Содержание к диссертации
Введение
Глава І.Обзор литературы 15
1.1. Современные преставления о внутриутробной инфекции 15
1.1.1 Актуальность проблемы внутриутробной инфекции в акушерстве и перинатологии 15
1.1.2. Определение понятия «внутриутробной инфекции» 15
1.1.3. Частота внутриутробной инфекции 16
1.1.4. Этиология и патогенез развития внутриутробной инфекции 17
1.1.5. Клинические проявления внутриутробной инфекции 22
1.1.6. Факторы риска развития внутриутробной инфекции 22
1.1.7. Методы диагностики внутриутробной инфекции 23
1.2. Иммунологические аспекты реализации внутриутробной инфекции 27
1.2.1. Общие представления о врожденном иммунитете 27
1.2.2. Toll-подобные рецепторы врожденного иммунитета при беременности 31
1.2.3. Toll-подобные рецепторы в патогенезе осложнений при внутриутробной инфекции 34
1.2.4. Противомикробные пептиды, как факторы защиты при инфекции 40
Глава II. Материалы и методы исследования 44
2.1. Методы клинического обследования 44
2.2. Иммунологические и молекулярно-генетические методы исследования 48
2.3. Статистическая обработка результатов 51
Глава III. Клиническая характеристика исследуемых групп 52
3.1. Клиническая характеристика беременных исследуемых групп 52
3.2. Клиническая характеристика новорожденных от матерей исследуемых групп 66
Глава IV. Исследование экспрессии генов toll-подобных рецепторов у здоровых беременных и беременных с высоким риском реализации внутриутробной инфекции
4.1. Исследование экспрессии генов Toll-подобных рецепторов клетками плаценты у здоровых беременных и беременных с высоким риском реализации внутриутробной инфекции
4.2. Исследование экспрессии генов Toll-подобных рецепторов мононуклеарными клетками периферической крови у здоровых беременных и беременных с высоким риском реализации внутриутробной инфекции
4.3. Исследование экспрессии генов Toll-подобных рецепторов эпителиальными клетками цервикального канала у здоровых беременных и беременных с высоким риском реализации внутриутробной инфекции
Глава V. Исследование экспрессии гена противомикробного пептида HBD1 у здоровых беременных и беременных с высоким риском реализации внутриутробной инфекции
5.1. Исследование экспрессии гена противомикробного пептида HBD1 клетками плаценты у здоровых беременных и беременных с высоким риском реализации внутриутробной инфекции 89
5.2. Исследование экспрессии гена противомикробного пептида HBD1 мононуклеарными клетками периферической крови у здоровых беременных и беременных с высоким риском реализации внутриутробной инфекции 90
5.3. Исследование экспрессии гена противомикробного пептида HBD1 эпителиальными клетками цервикального канала у здоровых беременных и беременных с высоким риском реализации внутриутробной инфекции 92
Заключение 95
Выводы 111
Практические рекомендации 112
Список литературы 113
- Toll-подобные рецепторы в патогенезе осложнений при внутриутробной инфекции
- Клиническая характеристика беременных исследуемых групп
- Исследование экспрессии генов Toll-подобных рецепторов клетками плаценты у здоровых беременных и беременных с высоким риском реализации внутриутробной инфекции
- Исследование экспрессии гена противомикробного пептида HBD1 клетками плаценты у здоровых беременных и беременных с высоким риском реализации внутриутробной инфекции
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Несмотря на очевидные успехи в акушерской терапии и выхаживании новорожденных, внутриутробная инфекция (ВУИ) остается важной и нерешенной проблемой акушерства и перинатологии [2, 8, 35, 63,].
ВУИ развивается у 27,4 - 36,6% детей, рожденных живыми, а в структуре смертности новорожденных инфекционная патология занимает ведущее положение, обусловливая от 11% до 45% потерь [5, 11, 150]. В развитых странах 10-25% мертворождений обусловлены инфекционными патогенами, а в развивающихся странах этот показатель в 2-3 раза выше [151].
Согласно ряду исследований, инфекционные заболевания выявляют у 50-60% госпитализированных доношенных и у 70% недоношенных детей. По результатам вскрытий новорожденных у 37,5% умерших детей инфекционная патология явилась причиной смерти, сопутствовала или осложняла течение основного заболевания [57, 151].
Увеличение частоты данной патологии среди заболеваний новорожденных обусловлено увеличением количества женщин фертильного возраста с наличием той или иной урогенитальной инфекции [1, 19, 35, 53].
Сложности антенатальной диагностики ВУИ связаны с полиэтиологичностью патологии, отсутствием четкой взаимосвязи между выраженностью клинических проявлений у матери и степенью поражения плода, многофакторным влиянием инфекционного агента на плод. Из-за неспецифичности клинических проявлений ВУИ диагностика ее во время беременности затруднена и возможна лишь при сочетанном использовании клинических и лабораторно - инструментальных методов исследования [16, 57].
Существует два направления в решении вопроса диагностики ВУИ: разработка диагностических критериев во время беременности и диагностика сразу после рождения ребенка [16, 38, 50]. Примером экспресс-диагностики
ВУИ у новорожденного является определение содержания IgM в пуповиннои крови [271]. К скрининговым тестам ВУИ у новорожденных группы высокого риска ее развития относят посевы пуповиннои крови и содержимого желудка новорожденного, культуры крови новорожденного [217,250].
У беременных посевы и соскобы берутся из влагалища и канала шейки матки, при этом бактериологические исследования должны сочетаться с идентификацией антигена в крови серологическими методами определения IgG и IgM, которые специфичны для того или иного возбудителя [2, 7, 16, 19,56,148,250].
Специфичным методом является ELISA-метод, в основу которого положено определение моноклональных антител в жидкостях и средах организма [33,82].
Существуют инвазивные методы получения материала для бактериологического исследования или ПЦР-диагностики (аспирация хориона, исследование амниотической жидкости и пуповиннои крови, полученных путем амнио- и кордоцентеза). Следует учитывать, что такие методики сопряжены с риском развития осложнений, как у матери, так и у плода [55, 67, 76, 257].
«Золотым стандартом» диагностики ВУИ считают гистологическое исследование плаценты, пуповины и плодных оболочек, хотя воспалительные изменения не всегда соответствуют заболеванию ребенка [41,72].
Несмотря на значительное число исследований, посвященных диагностике ВУИ, применяемые в настоящее время методы ее выявления не всегда могут служить объективными критериями диагностики данной патологии и использоваться для скрининга инфекции. Возможно с развитием науки и появлением новых сведений о различных аспектах воспалительного процесса, появятся достоверные критерии диагностики и прогнозирования ВУИ.
В возникновении ВУИ важную роль играют ограниченные возможности иммунной системы беременной к своевременному распознаванию и уничтожению этиологического агента инфекции [62, 200]. Иммунологическая защита против различных патогенов осуществляется в результате скоординированной работы врожденной и адаптивной систем иммунитета. Нарушение взаимодействия в гисто-иммунологических эпителиальных и плацентарных барьерах с различными инфекционными агентами сопровождается развитием инфекционного процесса у плода.
В последние годы появляются первые работы об участии механизмов врожденного иммунитета на клеточном и молекулярном уровне в репродуктивной функции человека [155, 231, 237, 264]. Факторы врожденного иммунитета, участвующие преимущественно в узнавании чужеродных белков и углеводов инфекционной природы, предсуществуют и индуцируются быстро (минуты, часы) после воздействия инфекционного агента.
Важное значение в развитии ряда патологических процессов, в том числе воспаления, имеют распознающие рецепторы врожденной иммунной системы: Toll-подобные рецепторы (TLRs). Они обеспечивают интегрирующую и регулирующую роль в активации и реализации врожденного иммунного ответа на микробные патогены [25, 38, 195, 196, 197, 273].
TLRs, распознавая консервативные молекулярные образцы различных патогенов, включая вирусы, бактерии, грибы, увеличивают локальный синтез цитокинов, простагландинов, хемокинов и противомикробных пептидов, что запускает механизм реализации воспалительного ответа [85, 278].
В связи с этим особый интерес представляет изучение TLRs, как маркеров прогнозирования осложнений беременности.
Таким образом, в проблеме ВУИ вопросы ее диагностики и прогнозирования являются наиболее актуальными в настоящее время. Имеются основания предполагать, что применение современных технологий для выявления доклинических признаков ВУИ может обеспечить раннюю
диагностику данной патологии и возможность новых подходов к разработке комплексных мер профилактики и лечения.
Цель исследования: Оценить прогностическую значимость комплексного исследования уровня экспрессии генов Toll-подобного рецептора 2, Toll-подобного рецептора 4 и противомикробного пептида HBD1 эпителием слизистой цервикального канала, клетками плаценты, мононуклеарными клетками крови при внутриутробной инфекции.
Задачи исследования:
Провести комплексное клинико-лабораторное обследование беременных с урогенитальной инфекцией для выявления группы высокого риска реализации внутриутробной инфекции.
Исследовать уровень экспрессии генов TLR2, TLR4 у здоровых беременных в эпителиальных клетках цервикального канала, мононуклеарных клетках периферической крови и клетках плаценты.
Исследовать уровень экспрессии генов TLR2, TLR4 у беременных группы высокого риска реализации внутриутробной инфекции в эпителиальных клетках цервикального канала, мононуклеарных клетках периферической крови и клетках плаценты.
Оценить уровень экспрессии гена противомикробного пептида HBD1 у здоровых беременных и беременных группы высокого риска реализации внутриутробной инфекции.
Определить роль параметров врожденного иммунитета TLR2, TLR4 и HBD1, как возможных маркеров невынашивания беременности и реализации внутриутробной инфекции.
Научная новизна.
Впервые в России проведена оценка экспрессии генов, распознающих рецепторов врожденного иммунитета (TLRs) и противомикробного пептида (HBD1) на системном и локальном уровнях при невынашивании беременности инфекционного генеза и внутриутробной инфекции.
Проведен анализ клинических проявлений ВУИ новорожденных и показана корреляция между повышением экспрессии гена TLR2 и снижением экспрессии противомикробного пептида HBD1 клетками плаценты и эпителиальными клетками цервикального канала при реализации ВУИ, что говорит о дисбалансе в системе врожденного иммунитета.
Полученные данные об изменении экспрессии генов TLRs у беременных с урогенитальной инфекцией помогли расширить представление о роли механизмов врожденного иммунитета в патогенезе невынашивания беременности.
Современные методы изучения компонентов врожденного иммунитета во время беременности открывают новые возможности в лечении и профилактике осложнений.
Получен патент на изобретение №2334233 «Способ прогнозирования преждевременных родов при урогенитальной инфекции».
Практическая значимость
Изучение социально - возрастного состава, а также соматического и гинекологического статуса беременных позволяет определить факторы риска для развития ВУИ плода у женщин в период беременности. Формирование групп повышенного риска среди женщин во время беременности способствует своевременной диагностике и проведению профилактического лечения ВУИ плода на ранних стадиях его развития. Определение факторов риска развития ВУИ позволяет выделить когорту беременных для
проведения динамического клинико-лабораторного контроля за состоянием будущей матери и плода с применением современных технологий.
Диагностика нарушений врожденного иммунитета дает возможность своевременно прогнозировать развитие осложнений во время беременности и определить показания к назначению иммунокоррегирующей терапии у новорожденных.
Выявленные изменения в экспрессии генов TLR2, проявляющиеся в ее увеличении и, напротив, снижении экспрессии противомикробного пептида HBD1 клетками плаценты и эпителиальными клетками цервикального канала могут быть рекомендованы в качестве маркеров ВУИ.
Положения, выносимые на защиту
Наличие урогенитальной инфекции (УГИ) у беременной является фактором риска развития акушерских осложнений во время беременности и родов, выраженность которых зависит от вида инфекционного агента, фазы и длительности инфекционного процесса, активности врожденного иммунитета.
Исследование компонентов врожденного иммунитета TLR2, TLR4 и HBD1 на локальном уровне (эпителиальные клетки цервикального канала и клетки плаценты) играет важную роль в прогнозировании исходов беременности.
Маркером реализации ВУИ является достоверное увеличение экспрессии гена TLR2 в эпителиальных клетках цервикального канала и клетках плаценты по сравнению со здоровыми беременными.
При беременности и наличии урогенитальной инфекции маркером невынашивания беременности является дисбаланс компонентов врожденного иммунитета: повышение экспрессии генов TLR2 и снижение экспрессии гена противомикробного
пептида HBD1 эпителиальными клетками цервикального канала и клетками плаценты.
Внедрение результатов работы в практику
Материалы диссертационного исследования используются в практике учебно-педагогического процесса на кафедре акушерства и гинекологии лечебного факультета РГМУ, кафедре иммунологии РГМУ и в практической работе родильного отделения городской больницы №8 г. Москвы.
Применение исследования экспрессии гена TLR2 эпителиальными клетками у беременных подтверждено патентом на изобретение «Способ прогнозирования преждевременных родов при урогенитальной инфекции» № 2334233.
Публикации результатов исследования
По теме диссертации опубликовано 27 печатных работ, в том числе 4 статьи - в центральной печати. Материалы диссертации представлены на VI съезде иммунологов и аллергологов СНГ, Российском национальном конгрессе аллергологов и иммунологов, III Российской конференции по иммунотерапии, Москва, Россия, 11-13 сентября 2006г.; X Всероссийском научном форуме 28 мая - 2 июня 2006г. «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге»; V конференции иммунологов Урала, Оренбург, октябрь 2006г.; II Международной (XI Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции, 2007г.; конференции молодых ученых «Современные вопросы акушерства и гинекологии», Москва, 20 апреля 2007г., II Ежегодном конгрессе специалистов перинатальной медицины памяти академика РАМН В.А.Таболина «Новые технологии в перинатологии», Москва, 1-2 октября 2007 г.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных наблюдений, заключения, выводов, практических
рекомендаций, указателя литературы, содержащего 83 отечественных и 95 зарубежных источников. Работа вьшолнена на 138 страницах машинописного текста, иллюстрирована таблицами и диаграммами.
Toll-подобные рецепторы в патогенезе осложнений при внутриутробной инфекции
В большинстве случаев инфекция может приводить к апоптозу, а гибель инфицированных клеток является важным аспектом защиты организма, при этом судьба беременности отодвигается на второй план. Апоптоз в плаценте усиливается по мере ее развития и играет роль в ее функционировании и старении. Преждевременная индукция апоптоза может вносить вклад в дисфункцию плаценты и в результате приводить к потере беременности.
Таким образом, нарушенная регуляция процессов апоптоза в плаценте является причиной неблагоприятного исхода беременности [132,166,171]. Увеличение апоптоза клеток плаценты наблюдается при преждевременных родах. Рост апоптоза клеток плаценты также наблюдается при беременности, осложненной синдромом задержки роста плода (СЗРП) и гестозом, этот процесс сопровождается снижением инвазии трофобласта и трансформацией спиральных артерий.
Определенные внутриутробные инфекции во время беременности оказывают как прямое, так и непрямое влияние на выживание клеток трофобласта, что зависит от активации различных TLRs.
Модели осложнений беременности на животных были получены при введении животным ЛПС грамотрицательных бактерий [144]. Компоненты клеточной стенки грамотрицательных бактерий активируют передачу провоспалительного сигнала путем стимуляции TLR4. В работе Elovitz М.А. и соавторов (2003) была исследована экспрессия TLR4 в гестационных тканях у мышей через 6 часов после внутриматочной инфузии ЛПС. Внутриматочное воспаление привело к увеличению в 2 раза экспрессии TLR4 в дне матки и снижению экспрессии TLR4 мРНК в нижнем маточном сегменте, тогда как в шейке матки изменений практически не было. Увеличение экспрессии TLR4 мРНК в дне матки может быть связано с прямым действием ЛПС или является вторичным к действию других провоспалительных медиаторов, генерируемых в ответ на ЛПС. Эти изменения можно рассматривать как механизм положительной обратной связи, усиливающей воспалительный ответ в матке, что приводит к родовому акту и обеспечивает защиту материнского организма от инфекции путем избавления от инфицированной беременности.
В исследовании Elovitz М.А. и соавторов (2003) было показано, что у мутантных по TLR4 мышей введение ЛПС не вызывало преждевременных родов. Преждевременные роды инфекционного генеза у человека представляют более сложный воспалительный ответ, не только обусловленный компонентами клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Однако в ряде исследований было показано, что генетический полиморфизм TLR4 у плода и у матери приводят к протективному эффекту или, напротив, к предрасположенности к преждевременным родам инфекционного генеза [189].
В исследовании Watari М. и соавторов (2000) показана экспрессия TLR2 и TLR4 гладкомышечными клетками шейки матки. Действие ЛПС через TLR4 приводит к продукции цитокинов и реализации механизма, по которому грамотрицательные бактерии ускоряют открытие шейки матки при преждевременных родах [262].
Группой исследователей из Чигагского Университета было показано увеличение экспрессии м-РНК TLR2 и TLR4 и увеличение секреции ФНОа при бактериальных вагинозах. Секреция ФНОа возрастает при стимуляции Mycoplasma hominis и Gardnerella vaginalis. В данном исследовании показано, что экспрессия мРНК TLR2 и TLR4 при бактериальном вагинозе возрастает в 60 раз по сравнению со здоровыми женщинами без БВ. Анти ФНОа-антитела блокируют увеличение экспрессии мРНК TLR4 у женщин с бактериальным вагинозом, что указывает на важную роль ФНОа в индукции TLR4.
Бактериальный вагиноз (БВ) характеризуется замещением нормальной микрофлоры влагалища, в которой преобладают лактобациллы, условно-патогенными анаэробными микроорганизмами [6, 17, 31, 44]. Romero R. И соавторы (2004) показали связь БВ и воспалительного ответа и провели оценку роли генетической эпидемиологии в прогнозировании преждевременных родов [232]. Эти исследования и другие показали, что БВ остается важным фактором риска преждевременных родов [184].
Таким образом, механизмы стимуляции секреции ФНОа и увеличения экспрессии мРНК TLR4 при бактериальном вагинозе объясняют отрицательное влияние БВ на течение беременности и увеличение частоты самопроизвольных абортов, преждевременных родов, хориоамнионита и СЗРП [162, 163].
Противомикробные пептиды (ПМП) представляют собой обширную группу катионных белков, обладающих противомикробной активностью. Противомикробные пептиды являются эффекторными молекулами врожденного иммунитета, способными поражать некоторые вирусы, бактерии, грибы и простейших [22, 69, 99, 206, 276]. Помимо того, что ПМП обладают прямым противомикробным действием, они являются важными регуляторными молекулами иммунной системы человека [109, 156]. ПМП принимают участие во врожденном и приобретенном иммунитете, осуществляют «instant immunity» — мгновенный иммунитет и являются, с одной стороны, естественными эндогенными антибиотиками, а с другой — сигнальными молекулами, вовлеченными в процессы активации клеток иммунной системы и репарации тканей [22, 29, 87, 215]. У млекопитающих подробно охарактеризованы два семейства ПМП: дефенсины и кателицидины [183, 235].
Дефенсины получили свое название от англ. defence — защита [22]. Это название отражает способность обеспечивать защиту организма от патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, стабилизирующих вторичную структуру пептидной молекулы. В зависимости от расположения дисульфидных связей, все дефенсины делятся на три группы: а-дефенсины, р-дефенсины и 0-дефенсины.
В организме человека содержится шесть известных а-дефенсинов: четыре из них, обозначаемые как HNP1-4 — человеческий нейтрофильный пептид — присутствуют в гранулах нейтрофилов, а дефенсины HD-5 и HD-6 экспрессированы в эпителиальных клетках кишечного и репродуктивного трактов.
Клиническая характеристика беременных исследуемых групп
Клинические образцы (клетки слизистой цервикального канала, гомогенизат плаценты, мононуклеарные клетки) подвергали лизису и из лизата выделяли РНК с помощью гуанидинтиоционата (Херрингтон С, 1999). Осадок, содержащий РНК растворяли в 20 мкл воды, содержащей в качестве ингибитора РНКаз, 0,1% диэтилпирокарбонат (DEPC), и хранили при-70С.
Качество полученной РНК оценивали с помощью электрофоретического разделения в 0,8% агарозном геле. Пригодными для дальнейшего анализа считали те образцы, которые давали характерную картину распределения пиков рРНК и тРНК.
Реакция обратной транскрипции служит для синтеза копии ДНК (кДНК) на матрице мРНК. Первым этапом проводили отжиг специфических праймеров на матрице мРНК при 75С. В следующем этапе добавляли ревертазу и инкубировали при температуре 37С в течение 1 ч. Хранили полученную кДНК при -70С (Маниатис, 1984). Полимеразная цепная реакция (ПНР) — это осуществляемая in vitro специфическая амплификация нуклеиновых кислот, инициируемая синтетическими олигонуклеотидными праймерами. ПЦР-цикл состоит из тепловой денатурации ДНК, ее отжига с праймером и элонгации цепи. Смена этих этапов происходит в результате смены температуры (Херрингтон С, 1999). Для количественного определения уровня экспрессии генов использовали полимеразную цепную реакцию в присутствии флуоресцентных зондов и интеркалирующего красителя SYBR Greenl. В качестве контроля был использован ген бета актина.
Олигонуклеотиды, используемые в качестве праймеров для обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции, были моделированы с помощью программы VectorNTI 8,0. ПНР проводили на амплификаторе АНК-32 (Синтол, РФ) и анализировали с помощью прилагаемого к прибору программного обеспечения.
Статистическая обработка материала. Полученные цифровые результаты исследования обрабатывали методами вариационной статистики. Среднюю статистическую величину М, среднеквадратичное отклонение G, ошибку средней m и коэффициенты корреляции г вычисляли на компьютере IBM/PC 586 с использованием пакета прикладных программ для статистической обработки «Excel» версия 7.0 раздел программы «Анализ данных», подраздел «Описательная статистика». Оценка корреляционной зависимости для непараметрических, ранговых величин проводили по методу Спирмена. Для определения достоверности различий между выборками использован уровень значимости по критерию Манна-Уитни и критерий Стьюдента для несвязанных совокупностей. Различия между сравниваемыми величинами признавали статистически достоверными при уровне значимости р 0,05.
Определение количественной экспрессии генов TLRs, противомикробного пептида (HBD-1) клетками слизистой цервикального канала, клетками плаценты и мононуклеарными клетками периферической крови проведено у 120 беременных, которые были разделены на 3 группы: 1-основная группа, 2-группа контроля, 3-группа сравнения. В основную группу входили 65 пациенток с наличием УГИ, беременность у которых закончилась преждевременными родами. Пациентки основной группы были разделены на две подгруппы. Недоношенные дети от 20 матерей 1а подгруппы имели разнообразные локальные и системные проявления внутриутробной инфекции. 16 подгруппу составили 45 пациенток, у их недоношенных новорожденных отсутствовали клинические признаки внутриутробной инфекции. Группу сравнения составили 25 беременных с урогенитальной инфекцией, беременность которых закончилась своевременными родами, реализации ВУИ в группе сравнения не было. Контрольную группу составили 30 женщин с физиологически протекающей беременностью, которая завершилась своевременными родами.
Возраст всех пациенток колебался от 19 до 42 лет. Характеристика беременных с учетом возраста представлена в таблице 6. Большую часть пациенток основной группы составили беременные в возрасте 25-34 лет (60% и 73% соответственно), однако в основной группе возраст пациенток свыше 35 отмечен статистически достоверно чаще, чем в контрольной группе (16,9% и 6,7% соответственно, р 0,05), и не имел достоверных отличий с группой сравнения.
При изучении условий работы были отмечены профессиональные вредности (воздействие компьютера, работа на химическом производстве, вибрация) у 65% пациенток в 1а подгруппе, 45% в 16 подгруппе, 45% в контрольной группе 2а, 60% в группе контроля. Домохозяйками были 25%, 35%, 30%, 20% женщин соответственно по группам.
У всех обследованных - женский тип телосложения, вторичные половые признаки развиты правильно. Анализ массо-ростовых отношений у обследованных женщин отклонений от популяционных норм не выявил.
Исследование экспрессии генов Toll-подобных рецепторов клетками плаценты у здоровых беременных и беременных с высоким риском реализации внутриутробной инфекции
В связи с этим исследование экспрессии генов TLR2 и TLR4 в клетках периферической крови, а именно мононуклеарных клетках представляются актуальным. Учитывая доступность получения данной биологической среды для исследования и возможность исследовать периферическую кровь до родоразрешения, метод изучения мононуклеарных клеток является рациональной альтернативой и/или дополнением к изучению экспрессии генов TLRs клетками плаценты.
Мононуклеарные клетки периферической крови представляют собой клетки - лейкоциты, имеющие округлое несегментированное ядро, к ним относятся моноциты и лимфоциты.
Моноциты являются источниками тканевых и органных макрофагов организма, отвечающих за фагоцитоз [18]. Лимфоциты - клетки иммунной защиты, которые в зависимости от роли в иммунитете и места образования делятся на В-лимфоциты и Т-лимфоциты. При беременности, в условиях физиологической иммуносупрессии и вынашивания генетически чужеродного плода, происходит компенсация путем усиления факторов врожденного иммунитета и накопления нейтрофилов, клеток моноцитарно-макрофагального ряда в периферической крови беременных. С одной стороны, восполняется защитный потенциал материнского организма на фоне развивающегося угнетения специфических, а с другой стороны -создается потеницальная опасность их активации [200]. Такое явление, когда иммунная система матери находится в состоянии постоянной готовности, Clark D.A. и соавт. (2001) назвали феноменом «молчаливого наблюдателя» («innocent bystander») [116].
Экспрессия генов TLRs мононуклеарными клетками периферической крови изучалась во втором и третьем триместрах беременности у женщин всех групп. Согласно полученным данным, экспрессия гена TLR2 мононуклеарными клетками, также как и клетками плаценты, превышала экспрессию гена TLR4 среди здоровых беременных (табл.18).
Сопоставив эти данные, мы пришли к выводу: если говорить об ответе врожденного иммунитета на инфекционные патогены через TLRs, то на локальном уровне - границе мать-плод этот механизм защиты функционирует (нами выявлены значительные изменения экспрессии генов TLRs клетками плаценты при невынашивании беременности инфекционного генеза и реализации ВУИ), тогда как на системном уровне - изменения экспрессии не столь выражены (табл.19, 20).
Таким образом, при наличии урогенитальной инфекции исследование параметров врожденного иммунитета в мононуклеарных клетках периферической крови малоинформативно и не отражает возможность распространения инфекции и реализации внутриутробной инфекции плода и новорожденного.
В цервикальном канале на границе между внутренней и внешней средой находится пограничный цилиндрический эпителий. Различные микроорганизмы и их продукты, инфицирующие эпителий, встречаются с факторами защиты, которые служат постоянным барьером на пути их проникновения. Иммунная защита организма против различных патогенов осуществляется в результате скоординированной работы врожденной и адаптивной систем иммунитета. Факторы врожденного иммунитета, участвующие преимущественно в узнавании чужеродных белков и углеводов инфекционной природы, предсуществуют и индуцируются быстро (минуты, часы) после воздействия инфекционного агента. Распознающими рецепторами врожденной иммунной системы являются TLRs, которые экспрессируются клетками эпителия, макрофагами, дендритными клетками, и др. При взаимодействии TLRs с микроорганизмами фагоциты секретируют провоспалительные факторы (цитокины, кислородные радикалы, противомикробные пептиды), развивается воспалительная реакция, направленная на элиминацию патогена.
В последние годы доказана экспрессия TLRs (в особенности TLR2, TLR4) в эпителии эндометрия и эпителиальных клетках нижних половых путей [273]. Воздействие микроорганизмов приводит к продукции цитокинов через активацию специфических рецепторов TLR. Увеличение синтеза цитокинов в шейке матки является причиной лейкоцитарной инфильтрации и открытия шейки матки. Открытию шейки матки также способствует активация протеаз. Повышение активности протеаз может привести к изменению структуры плодных оболочек и их преждевременному разрыву. Сохранение лейкоцитарной инфильтрации и продукция провоспалительных цитокинов способствуют увеличению синтеза простагландинов в децидуальной ткани и миометрии и преждевременному началу родовой деятельности (см. рис.3 с.35).
Исследование экспрессии гена противомикробного пептида HBD1 клетками плаценты у здоровых беременных и беременных с высоким риском реализации внутриутробной инфекции
Проблемой в акушерстве в течение многих лет остается внутриутробная инфекция, занимающая одно из ведущих мест в развитии осложнений беременности, а также в структуре материнской и перинатальной заболеваемости и смертности. ВУИ является причиной широкого спектра патологии: инфекционных заболеваний плода, мертворождений, пороков развития плода, плацентарной недостаточности, синдрома задержки роста плода, хронической гипоксии, невынашивания беременности. В настоящее время возрастает число данных, подтверждающих взаимосвязь между субклинически протекающей внутриутробной инфекцией и преждевременными родами. В последнее время уделяется большое внимание иммунологическим аспектам реализации внутриутробной инфекции. Несмотря на обширные исследования в области репродуктивной иммунологии, следует отметить, что большинство из них освещает данную проблему с позиций действия системных иммунных реакций. В то же время, изучение местного иммунитета, изменений иммунологических параметров на уровне гистологических барьеров мать-плод (плацента, слизистая цервикального канала) при физиологически протекающей беременности и при патологии беременности является перспективным в изучении патогенеза осложнений беременности и открытии возможных маркеров развития ВУИ и других осложнений беременности. Известно, что клетки плаценты могут взаимодействовать с микроорганизмами в зоне имплантации и способны инициировать иммунный ответ. Таким образом, трофобласт может функционировать как активный участник системы врожденного иммунитета [155].
Особенный интерес представляет изучение рецепторов врожденного иммунитета, таких как TLRs, открытие которых привело к отказу от ряда устоявшихся в клинической иммунологии догм. Так, открытие TLRs заставило признать способность относящихся к факторам врожденного иммунитета фагоцитирующим клеткам распознавать чужеродность микроорганизмов. TLRs экспрессируются моноцитами, макрофагами, NK клетками, дендритными клетками; клетками эпителия, эндотелия и трофобласта. Способность TLRs запускать серию биохимических реакций, приводящих к выработке противомикробных пептидов, провоспалительных цитокинов и инициации адаптивного иммунитета определяет ответ организма на возбудителей вирусных и бактериальных инфекций и возможно играет важную роль в прогнозировании осложнений беременности. Мутации и полиморфизм генов TLRs и молекул, обеспечивающих проведение сигнала, могут приводить к нарушению распознавания соответствующих лигандов и активации эффекторных клеток. Изменения в генах TLRs определяют особенности индивидуального воспалительного ответа на инфекцию.
Работа основана на наблюдении за 120 пациентками во время беременности и родов, а также их новорожденными в раннем неонатальном периоде.
Были выделены 3 группы пациенток: 1-основная группа, 2-группа контроля, 3-группа сравнения. В основную группу входили женщины с наличием УТИ, невынашиванием беременности инфекционного генеза. Пациентки основной группы были разделены на две подгруппы. Недоношенные дети от 20 матерей 1а подгруппы имели разнообразные локальные и системные проявления внутриутробной инфекции. 16 подгруппу составили 45 женщин, у их недоношенных новорожденных отсутствовали клинические признаки внутриутробной инфекции. Контрольную группу составили 30 женщин с физиологически протекающей беременностью, которая завершилась своевременными родами. Группу сравнения составили 25 беременных с урогенитальной инфекцией, беременность которых закончилась своевременными родами, реализации ВУИ в группе сравнения не было.
Критериями отбора в основную группу являлись: срок беременности 26-36 недель, невынашивание беременности инфекционного генеза, родоразрешение через естественные родовые пути, исключение генетических, анатомических и гормональных причин невынапшвания беременности, отсутствие системных аутоиммунных заболеваний и гестоза. Пациентки с невынашиванием беременности основной группы не получали антибактериальную и иммунопрофилактическую терапию в качестве подготовки к беременности, в том числе и при первом взятии крови и слизи цервикального канала для определения уровней экспрессии TLRs и HBDL
В исследуемых группах изучали: данные анамнеза, течение настоящей беременности по триместрам, особенности родового акта, оценивали состояние новорожденных. Анализировали течение и структуру клинических форм УТИ. Всем пациенткам проводили комплексное клинико-лабораторное обследование. Взятие проб эпителия цервикального канала во время беременности проводили гинекологическим ершиком, мононуклеарные клетки получали из периферической венозной крови, ткань плаценты гомогенизировали в присутствии жидкого азота. Для изучения экспрессии генов были использованы следующие методы: выделение общей РІЖ, реакция обратной транскрипции и полимеразная реакция в реальном времени. Средний возраст в исследуемых группах составил 25,7 ± 0,26 лет, с индивидуальными колебаниями от 19 до 42 лет. При клиническом анализе было выяснено, что пациентки I, II, III групп достоверно не отличались по возрасту, наследственности, характеру менструальной функции.
