, 95% ДИ: 1,5-3,3). Различия в уровнях выживаемости эмбрионов с анеуплоидией в двух группах можно объяснить различной структурой хромосомной патологии в исследуемых группах с преобладанием у эмбрионов супружеских пар с del AZF хромосомы Y тяжелой сочетанной патологии и «плохого» качества эмбрионов.
Анализ литературных данных относительно проблемы изучения выживаемости эмбрионов in vitro и факторов, влияющих на этот показатель, продемонстрировал, что информация по данному вопросу изложена фрагментарно, кроме того, не было найдено публикаций, описывающих совокупное воздействия нескольких факторов на выживаемость эмбрионов.
Мы оценили вероятность выживаемости эмбрионов (остановки или прогрессирования развития) с учетом влияния ряда факторов в группах супружеских пар с делецией AZF локуса хромосомы Y и без нее. Для этого применили метод логистического регрессионного анализа, где бинарной зависимой переменной (переменной отклика, исходом) была выживаемость эмбрионов – остановка или прогрессирование развития.
В ходе построения математической модели был проведен многофакторный анализ возможного влияния на зависимую переменную следующих факторов: возраста мужчин и женщин, данных анамнеза пациентов, типа бесплодия, его длительности, протокола стимуляции, номера попытки ЭКО/ИКСИ, качества эмбрионов, наличия анеуплоидии хромосом (в том числе учтены отдельные виды хромосомной патологии), количества ядер в бластомере, типа нарушения сперматогенеза у мужчин, наличия делеции в AZF локусе хромосомы Y (также учитывались отдельные типы del AZF хромосомы Y). Следует отметить, что определив несколько независимых предикторов, достоверно связанных с исходом, возможно использование уравнения регрессии для прогноза значения зависимой переменной.
Для определения прогностической значимости данных, полученных в ходе проведения генетической диагностики эмбрионов, были построены 2 математические модели. В первую модель включили результаты ПГД, а во вторую нет.
