Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Современное состояние проблемы реализации фертильной функции женщин старшего репродуктивного возраста. Обзор литературы 10
Глава II. Контингент, материал и методы исследования 29
Глава III. Клиническая характеристика обследованных женщин 41
Глава IV. Результаты лабораторных и инструментальных методов исследования 56
4.1. Результаты ультразвукового исследования органов малого таза 56
4.2. Результаты гистероскопии 59
4.3. Результаты гормонального исследования .61
4.4. Определение уровня эндометриального белка АМГФ в менструальной крови . 64
4.5. Содержание мелатонина у женщин позднего репродуктивного периода с трубно-перитонеальным бесплодием .66
Глава V. Повышение результативности экстракорпорального оплодотворения у женщин позднего репродуктивного периода с трубно-перитонеальным бесплодием 70
5.1. Обоснование возможности влияния на патогенетические звенья нарушений гомеостаза у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием 70
5.2. Эффективность включения мелатонина в программу ЭКО .73
5.3. Преодоление трубно-перитонеального бесплодия 80
Заключение .87
Выводы .102 Практические рекомендации .103
Указатель литературы 104
- Результаты гистероскопии
- Определение уровня эндометриального белка АМГФ в менструальной крови
- Эффективность включения мелатонина в программу ЭКО
- Преодоление трубно-перитонеального бесплодия
Результаты гистероскопии
В настоящее время не вызывает сомнения факт наличия циркадианных ритмов продукции мелатонина эпифизом. Мелатониновая кривая – изменение концентрации этого гормона в течение суток, имеет общие черты у всех людей - ночная концентрация в 5-10 раз превышает дневной уровень, достигая максимума в 2-4 часа ночи, затем постепенно снижается и с 7-8 утра до 8 часов вечера остается низкой. Для каждого человека мелатониновая кривая стабильна, но вариабельна в популяции. Установлено, что с возрастом снижается продукция мелатонина как у человека, так и у животных. Старение связано с изменениями в нескольких основных параметрах циркадианных ритмов у млекопитающих, ведущих к циркадной дисфункции. подкожно U. Mattam, A. Jagota (2014) [81] вводили старым крысам мелатонин через 1 ч после наступления темноты в течение 11 дней. В последующем было выявлено, что введение экзогенного мелатонина приводило к восстановлению суточного ритма экспрессии различных часовых генов в супрахиазматических ядрах гипоталамуса.
Результаты исследования J. Cipolla-Neto et al. (2014) [51] показали, что возрастное снижение мелатонина способствует формированию резистентности к инсулину, нарушению толерантности к глюкозе, нарушениям сна, - все это, по мнению авторов, лежит в основе формирования метаболического синдрома с увеличением возраста. Возрастное снижение мелатонина может свидетельствовать о прогрессивном снижении и фертильной функции. Ряд авторов демонстрируют негативный эффект темноты на репродуктивную функцию. Так, A. Bellastella et al. (2014) [43] отмечают, что слепота может влиять на функцию половых желез в организме человека. У слепых выявлены повышенные уровни мелатонина в плазме на фоне значительного увеличения соотношения ФСГ / ЛГ, что может указывать на возможное субклинический ухудшение функции яичек у мужчин и яичников у женщин. Кроме того, авторами установлено, что для женщин, живущих в Финляндии, в регионе с сильным сезонным отличием световой активности, характерно повышение мелатонина и снижение секреции гонадотропинов в темное время года, с последующим сокращением частоты наступления беременностей. Возможный механизм отрицательной обратной связи между мелатонином и гормонами гипофиза объясняется присутствием рецепторов к гонадотропинам и половым стероидным гормонам в человеческих пинеалоцитах и, наоборот, рецепторов мелатонина в гипоталамусе, гипофизе, яичниках, яичках. R.J. Reiter et al. (2014) [92] развитие родовой деятельности именно в ночное время объясняют синергизмом между ночным увеличением мелатонина и окситоцина.
Особенно повышен риск развития ановуляторных циклов и гиперпластических процессов у женщин, работающих по ночам (сменные операторы на телеграфе и радио, медицинские сестры, стюардессы, диспетчеры, продавцы круглосуточных магазинов и т. д.), у людей, страдающих бессонницей [45].
Получены достоверные доказательства о важной роли мелатонина в активизации гипоталамо-гипофизарно-гонадальной оси при половом созревании, то есть мелатонин запускает секрецию гонадотропин-рилизинг гормона (ГнРГ) в гипоталамусе [47]. Если существование функциональной взаимосвязи мелатонина с половыми железами определено, то вопросы об уровне и характере продукции гормона и его патогенетическом значении в нарушении функции яичников остаются спорными. В литературе по этому поводу представлены противоречивые данные. В одних исследованиях на домашних кошках, мелатонин рассматривается как универсальный ингибитор эндокринных функций и, прежде всего, в отношении оси гипоталамус -гипофиз – гонады [63], в других работах, указывается на то, что стимуляция функции шишковидной железы не всегда дает эффект ингибирования гонадотропной функции системы гипоталамус-гипофиз у крыс [18].
Приводятся данные, что мелатонин регулирует генную экспрессию и секрецию ГнРГ, контролирующего ритм и уровень выброса ЛГ и ФСГ, воспроизводя 24 - часовую цикличность, координацию гормонального статуса в течение всего менструального цикла, снижает уровень эстрадиола [55]. В других исследованиях не выявлен эффект воздействия мелатонина на созревание фолликула и функцию яичника в эксперименте на животных [60]. В то же время у женщин с низким уровнем мелатонина сульфата в суточной моче установлено значительное повышение гонадотропных гормонов, как ФСГ, так и ЛГ [1].
Данные о влиянии мелатонина на секрецию прогестерона также неоднозначны. В одних исследованиях показано, что мелатонин снижает уровень ЛГ и эстрадиола, но не оказывает такого влияния на ФСГ и прогестерон [55]. А работа E. Toffol et al. (2013) [106] демонстрирует, что мелатонин модулирует секрецию прогестерона и эстрадиола.
Определение уровня эндометриального белка АМГФ в менструальной крови
Трубно-перитонеальное бесплодие в современном мире продолжает удерживать ведущие позиции в структуре женской инфертильности из-за болезней, передаваемых половым путем, небезопасных абортов и послеродовых инфекций органов малого таза [88].
Одним из основных факторов, определяющих успех ЭКО, является возраст пациентки. C возрастом уменьшается фолликулярный запас, ухудшается качество ооцитов. Частота наступления клинической беременности и родов живым плодом при применении ВРТ не превышает 33% и 24,8% соответственно [24]. Y.A. Wang et al. (2012) [109] показали, что самый высокий коэффициент рождаемости у доноров яйцеклеток в возрасте 30-34 года (25, 0%), у доноров в возрасте 35 -39 лет этот показатель составил - 20,7%, а в возрасте старше 40 лет - 11,5%.
Вместе с тем в последние годы пристальное внимание исследователей привлекают роль эпифиза и продуцируемого им гормона мелатонина в синхронизации суточных и сезонных биоритмов, в антистрессовой защите, а также его участии в нейроэндокринной регуляции репродуктивной системы.
M.H. Cruz et al. (2014) [56] отмечают, что мелатонин является мощным антиоксидантом и антиапоптотическим агентом, что связано с его прямым влиянием на токсичные производные кислорода и способности уменьшать образование активных форм кислорода. Гаметы и эмбрионы млекопитающих очень чувствительны к окислительному стрессу.
Мелатонин защищает их от свободных радикалов. У мужчин добавление мелатонина значительно улучшает жизнеспособность сперматозоидов, а его добавление в культуральную среду улучшает качество яйцеклетки. P.L. Rangel, C.G. Gutierrez (2014) [91] отмечают, что инициирование репродуктивного сезона у кур связано со снижением выработки мелатонина и GnIH (гонадотропинингибирующего гормона), обусловленного увеличением светового дня. Снижение GnIH позволяет гонадолиберинам и гонадотропинам стимулировать рост фолликулов. F.Wang et al. (2013) [110] обнаружили, что мелатонин способствует развитию в пробирке мышиных эмбрионов. Об этом свидетельствовало увеличение скорости дробления бластоцисты, количества качественных бластоцист. Было установлено, что у мышей, получавших мелатонин, достоверно возрастала частота наступления беременности (95,0% в сравнении с контролем 67,8%), размеры помета (4,1 щенка в сравнении с контролем 2,7) и послеродовая выживаемость потомства (96,8% по сравнению с контролем 81,2%) по сравнению с мышами, мелатонин не получавших. Авторы показали, что мелатонин активирует экспрессию гена антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы и антиапоптозный фактор Bcl-2, на фоне снижения экспрессии про-апоптотических генов р53 и каспазы-3. Именно поэтому мелатонин, по мнению авторов, способствует имплантации бластоцист с более высоким качеством, что приводит к рождению здорового потомства и увеличению выживаемости детенышей. B.E. Fernndez et al. (2013) [61] исследовали влияние мелатонина на эндокринные функции яичника в процессе старения у крыс. Было установлено, что у крыс среднего возраста (13 месяцев) применение мелатонина способствовало увеличению объема яичников, созреванию доминантных фолликулов, но при этом мелатонин не оказывал влияние на плотность фолликулов в яичниках. У старых крыс (возраст 22 месяца) на фоне мелатонина нормализовалось содержание эстрадиола по уровню сопоставимое с молодыми крысами.
Исходя из представленных малочисленных исследований (особенно в человеческой популяции), направленных на изучение различных аспектов влияния мелатонина на репродуктивную функцию, нет полных научно обоснованных данных о возможностях применения мелатонина с целью влияния на репродуктивную функцию вообще, и на качество яйцеклеток, бластоцист, имплантацию в частности.
Проведенное нами изучение содержания мелатонина сульфата в моче позволило выявить разнонаправленные нарушения секреции мелатонина у 100% исследуемых пациенток. Эти нарушения заключались как в нарушении ритма продукции мелатонина, так и снижении его уровня. В зависимости от уровня мелатонина сульфата в моче нами не было выявлено статистически значимых различий между группами до приема экзогенного мелатонина. У всех обследованных инфертильных женщин было выявлено снижение уровня мелатонина сульфата в моче, как в дневное, так и ночное время суток.
Более детальная оценка суточного ритма секреции мелатонина сульфата обследованных пациенток показала отсутствие статистически значимых межгрупповых различий. Было выявлено, что, начиная с 24 часов, происходит увеличение мелатонина сульфата в моче - в 2,4-2,5 раза по сравнению с предыдущими тремя часами (интервал 21-24 часа). Максимальная концентрация мелатонина сульфата приходится на 3-6 часов, с последующим постепенным его снижением. Самый низкий уровень мелатонина сульфата был зарегистрирован в 15-18 часов. Нами не было выявлено физиологического увеличения ночной концентрации мелатонина по сравнению с дневным его уровнем (в норме в 5-10 раз). Кроме того, пик уровня мелатонина у всех инфертильных женщин был смещен на 3-6 часов, вместо 2-4 часов. Так или иначе, но у всех инфертильных женщин не было выявлено физиологического 5-10 кратного увеличения ночной концентрации мелатонина по сравнению с дневным его уровнем. Уровень концентрации в ночное время превышал дневные показатели лишь в 2,5 раза. Пик уровня мелатонина смещался на 3-6 часов, вместо 2 - 4 часов.
Эффективность включения мелатонина в программу ЭКО
1. Прием мелатонина не оказывает влияния на состояние фолликулярного запаса. Уровни АМГ и ФСГ достоверно не меняются на фоне его применения.
2. Прием мелатонина способствует достоверному увеличению экскреции прогестерона, что приводило к статистически значимому увеличению полноценных двухфазных менструальных циклов с 13,8% до 29,3%, то есть более чем в 2,1 раза; снижению ановуляторных менструальных циклов с 53,4% до 41,4% - в 1,3 раза.
3. Уровень АМГФ после терапии мелатонином достоверно увеличивался с 4026,5±2801,2 нг/мл до 8387,9±4986,9 нг/мл - в 2,1 раза. Увеличение АМГФ напрямую коррелирует с увеличением прогестерона во II фазу менструального цикла на фоне терапии мелатонином и подтверждает известный факт, что АМГФ является прогестеронзависимым эндометриальным белком.
4. Терапия мелатонином способствует приближению «мелатониновой кривой» к физиологическим показателям: нормализуется время пикового выброса мелатонина – в 2-4 часа; увеличивается разница между дневным и ночным уровнями мелатонина - ночной уровень превышает дневной в 4 раза. Однако, достигнуть 5-10 кратной разницы между ночным и дневным показателями, то есть приблизиться к физиологическим показателям, несмотря на экзогенный прием мелатонина, не удалось.
5. Прием мелатонина достоверно увеличивает количество аспирированных фолликулов, однако, несмотря на его применение, ответ на стимуляцию гонадотропинами характеризуется сниженной реакцией («бедный»).
6. Мелатонин не влияет на показатели раннего эмбриогенеза – число перенесенных эмбрионов в полость матки не имело статистически значимых различий между группами.
7. Мелатонин не оказывает влияние на частоту наступивших беременностей, но способствует полноценной инвазии трофобласта. Опосредованно через статистически значимое увеличение уровня прогестерона и прогестеронзависимого эндометриального белка АМГФ мелатонин способствует качественной имплантации, что определяет успешный исход наступившей беременности: ранние репродуктивные потери диагностированы достоверно реже - у 17,6%, то есть в 2,8 раза меньше; частота рождений живым плодом - у 82,4%, то есть в 1,65 раза выше..
Современная демографическая ситуация в Российской Федерации ставит перед государством и обществом необходимость обращения пристального внимания на реализацию репродуктивной функции у каждой женщины, желающей родить ребенка [11].
За период 1999-2011 гг. заболеваемость женского населения (на 100000 человек в возрасте 18 лет и старше) эндометриозом возросла на 72,9% (1999г. – 218,0; 2009 г. – 376,5), расстройствами менструального цикла – на 53%, бесплодием на 34,9% (1999г. – 389,0; 2009 г. – 524,9) [35].
Высокая частота бесплодия в настоящее время является одной из сложнейших проблем современной медицины. Около 15% супружеских пар страдают бесплодием [9].
Воспалительное поражение маточных труб - ведущая причина бесплодия. В РФ в группах работающих женщин до 36 лет воспалительные заболевания органов малого таза встречаются у 19% [21]. Такие неутешительные показатели могут продолжать расти, так как все больше женщин откладывают вступление в брак и имеют несколько сексуальных партнеров в течение 10-15 лет половой жизни, что увеличивает риски осложнений воспалительных заболеваний органов малого таза.
Воспалительные заболевания внутренних органов занимают лидирующее положение в структуре острой гинекологической патологии, хотя в последнее время отмечается стабилизация заболеваемости острыми воспалительными заболеваниями придатков матки. Удельный вес воспалительных заболеваний составляет 60-65% всех гинекологических больных [22]. С развитием ВРТ многие проблемы, в том числе, связанные с преодолением трубно-перитонеального бесплодия, были успешно преодолены. По оценкам экспертов, 2% - 3% всех родов в развитых странах являются результатом программ ЭКО [64]. Однако далеки от разрешения вопросы преодоления бездетности у пациенток с недостаточным ответом яичников на стимуляцию гонадотропинами в программах ЭКО. Актуальность этой проблемы обусловлена, прежде всего, увеличением числа женщин старшего репродуктивного возраста, обращающихся в центры ЭКО с целью лечения бесплодия. По данным N.P. Polyzos et al. (2013) [89], частота наступления беременности у пациенток со сниженным показателем овариального резерва составляет 8,8% на одну попытку. До настоящего времени, несмотря на успехи в развитии фармакологии и усовершенствование методов ВРТ, добиться более высоких показателей наступления беременности не удается. В этой связи поставлена цель исследования: улучшить исходы программ ВРТ у женщин позднего репродуктивного возраста с трубно перитонеальным бесплодием, включая в них коррекцию гормонального гомеостаза для нормализации содержания мелатонина.
Для выполнения задач исследования были обследованы 92 пациентки позднего репродуктивного периода (старше 35 лет) с трубно перитонеальным бесплодием. Все они были разделены на две группы, в зависимости от факта приема препарата экзогенного мелатонина: I группа – 58 пациенток, принимавших мелатонин на этапе прегравидарной подготовки к программе ЭКО в дозе 3 мг в день, за 30 минут до сна, в течение 4 месяцев; II - 34 пациентки, не принимавшие мелатонин перед ЭКО.
Преодоление трубно-перитонеального бесплодия
Нами предпринята попытка оценить эффективность применения мелатонина у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием позднего репродуктивного возраста. В связи с выявлением нарушения секреции мелатонина пациенткам был предложен прием препарата экзогенного мелатонина на этапе прегравидарной подготовки к программе ЭКО в дозе 3 мг в день, за 30 минут до сна, в течение 4 месяцев. Через 4 месяца прегравидарного приема мелатонина была повторно проведена оценка гормонального гомеостаза. Не было выявлено статистически значимой разницы в уровне таких гормонов как АМГ, ФСГ, ЛГ, пролактин, эстрадиол в зависимости от приема экзогенного мелатонина. Лишь прослеживалась тенденция к снижению уровня пролактина, ФСГ и АМГ на фоне приема мелатонина, однако статистически значимых различий не выявлено.
Определение уровня прогестерона во II фазу менструального цикла (22-24 день) показало, что уровень прогестерона пациенток, принимавших мелатонин, достоверно возрастал при сравнении с женщинами, не принимавшими его: с 10,6±4,4 нмоль\л до 16,7±4,8 нмоль\л. Внутригрупповое сопоставление уровня прогестерона до и после проводимой терапии мелатонином показало, что на фоне достоверно значимого возрастания прогестерона в сыворотке крови происходило статистически значимое увеличение полноценных двухфазных менструальных циклов с 13,8% до 29,3%, то есть более чем в 2,1 раза. Практически не изменилось число женщин с НЛФ-синдромом, но снизилось количество ановуляторных менструальных циклов с 53,4% до 41,4% - в 1,3 раза, однако статистически значимых различий не выявлено.
Полученные нами данные перекликаются с данными C.C. Maganhin et al. (2013) [79], показавших, что в яичниках крыс через 2 месяца после пиниелоэктомии значительно увеличивалось число антральных и преантральных фолликулов, однако желтых тел выявлено не было. Кроме того, отмечалось увеличение толщины теки (наружной соединительнотканной оболочки фолликула) на фоне уменьшения количества рецепторов к прогестерону. Определение АМГФ в менструальной крови на фоне проводимой терапии показало, что уровень АМГФ после терапии мелатонином достоверно увеличился с 4026,5±2801,2 нг/мл до 8387,9±4986,9 нг/мл - в 2,1 раза. Увеличение АМГФ напрямую коррелировало с увеличением прогестерона во II фазу менструального цикла на фоне терапии мелатонином и подтвердило известный факт, что АМГФ является прогестеронзависимым эндометриальным белком.
Изучение содержания мелатонина сульфата в моче после проводимой терапии мелатонином показало, что его концентрация достоверно возрастала как в дневное, так и ночное время суток. Так, среднесуточная концентрация мелатонина сульфат достоверно возросла в 2,3 раза, составив в среднем 61,9±43,0 нг/мл. Дневной уровень мелатонина достоверно возрос с 13,3±7,4 нг/мл до 29,4±9,9 нг/мл, то есть в 2,2 раза. Ночной уровень мелатонина сульфат достоверно вырос с 38,9±21,1 нг/мл до 94,6±37,3 нг/мл, то есть в 2,4 раза. Более детальная оценка суточного ритма секреции мелатонина сульфата обследованных показала, что, проводимая терапия привела к статистически значимому увеличению мелатонина во все анализируемые интервалы. Так, начиная с 21 часа, наблюдалось постепенное увеличение уровня мелатонина сульфата в моче с пиковой концентрацией в 24-3 часа. Обращает на себя внимание, что высокий уровень мелатонина в моче имел место до 6 утра, с последующим постепенным его снижением. Низкое плато уровня мелатонина сульфата в моче регистрировалось в интервале 15-21 час.
После терапии мелатонином нормализовался ритм его выброса. Так, пиковый уровень мелатонина приходился на физиологический временной интервал 2-4 часа. Кроме того, разница между дневным и ночным уровнями мелатонина увеличилась - ночной уровень мелатонина превышал дневной в 4 раза. Однако, достичь 5-10 кратной разницы между ночным и дневным показателями, то есть приблизиться к физиологическим показателям, несмотря на экзогенный прием мелатонина, не удалось.
Стимуляция суперовуляции проводилась гонадотропными препаратами (пурегон, гонал-ф) по «короткому» протоколу.
Анализ показателей фолликулогенеза и раннего эмбриогенеза показал, что количество аспирированных фолликулов достоверно отличалось между группами. Так, у пациенток, получавших прегравидарно мелатонин, среднее число аспирированных фолликулов было достоверно больше и составило 4,8±1,1, для сравнения у пациенток, не получавших мелатонин, - 3,1±1,2. У одной пациентки (1,7%) I группы, несмотря на проведение стимуляции суперовуляции в рамках программы ЭКО, не было получено ни одного фолликула.
