Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления о патогенезе, прогнозировании и диагностике аденомиоза (обзор литературы) 16
1.1. Патогенез и прогнозирование аденомиоза 16
1.2. Методы диагностики аденомиоза 22
1.2.1. Традиционные методы диагностики аденомиоза 22
1.2.2. Протеомные подходы к диагностике аденомиоза 27
1.2.3. Изменения цитокиное при аденомиозе 34
1.2.4. Изменения соотношения факторов роста при аденомиозе 46
1.2.5. Система врожденного иммунитета при аденомиозе 48
Глава 2. Программа, контингент, материалы и методы исследования 56
2.1. Программа и контингент исследования 56
2.2. Материалы и методы исследования 60
2.2.1. Клинические методы исследования 60
2.2.2. Инструментальные методы исследования 61
2.2.3. Метод протеомного профилирования сыворотки крови 62
2.2.4. Иммунологические методы исследования 70
2.2.5. Математические методы анализа полученных результатов 76
Глава 3. Клиническая характеристика обследованных пациенток 79
Глава 4. Результаты лабораторных и функциональных методов исследования 93
4.1. Сравнительная оценка эффективности клинических и инструментальных методов исследования в диагностике аденомиоза 93
4.2. Протеомное профилирование сыворотки крови с использованием МАЛДИ масс-спектрометрии у больных аденомиозом 96
4.3. Содержание факторов роста и других цитокинов в сыворотке крови больных аденомиозом 107
4.4. Система врожденного иммунитета при аденомиозе 112
Глава 5. Обсуждение полученных результатов 119
Выводы 148
Практические рекомендации 151
Указатель литературы 152
- Традиционные методы диагностики аденомиоза
- Метод протеомного профилирования сыворотки крови
- Протеомное профилирование сыворотки крови с использованием МАЛДИ масс-спектрометрии у больных аденомиозом
- Система врожденного иммунитета при аденомиозе
Введение к работе
Актуальность проблемы. Несмотря на вековую историю изучения различных аспектов проблемы эндометриоза, это заболевание остается одной из центральных медико-социальных проблем. Эндометриоз стоит на III месте в структуре гинекологической заболеваемости и поражает более 50% женщин в репродуктивном возрасте, отрицательно влияя на психоэмоциональное состояние, снижая работоспособность и репродуктивную функцию (Адамян Л.В., Кулаков В.И., 2006).
В течение последнего десятилетия отмечено возрастание частоты заболевания эндометриозом, а также «омоложение» контингента заболевших. Однако сколько-нибудь точно судить о распространенности этого заболевания трудно, поскольку нет четких статистических данных (Дамиров М.М., 2010).
Многообразие локализаций эндометриоза обусловило большое число теорий его происхождения. Однако ни одна из них не может до конца объяснить возникновение и разрастание эндометриоидных гетеротопий.
Нет сомнений в мультифакториальном характере эндометриоза. В основе многих таких заболеваний лежит нарушение молекулярных механизмов как синтеза, так и особенно транспорта регуляторных белков, что было основанием для присуждения Нобелевской премии по физиологии и медицине Л.Хартвеллу и П.Нерсу в 2001 году.
В последние годы генитальный внутренний эндометриоз тела матки (аденомиоз) принято рассматривать в качестве особого заболевания, которое существенно отличается от наружного эндометриоза по патогенезу, эпидемиологии и клинической картине (Сидорова И.С, Коган Е.А., 2008; Bergeron С. et al., 2006).
Удельная частота аденомиоза в структуре генитального эндометриоза достигает 70-90%. На основании клинических проявлений диагноз «аденомиоз» может быть поставлен в лучшем случае в 50% наблюдений, в 75% случаев диагноз не устанавливается, в 35% наблюдается гипердиагностика (Гаврилова Т.Ю., 2007). Это связано с тем, что этиология и патогенетические механизмы, ответственные за развитие аденомиоза, до сих пор недостаточно подробно изучены и для корректной диагностики требуется гистопатологическое заключение после удаления матки.
В последнее время для диагностики аденомиоза широко применяют метод ультразвуковой диагностики (УЗИ), однако данные о его информативности противоречивы, так как визуальные характеристики эндометриоидных очагов базируются на косвенных эхографических признаках (Rizk, 2010).
Гистероскопия обладает большей информативностью в диагностике аденомиоза по сравнению с УЗИ, однако данный метод является инвазивным, требующим госпитализации и к тому же не дает в 100% случаев достоверный
диагноз (Bradley, 2009). Широко распространенная на западе офисная гистероскопия пока не завоевала в нашей стране большой популярности в виду большой стоимости оборудования.
Следовательно, необходима разработка и внедрение в практику новых и информативных методов ранней диагностики аденомиоза.
В последние годы для поиска в сыворотке крови новых маркеров различных заболеваний все чаще используются постгеномные методы анализа, среди которых протеомные технологии занимают ведущие позиции (GehoD.H., 2006; Belluco S., 2007; Leiser A. et al, 2007; Ильина E.H., Говорун B.M., 2009).
Масс-спектрометрия - метод анализа вещества путем определения отношения массы к заряду и относительного количества ионов, получаемых при ионизации и фрагментации исследуемого вещества. За разработку этого метода Джон Фенн и Кончи Танаке были удостоены Нобелевской премии по химии в 2002 году.
Рядом преимуществ по сравнению с другими вариантами обладает времяпролетная МАЛДИ масс-спектрометрия. Этот метод обладает большей производительностью и чувствительностью (Baumann S., 2005; De Noo М.Е., 2005; Alexandrov Т. et al., 2010).
В литературе описаны примеры успешного применения этого метода для выявления различий между сывороткой крови больных раком желудка, прямой кишки, простаты, эндометрия, яичников, гепатоклеточной карциномы и сывороткой крови здоровых людей (De Noo М.Е., 2006; Engwegen J.Y., 2006; Liotta L.A., 2006; Зиганшин Р.Х. с соавт., 2008). В то же время информативность МАЛДИ масс-спектрометрии при аденомиозе до сих пор изучена не была.
Результаты многолетних клинических исследований по проблеме эндометриоза позволили В.Е. Радзинскому и соавт. (2005) заключить, что естественное течение заболевания на начальном этапе абсолютно непредсказуемо. Особого внимания заслуживают данные авторов о том, что прогрессирующее течение аденомиоза обнаруживается у 2/3 пациенток в течение года с момента установления диагноза. При этом невозможно предсказать, у каких именно пациенток патологический процесс будет прогрессировать.
По данным последних лет эффективность лечения аденомиоза определяется степенью его активности, установление которой, особенно на дооперационном этапе, представляет большие трудности (Унанян А.Л., 2006; Nucci,2010).
К настоящему времени можно считать доказанной роль многих цитокинов и факторов роста в патогенезе эндометриоза (Khan K.N. et al.,
2005; Lee S. et al., 2007; Kim J.G. et al., 2008). В то же время, лишь очень небольшое число исследований касалось аденомиоза (Сидорова И.С, Унанян А.Л., 2006; Бурлев В.А., 2006; Bergeron С, 2006; Есаян Н.Г., 2007; Гаврилова Т.Ю., 2007).
В последние годы изменилось представление о роли системы врожденного (неспецифического) иммунитета. Было установлено, что эта система активируется не только в ответ на внедрение инфекционных патогенов, но и при различных эндогенных деструктивных процессах. (Клюшник Т.П., 2007; Lehnardt S., 2010).
Активность лейкоцитарной эластазы (ЛЭ) и al- протеиназного ингибитора (al-ПИ) в сыворотке крови отражают степень активации врожденного иммунитета, а также состояние антипротеолитического (компенсаторного) потенциала.
В качестве иллюстрации вышесказанного можно привести работу Адамян Л.В. и соавт. (2005), в которой продемонстрирована зависимость концентрации ЛЭ в крови и в перитонеальной жидкости от степени распространенности аденомиоза, что определялось морфологически, однако взаимосвязь с клинической картиной и со степенью тяжести аденомиоза изучена не была.
Таким образом, комплексное определение вышеперечисленных показателей иммунитета позволяет выявить наличие патологического деструктивного процесса в организме и уточнить его тяжесть, а также выраженность компенсаторного потенциала.
Подводя итог, нужно отметить, что, несмотря на большое число исследований, посвященных различным аспектам аденомиоза, до сих пор не выяснены вопросы этиологии и патогенеза заболевания, отсутствуют четкие диагностические критерии и надежные неинвазивные методы диагностики, методы определения прогноза аденомиоза. В связи с этим представляет большой интерес разработка вопросов патогенеза развития аденомиоза, современных критериев диагностики и прогнозирования течения данного заболевания.
Цель исследования
Разработать и внедрить комплекс постгеномных методов исследования для повышения точности диагностики и прогнозирования течения аденомиоза на основании расширения знаний о молекулярно-биологических аспектах его патогенеза.
Задачи исследования 1. Оценить информативность существующих традиционных методов
диагностики аденомиоза.
Выявить в сыворотке крови потенциальные пептидные маркеры аденомиоза и обосновать возможность их использования для диагностики данного заболевания.
Провести сравнение потенциальных пептидных маркеров в сыворотке крови у больных с различными доброкачественными и злокачественными гинекологическими заболеваниями в рамках дифференциальной диагностики аденомиоза.
Определить роль факторов роста и ряда цитокинов в возникновении и развитии аденомиоза, а также зависимость между их концентрацией в сыворотке крови и степенью активности течения аденомиоза.
Проанализировать активность Txl- и Тх2-клеток, составляющих основную часть популяции CD4+, при аденомиозе.
Определить роль некоторых компонентов неспецифического иммунитета (лейкоцитарной эластазы и al-протеиназного ингибитора) в патогенезе аденомиоза, а также зависимость между их концентрацией в сыворотке крови и степенью активности течения аденомиоза.
Оценить возможность использования цитокинов, факторов роста, показателей системы неспецифического иммунитета в прогнозировании и диагностике аденомиоза, а также определении активности его течения.
Разработать и обосновать алгоритм обследования женщин с риском возникновения аденомиоза для определения прогноза и/или ранней диагностики заболевания.
Научная новизна
Расширены представления о патогенезе аденомиоза и его особенностях, а также показаны клинические признаки при различной активности течения заболевания.
Дана сравнительная оценка визуальных методов диагностики (УЗИ, гистероскопия) аденомиоза.
Впервые методом протеомного профилирования сыворотки крови с
использованием МАЛДИ масс-спектрометрии определены
диагностические маркеры аденомиоза, доказана возможность проведения дифференциальной диагностики между аденомиозом и другими гинекологическими заболеваниями (миомой матки, гиперплазией эндометрия и пр.)
В новых и расширенных представлениях о патогенезе аденомиоза определена роль Т-хелперов 1 и 2 типа, составляющих основную часть популяции CD4+ и определяющих тип иммунного ответа. Показано, что Txl-клетки, синтезирующие ИФу, ФНОа и ИЛ-2, не принимают непосредственного участия в развитии аденомиоза, в то время как Тх2-клетки, синтезирующие ИЛ-6 и ИЛ-10, играют значительную роль в иммунных реакциях при аденомиозе.
Помимо этого, установлена роль про- и противовоспалительных цитокинов, а также факторов роста в патогенезе аденомиоза. Впервые выявлена взаимосвязь между уровнем данных показателей в сыворотке крови и степенью активности течения аденомиоза, что имеет значение в прогнозировании заболевания, а также выборе тактики ведения больных.
На основании комплексного исследования показателей врожденного иммунитета в сыворотке крови определено их место в диагностике заболевания и намечены возможные пути коррекции. Определено значение степени нарушений системы протеолиза в прогнозировании заболевания.
Практическая значимость
Разработаны алгоритм обследования, прогнозирования, ранней диагностики и тактики ведения больных аденомиозом, что позволяет достоверно устанавливать диагноз без применения инвазивных методов диагностики, а также оценивать степень активности заболевания и определять дальнейшую тактику ведения больных.
Установлена высокая ценность комплексного обследования больных аденомиозом (анализ жалоб, анамнеза, гормональных и иммунологических детерминант) и современных инновационных методов диагностики, таких как МАЛДИ масс-спектрометрия, исследование цитокинов, факторов роста и показателей врожденного иммунитета, что позволяет определить степень распространения процесса, прогноз заболевания, правильно выбрать способ лечения.
Использование предложенного алгоритма диагностики
целесообразно не только с клинических позиций, но и с экономических, т.к. позволяет снизить затраты лечебного учреждения за счет более быстрой и достоверной диагностики. Сыворотка крови, использующаяся в данном методе диагностики, является клиническим образцом, который удобно получать, хранить и транспортировать из любых отдаленных районов.
Положения, выносимые на защиту
1. Традиционные методы диагностики аденомиоза - клинический, УЗИ,
гистероскопия и их сочетания не достигают высокой чувствительности и
специфичности и, следовательно, не являются достаточными для
верификации диагноза, определения степени активности процесса и выбора
оптимальной тактики.
2. Изменения в сыворотке крови, возникающие при аденомиозе,
определяемые с помощью протеомного профилирования с использованием
МАЛДИ масс-спектрометрии, информативны в дифференциальной
диагностике аденомиоза и других доброкачественных и злокачественных
гинекологических заболеваний.
В развитии аденомиоза важную роль играют нарушения в системе цитокинов (интерлейкины - 6 и 10), факторов роста (сосудисто-эндотелиальный фактор роста, эпидермальный фактор роста), компонентов врожденного иммунитета (лейкоцитарная эластаза и al-протеиназный ингибитор). Реакции Txl-клеток не связаны с патогенезом аденомиоза, в то время как активность Тх2-клеток имеет принципиальное значение для развития эффективного иммунитета при аденомиозе.
Увеличение содержания цитокинов, факторов роста и лейкоцитарной эластазы в сыворотке крови коррелирует со степенью активности аденомиоза; на основании значений концентрации al-протеиназного ингибитора можно делать выводы о степени компенсаторного потенциала и определять прогноз заболевания.
Апробация диссертационного материала
Материалы и основные положения диссертации доложены и обсуждены на Международных конгрессах: VI Региональный научный форум «Мать и дитя» (Екатеринбург, 2010), XI Всероссийский научный форум «Мать и дитя» (Москва, 2010), V Конгресс Международной Ассоциации Репродуктивной Медицины (Москва, 2010), XIII Всемирный Конгресс «Вопросы акушерства, гинекологии и бесплодия» (Германия, Берлин, 2010), XI Всемирный Конгресс по эндометриозу (Франция, Монпелье, 2011), Всероссийская конференция с международным участием по гинекологической эндокринологии и менопаузе (Москва, 2011).
Обсуждение диссертации состоялось на совместной научной конференции сотрудников кафедры акушерства и гинекологии с курсом перинатологии медицинского факультета ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» и практических врачей ГКБ №29 г.Москвы 15 сентября 2011 года.
Внедрение результатов работы
Разработанная система диагностики аденомиоза и результаты работы используются в материалах семинаров, лекций, на практических занятиях по повышению квалификации врачей акушеров-гинекологов ФПК MP ФГБОУ ВПО РУДН.
По материалам диссертации опубликовано 24 научных работ в отечественной и зарубежной печати, из них 16 - в журналах, включенных в перечень ВАК РФ. Материалы диссертации опубликованы в учебном пособии «Эндометриоз» (2011).
Структура и объем диссертации
Традиционные методы диагностики аденомиоза
Диагностика аденомиоза, и эндометриоза вообще, представляет определенные трудности. Так, исследования специалистов различных стран в этой области подтвердили, что часто диагноз ставят с опозданием в несколько лет [32,126]. В Великобритании период с момента появления боли до установления диагноза в среднем составляет 6,8 года, в Австралии (748 обследованных) - в среднем 1,7 года проходит от момента появления симптомов до консультации врачом и 4,4 года от консультации до установления диагноза. Среди 15-19-летних больных время установления диагноза составляет 8,3 года, среди 30-34-летних - 1,3 года. В США средняя задержка диагностики составляет 11,7 лет [178].
Приведенные данные убедительно доказывают, что даже в экономически развитых странах, где имеются высокие медицинские технологии и высокий жизненный уровень, диагностика эндометриоза не на должном уровне. Для оптимизации диагностики необходим комплексный подход. Несмотря на современные достижения медицины, не утратило своего значения бимануальное обследование больной наряду с учетом анамнеза и особенностей клинической картины заболевания [25].
Бимануальное исследование позволяет оценить величину матки, ее консистенцию, форму, характер поверхности, состояние придатков матки, наличие опухолевидных образований и спаечного процесса в малом тазу. При бимануальном исследовании, например, выявляют один из классических признаков аденомиоза — увеличение объема матки, особенно во II фазе цикла [1]. На основании клинических признаков, включая данные бимануального исследования, точная диагностика аденомиоза затруднена. Даже значительные анатомические изменения не всегда сопровождаются какими-либо функциональными нарушениями. С другой стороны, незначительные поражения могут вызывать выраженные нарушения функции репродуктивной системы. Типичная клиническая симптоматика встречается далеко не у всех женщин с аденомиозом, помимо этого, эти клинические проявления могут являться симптомами других заболеваний [25,77,86,156,207,231].
В связи с выше изложенным, в диагностике аденомиоза немаловажное значение имеет применение высокоинформативных инструментальных методов исследования [33,35,136,292].
УЗИ является единственной широкодоступной неинвазивной методикой, позволяющей с различной долей достоверности заподозрить аденомиоз при его диффузной форме, а также определить локализацию и размер очагов при его узловой форме [60,73,76,78,113,128,132,158]. Большое число исследований, посвященных изучению сравнительной информативности УЗ-признаков аденомиоза, позволяет определить наиболее характерные из них [34,216,222,238,271]:
округлость формы тела матки;
увеличение переднезаднего размера матки и ассиметричное утолщение одной из стенок;
неравномерность толщины базального слоя эндометрия, его зазубренность;
зона повышенной эхогенности круглой или овальной формы в миометрии и наличие в ней кистозных полостей;
выявление близко расположенных полос повышенной и пониженной эхогенности, ориентированных перпендикулярно полости матки;
повышенная васкуляризация миометрия (при допплеровском сканировании);
наличие в миометрии от 1 (чаще всего) до 3-4 компактно расположенных эхопозитивных включений однородной структуры неправильной округлой, овальной или глыбчатой
формы, размерами от 2 до 6 мм в диаметре - при узловой форме аденомиоза.
В то же время, нет единого мнения об информативности эхографии в диагностике аденомиоза: так точность его выявления составляет 10-80% [224,308].
По данным М.М. Дамирова [32], точность диагностики адеомиоза при помощи трансвагинального УЗИ не превышает 62-86%. Это объясняется тем, что не всегда можно отличить эндометриоидные полости в миометрии от ложных эхо-сигналов (расширенные сосуды при хроническом эндометрите), увеличение переднезаднего размера матки при аденомиозе или при других патологических состояниях (например, при миоме матки) и т.д. [12,29,103].
Несмотря на высокоинформативность трансвагинального ультразвукового сканирования в диагностике аденомиоза, оно не позволяет определить с точностью степень распространения патологического процесса, в то время как последнее обстоятельство имеет большое значение при выборе терапии [33,35,60,120,158].
В современной литературе неоднозначно отношение к возможности использования гистероскопии в обнаружении аденомиоза [152,261,301]. Многие авторы указывают на высокую информативность гистероскопии в диагностике узловой формы аденомиоза, для которой характерны увеличение и деформация полости матки в результате локального выбухания и изменения рельефа стенок. Гистероскопическая картина при множественной локализации эндометриоидных очагов напоминает строение пчелиных сот. Выявление аденомиоза при использовании гистероскопии основывается на [93,218,271]:
визуализации устьев эндометриоидных ходов в виде темно-красных точечных отверстий на фоне бледно-розовой слизистой с изливающейся из них кровью;
расширение полости матки и неравномерность ее контуров;
скалистый, петлистый рисунок стенок, наличие крипт, не исчезающих после удаления функционального слоя эндометрия.
Многие авторы подчеркивают, что основным эндоскопическим признаком заболевания является наличие устьев эндометриоидных ходов в виде темно-красных точечных отверстий на фоне неизменной слизистой оболочки тела матки, из которых в ряде случаев изливается кровь [93,152]. Вместе с тем, некоторые авторы высказывают определенные сомнения в диагностической ценности этого признака, учитывая визуализацию точечных темно-красных очагов после РДВ функционального слоя эндометрия, при удалении которого повреждаются сосуды базального слоя эндометрия, и, нередко кровоточащие венулы принимают за очаги эндометриоза [32,50].
Г.М.Савельева и соавт. [93] разработали гистероскопическую классификацию аденомиоза, согласно которой выделяют три стадии развития заболевания. При I стадии рельеф стенок не изменен, определяются эндометриоидные ходы в виде глазков темно-синюшного цвета или кровоточащие. Стенки матки при выскабливании обычной плотности. При II стадии - рельеф стенок матки (чаще задней) неровный, имеет вид продольных или поперечных хребтов или разволокненных мышечных волокон; просматриваются эндометриоидные ходы. Полость матки плохо растяжима, стенки ее ригидные и при выскабливании более плотные. При III стадии по внутренней поверхности матки определяются выбухания различной величины без четких контуров с открытыми или закрытыми эндометриоидными ходами. При РДВ стенки матки плотные с неровной поверхностью.
Офисная гистероскопия с диаметром гистероскопа от 2 до 5 мм позволяет проводить исследование в амбулаторных условиях без расширения цервикального канала и без анестезии, однако большая стоимость такого оборудования делает его неприемлемым в широкой сети медицинских учреждений [152].
Точность гистероскопии в оценке аденомиоза составляет до 85% и возрастает при сочетании с биопсией эндо- и(или) миометрия с последующим гистологическим исследованием. Полифокальная трансцервикальная биопсия миометрия позволяет не только верифицировать диагноз «аденомиоз», но и определить стадию заболевания (глубина проникновения в миометрий 20мм), в отличие от биопсии, выполненной гистерорезектоскопом (глубина проникновения в миометрий 6 мм) [17,59,121].
Метод протеомного профилирования сыворотки крови
Исследование проводили научные сотрудники лаборатории протеомики Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук (руководитель - проф. Говорун В.М.).
Для фракционирования образцов сывороток крови использовали наборы для профилирования, содержащие магнитные микрочастицы с функционализированной поверхностью MB-HIC 8, MB-HIC 18, MB -WCX и MB-IMAC Си производства компании Bruker Daltonics (Германия). Описание этих наборов для профилирования, а также рекомендованных для них протоколов фракционирования можно найти на Интернет странице компании - www.bdal.de.
Фракционирование сывороток крови проводили на специализированном роботе ClinProt robot (Bruker Daltonics, Германия), по протоколу, рекомендованному производителем магнитных микрочастиц, с небольшими модификациями. Элюаты наносили на стальную полированную 384-точечную масс-спектрометрическую мишень (МТР 384 target plate polished steel TF) в двух повторах, после высушивания на воздухе на образец наносили раствор матрицы. В качестве матрицы использовали смесь 2,5-дигидроксибензойной кислоты (3 мг/мл) и альфа-циано-гидроксикоричной кислоты (2,4 мг/мл) в метанол/ацетонитрил/вода 5:4:1.
Времяпролетная МАЛДИ масс-спектрометрия.
Масс-спектры получали с использованием времяпролетного масс-спектрометра Ultraflex (Bruker Daltonics, Германия) (рис.9). Десорбцию образцов осуществляли иррадиацией азотным лазером (длина волны 337 нм), работающим при частоте 25 Гц. Для удаления пиков матрицы использовали максимальный уровень подавления сигнала вплоть до 900 Да.
Спектры регистрировали в линейном режиме положительно заряженных ионов в диапазоне масс 1-15 кДа. Для калибровки использовали калибровочную смесь, содержащую пептиды и белки в диапазоне масс 1-17 кДа. Для увеличения чувствительности детекции избыток матрицы удаляли 10 импульсами лазера при мощности 45% с последующей аккумуляцией данных при мощности лазера 27%. Для каждого спектра суммировали результаты 600 лазерных импульсов (по 60 импульсов с 10 различных точек пятна). Суммировали спектры с отношением сигнал/шум 5 и разрешением 300.
Обычно метод МАЛДИ используется в сочетании с времяпролетным масс-анализатором, поскольку этот тип анализатора характеризуется высокой чувствительностью и неограниченным диапазоном масс. Кроме того, именно времяпролетные приборы лучше других работают с импульсными методами ионизации. Современный времяпролетный МАЛДИ-масс-спектрометр имеет следующие основные характеристики (табл.1).
Математические модели классификации.
После профилирования сывороток крови по полученным массивам масс-спектров определяли комбинацию пиков, наилучшим образом отличающих спектры образцов патологии от контроля. Метод простого перебора всех возможных комбинаций для этого не подходит: потребуется слишком много времени, поскольку число возможных комбинаций очень большое. К примеру, для 1000 пиков из трех пиков можно составить 1.000 999 998 = 997.002.000 комбинаций. Поэтому для определения необходимой комбинации пиков используются более сложные подходы.
Существует ряд математических алгоритмов, позволяющих достаточно быстро определить оптимальную комбинацию пиков, отличающих спектры различных классов [187]. В результате мы создали математическую модель, по которой в дальнейшем классифицировали новые спектры как относящиеся к конкретному классу (рис.10).
Масс-спектрометрические данные анализировали с использованием компьютерной программы ClinProTools 2.1 (Bruker Daltonics, Германия).
Генетический алгоритм.
Концепция ГА была разработана Джоном Холландом в 1992г. Принцип алгоритма базируется на идее эволюции, в которой наиболее приспособленные индивидуумы имеют наибольший шанс для выживания [187].
Генетический алгоритм работает с популяциями, состоящими из множества комбинаций масс-спектрометрических пиков. Отбор наиболее приспособленных комбинаций пиков осуществляется при помощи оптимизации функции стоимости, направленной на разделение сравниваемых классов с наибольшим расхождением между ними. Каждая комбинация пиков ранжируется с использованием данной функции стоимости по уровню затрат, которые и являются мерой приспособленности данной комбинации пиков. Используемая алгоритмом процедура скрещивания объединяет случайно выбранные пары комбинаций пиков с образованием дочерних комбинаций, которые замещают родительские.
Целью такого скрещивания является создание из двух достаточно хороших комбинаций пиков еще лучшей. Конечно, в результате такого скрещивания могут возникать и менее приспособленные комбинации пиков, но они в процессе эволюции не смогут выживать в течение продолжительного времени. Наконец, ограниченное количество комбинаций пиков случайным образом модифицируется посредством «мутаций» - замены некоторых пиков в комбинациях на другие, выбранные случайным образом. Это делается для предупреждения преждевременного схождения эволюционирующих комбинаций пиков в локальные оптимумы.
Преимущество ГА перед методом прямого перебора всех возможных вариантов заключается в значительно меньших затратах вычислительного времени, необходимых для его проведения, и обеспечивающего, тем не менее, достаточно хороший результат. Недостатком ГА является то, что алгоритм позволяет получить лишь оптимальное решение и не может гарантировать нахождение наилучшей комбинации пиков, если не были проверены все комбинации [187].
Управляемая нейронная сеть.
Алгоритм УНС представляет собой модифицированную версию алгоритма, разработанного Барбарой Хаммер с соавторами, и является частным случаем метода дискриминантного анализа. Принцип работы этого обучаемого математического алгоритма основан на определении оптимальной границы, разделяющей два множества данных.
При сравнении набора спектров патологии и контроля, УНС определяет характеристические спектры для обоих классов. Эти спектры называются прототипами. Нахождение прототипов является сложной задачей, поскольку классификационная модель строится на ограниченном числе спектров, тогда как должна уметь различать и другие спектры (к примеру, спектры для внешней валидации). При получении спектра нового образца (для диагностики) модели достаточно соотнести новый спектр с характеристическими спектрами исходных классов.
Преимуществом УНС является то, что алгоритм имеет хорошую производительность для больших массивов спектров. Кроме того, алгоритм позволяет строить математические модели для трех и более классов спектров [187].
При построении классификационных моделей использовали следующие параметры. Для Генетического алгоритма: количество пиков, входящих в создаваемую модель классификации - не более 20, число поколений - не более 200. Количество пиков, используемых для построения классификационной модели на основе УНС, выбиралось алгоритмом автоматически (но не более 25). Для построения классификационных моделей масс-спектры каждой из групп «контроль» и «аденомиоз» разделяли на две группы, одну пару использовали для построения классификационной модели, а вторую - для проверки ее достоверности.
Результатом измерения являлся масс-спектр: график зависимости интенсивности сигнала на детекторе (arb.u.) от отношения массы к заряду детектируемого иона (m/z).
Протеомное профилирование сыворотки крови с использованием МАЛДИ масс-спектрометрии у больных аденомиозом
На основании масс-спектрометрического профилирования 120 сывороток крови больных аденомиозом и 50 здоровых женщин контрольной группы после их фракционирования на магнитных микрочастицах со слабой катионообменной поверхностью (MB-WCX) были построены классификационные модели с использованием обоих математических алгоритмов - ГА и У НС.
При использовавшихся параметрах обработки масс-спектров в них воспроизводимо детектировали 96 пиков. После изучения вклада площадей отдельных пиков в классификационные модели 3 пика были выделены как наиболее значимые для их специфичности и чувствительности (см. Глава 2).
Для оценки достоверности построенных моделей были использованы дополнительные образцы сыворотки крови групп «аденомиоз» (14) и «контроль» (29), не использовавшиеся для построения классификационных моделей. Значения чувствительности и специфичности построенных математических моделей классификации приведены в табл. 11.
Визуальный анализ статистических диаграмм изменения площадей масс-спектрометрических пиков между различными группами образцов позволил обнаружить 3 пика, у которых, хотя и наблюдается пересечение в диапазонах изменения их площадей между группами, но пересечение это менее 50,0%, т.е. не пересекаются их 25,0% и 75,0% квантили (рис.12). Сочетания таких пиков в классификационных моделях могут давать довольно высокие значения специфичности и чувствительности, что мы и наблюдаем в данном случае.
Как видно на рис. 12, диапазоны площадей групп «аденомиоз» и «контроль» практически не пересекаются, что позволяет различать данным методом диагностики пациенток из каждой группы.
При анализе сыворотки крови 36 больных аденомиозом из I группы после оперативного лечения (удаления матки) в среднем через 6 месяцев подобных пиков обнаружено не было и данная модель была отнесена к контрольной группе.
Итоговый анализ масс-спектрометрических профилей образцов сывороток крови групп «аденомиоз» и «контроль», фракционированных с использованием магнитных микрочастиц MB-WCX, представлен на рис. 13.
Как видно на рис. 13, в построенную классификационную модель вошли 3 масс-спектрометрических пика, отобранные компьютерной программой как наиболее значимые, со значениями m/z: 1589; 2671; 4333, которые достоверно различаются в группах «аденомиоз» и «контроль».
Помимо сравнения масс-спектрометрических профилей больных аденомиозом и без него в контрольной группе, было проведено сопоставление данных, полученных от пациенток с диагнозами: миома матки (п=60), ГПЭ (п=50), рак яичников I-IV стадии (п=60), рак тела матки (п=50). Результаты профилирования больных с ГПЭ оказались неудовлетворительными, показав значения чувствительности и специфичности - менее 50,0%.
В то же время, данные полученные при протеомном профилировании сывороток крови пациенток с миомой матки, раком тела матки и раком яичников в сравнении с аденомиозом, а также с контрольной группой, продемонстрировали достоверные данные высокой чувствительности и специфичности.
Итоговый анализ масс-спектрометрических профилей образцов сывороток крови групп «миома матки» и «контроль», фракционированных с использованием магнитных микрочастиц MB-WCX, представлен на рис. 14, 15; «рак тела матки» и «контроль» на рис. 16, 17; «рак яичников» и «контроль» нарис. 18, 19.
Как видно на рис. 15, в построенную классификационную модель вошли также 3 масс-спектрометрических пиков, отобранные компьютерной программой как наиболее значимые, со значениями m/z: 2331; 1589; 1192, которые достоверно различаются в группах «миома матки» и «контроль».
Как видно на рис. 16, диапазоны площадей групп «рак тела матки» и «контроль» практически не пересекаются, что позволяет различать данным методом диагностики пациенток из каждой группы.
Как видно на рис. 17, в построенную классификационную модель вошли 4 масс-спектрометрических пика, отобранные компьютерной программой как наиболее значимые, со значениями m/z: 1896; 1967; 2021; 2931, которые достоверно различаются в группах «рак тела матки» и «контроль».
Как видно на рис. 19, в построенную классификационную модель вошли 5 масс-спектрометрических пиков, отобранные компьютерной программой как наиболее значимые, со значениями m/z: 1570; 3524; 3138; 3263; 3536, которые достоверно различаются в группах «рак тела матки» и «контроль».
При проверке специфичности построенной модели по отношению к масс-спектрометрическим профилям образцов сыворотки крови пациенток с миомой матки, раком тела матки и раком яичников были получены значения: 93,8%, 90,5%, 100,0%, соответственно (табл. 12).
Система врожденного иммунитета при аденомиозе
Определение активности ЛЭ и al-ПИ у больных аденомиозом (п=120): I группа больных «активным» аденомиозом (п=76), II группа больных «неактивным» аденомиозом (п=44); и в контрольной группе - III (п=50) проводилось спектрофотометрическим энзиматическим методом в образцах сыворотки крови с использованием набора реагентов для количественного определения активности лейкоцитарной эластазы и al-протеиназного ингибитора в сыворотке крови (ЭЛАСТАЗА), (АЛЬФА-1-ПИ) (ООО «Биофарм-тест», Москва) в соответствии с Инструкцией по применению данного набора.
Результаты исследования содержания ЛЭ в сыворотке крови представлены на рис. 20.
Обнаружена высокая активность ЛЭ у всех больных аденомиозом, при этом у больных I группы уровень ЛЭ превысил нормативные значения и был достоверно выше, чем во II группе: 329,4±5,71 нмоль/(минхмл) и 251,2±5,77 нмоль/(минхмл) (р 0,05). В III группе активность ЛЭ не превышала норму и составила в среднем - 178,1±2,59 нмоль/(минхмл).
В норме активность ЛЭ составляет 150-200 нмоль/(минхмл) - в соответствии с инструкцией к набору реагентов. Диапазон активности 201-250 нмоль/(минхмл) можно интерпретировать как слабое повышение, а диапазон 251-300 нмоль/(минхмл) - как умеренное. Повышение активности ЛЭ выше 300 нмоль/(минхмл) можно считать выраженным.
В норме неспецифический иммунитет не активирован и активность ЛЭ не повышена, что может служить подтверждением отсутствия тех или иных патологических состояний, связанных с воспалительными или деструктивными реакциями, в том числе и с аденомиозом.
У пациентов со слабым повышением активности ЛЭ возможно предположить наличие в крови (в невысокой концентрации) факторов, вызывающих активацию нейтрофилов. Такая слабая активация неспецифического иммунитета свидетельствует о наличии воспалительных деструктивных реакций. Это характерно для больных на начальной стадии аденомиоза, без выраженной клинической симптоматики.
При умеренном повышении активности ЛЭ имеет место более значительная активация неспецифического иммунитета, что является подтверждением наличия у них процесса, связанного с воспалительными реакциями. Локализация этого процесса может быть установлена при более тщательном клиническом обследовании пациента и проведении дополнительных биохимических анализов.
Слабое и умеренное повышение ЛЭ (от 202,3 до 296,2 нмоль/(минхмл) сопровождает «неактивный» аденомиоз из II группы больных.
При выраженном повышении активности ЛЭ имеет место значительная активация неспецифического иммунитета, что является отражением активно текущего патологического процесса, связанного с деструктивными воспалительными реакциями. Высокий уровень активности ЛЭ может свидетельствовать о том, что аденомиоз сопровождается воспалительным процессом, интенсивность которого коррелирует с обширностью и глубиной поражения, и, как следствие, тяжестью клинической симптоматики.
Такое повышение активности ЛЭ сопровождает тяжелый деструктивный процесс в миометрии, вызванный аденомиозом у больных из I группы.
Активность al-ПИ в норме составляет 28-32 ИЕ/мл. Наблюдаемое при повышении активности ЛЭ параллельное повышение активности al-ПИ направлено на ограничение деструктивных реакций и свидетельствует о сохранности антипротеолитического потенциала.
Снижение активности al-ПИ свидетельствует о недостаточности антипротеолитической емкости сыворотки крови и при повышении активности ЛЭ является неблагоприятным прогностическим фактором в плане дальнейшего развертывания деструктивного процесса.
При изучении функциональной активности al-ПИ была отмечена широкая вариабельность данного показателя в диапазоне 16-63 ИЕ/мл. Показано, что в тех случаях, когда повышение активности ЛЭ не сопровождалось адекватным компенсаторным ростом активности al-ПИ, патологический процесс протекал достоверно более активно - 30,75±2,48 ИЕ/мл (I группа).
С другой стороны, при значениях al-ПИ выше нормативных (более 32 ИЕ/мл) на фоне повышенной ЛЭ существует резерв антипротеолитического потенциала, блокирующий эффекты, осуществляемые эластазой и другими протеазами - у этих больных течение аденомиоза было менее агрессивное -44,29±1,81 ИЕ/мл (II группа) (р 0,05)-рис.21.
При анализе содержания ЛЭ и al-ПИ в сыворотке крови у 36 больных аденомиозом из I группы через 6 месяцев после удаления тела матки, у 31 (86,1%) пациентки данные показатели не превышали нормативные значения (р 0,05).
Как следует из данных таблицы 16, у больных аденомиозом и I, и II группы достоверно повышено содержание в сыворотке крови ЛЭ, по сравнению с III группой. Однако в I группе больных «активным» аденомиозом достоверно не хватает резерва антипротеолитического потенциала, что проявляется более выраженной клинической картиной заболевания и тяжелом течении.
По результатам исследования распределений указанных показателей были определены пороговые значения для al-ПИ так, что оба диапазона (меньше или больше порогового значения) оказались достоверно различающими две группы с активным (I) и неактивным (II) аденомиозом.
Значения исследуемых показателей выше порогового, составляют преобладающую долю пациенток в группе с неактивным аденомиозом, а значения ниже порогового значения достоверно чаще встречаются в группе с активным аденомиозом: доля пациенток с уровнем al-ПИ больше 35 ИЕ/мл составила во II группе больных 89,3%, а с уровнем al-ПИ меньше 35 ИЕ/мл - составила 87,1% в I группе больных аденомиозом (р 0,05) - табл. 17.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что выделенный диапазон al-ПИ, является высоко информативным и может рассматриваться как фактор риска активности аденомиоза, определяющий прогноз заболевания.
Похожие диссертации на Патогенез, прогнозирование и постгеномная диагностика аденомиоза
