Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современные представления о процессе имплантации и эффективности программы эко у женщин с миомой матки (обзор литературы) 8
1.1. Значение морфофункционального состояния эндометрия для имплантации 8
1.2. Влияние миомы матки и миомэктомии на эффективность программы ЭКО 20
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 30
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 41
3.1. Клинико-анамнестическая характеристика пациенток.. 41
3.2. Результаты клинико-лабораторного обследования 49
3.2.1. Оценка функционального состояния гипоталамо гипофизарно-яичниковой системы 49
3.2.2. Характеристика циклов ЭКО в исследуемых группах женщин 51
3.2.3. Морфологическая и иммуногистохимическая характеристики эндометрия 53
3.3. Эффективность программы ЭКО и влияние миомы матки на наступление беременности 70
3.4. Обсуждение результатов 78
Заключение 87
Выводы 93
Практические рекомендации 95
Список литературы
- Значение морфофункционального состояния эндометрия для имплантации
- Влияние миомы матки и миомэктомии на эффективность программы ЭКО
- Оценка функционального состояния гипоталамо гипофизарно-яичниковой системы
- Эффективность программы ЭКО и влияние миомы матки на наступление беременности
Введение к работе
Актуальность проблемы Миома матки - наиболее распространенная доброкачественная опухоль женской половой системы, которая определяется у 20-50% женщин, при этом частота ее выявления значительно увеличивается в позднем репродуктивном возрасте. Влияние миомы на фертильность - широко дискутируемая проблема, особенно в аспекте применения методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) (Адамян Л.В., 2001; Sunkara S.K., 2010).
Общепризнанно, что само наличие миомы матки далеко не всегда негативно влияет на наступление беременности (Нерсесова И.И., 2001; Home A.W., 2007). Возможными механизмами влияния миом на фертильность считаются механический эффект (сдавление устьев маточных труб, атрофия эндометрия, элонгация и расширение эндометриальных желез в области миомы), нарушение сократимости матки, дисрегуляция ангиогенеза, нарушение продукции провос-палительных цитокинов, изменение экспрессии факторов рецептивности эндометрия (Климанов А.Ю., 2012).
Попытки найти зависимость между числом, размером, суммарным объемом миоматозных узлов и частотой наступления беременности не привели к желаемым результатам. Большинство клиник придерживается внутренних протоколов подготовки пациентов с миомой матки к программам ВРТ, основанных на личном опыте, тогда как единого мнения до сих пор не сформировано (Check J.H., 2002; Hart R., 2001; Surrey E.S., 2001). На сегодняшний день общепризнанной является точка зрения о необходимости миомэктомии перед программой ЭКО при наличии субмукозных узлов, независимо от их количества, размеров, гистотипа (Eldar-Geva Т., 1998; Rackow B.W., 2010). В то же время, нет убедительных данных, позволяющих сделать вывод о влиянии интрамуральной и субсерозной миом матки на исход программ ВРТ. Результаты отдельных исследований весьма противоречивы. В связи с этим представляет интерес определение «рецептивного статуса» эндометрия при миомах различной локализации,
что, возможно, поможет придти к единому мнению относительно тактики лечения бесплодия у женщин с данной патологией.
Цель исследования: оптимизация тактики подготовки пациенток с труб-но-перитонеальным фактором бесплодия и миомой матки к программе ЭКО с учетом особенностей рецептивности эндометрия.
Задачи исследования:
1. Изучить клинико-анамнестические данные женщин с трубно-
перитонеальным фактором бесплодия и миомой матки, перенесших миомэкто
мию и без патологии миометрия.
-
Оценить морфофункциональные особенности эндометрия в период окна имплантации у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием и миомой матки, у женщин, перенесших миомэктомию, на основании изучения морфологических и иммуногистохимических маркеров рецептивности: пиноподий, эст-рогеновых и прогестероновых рецепторов, лейкемия ингибирующего фактора (LIF), сосудистого эндотелиального фактора роста A (VEGF-A), клаудина-5 (CLDN-5) в эндометриальных эпителиальных, стромальных клетках и эндотелии.
-
Провести сравнительный анализ исходов программы ЭКО в группах женщин с миомой матки, у пациенток, перенесших миомэктомию, и пациенток без патологии миометрия.
-
Уточнить показания к выполнению миомэктомии у пациенток с труб-но-перитонеальным бесплодием и миомой матки, планирующих лечение бесплодия методом ЭКО, с учетом показателей рецептивности эндометрия и кли-нико-анамнестических данных.
-
Разработать алгоритм подготовки пациенток с миомой матки к программе ЭКО.
Научная новизна Изучен патогенез нарушения рецептивности эндометрия при трубно-перитонеальном бесплодии у женщин с миомой матки и женщин после миомэктомии. На основании комплексного морфологического и
иммуногистохимического исследования эндометрия выявлены различные варианты нарушения экспрессии эстрогеновых и прогестероновых рецепторов, лей-кемия-ингибирующего фактора (LIF), сосудисто-эндотелиального фактора роста A (VEGF-A), клаудина-5 (CLDN-5) у пациенток с миомой матки и у пациенток после миомэктомии.
Проведена сравнительная оценка результативности программы ЭКО у женщин с миомой матки, перенесших миомэктомию и без патологии миомет-рия с учетом рецептивного профиля эндометрия.
Разработан дифференцированный подход к ведению женщин с миомой матки в программе ЭКО с использованием комплекса современных диагностических и лечебных методов.
Практическая значимость
В результате проведенного исследования уточнен современный алгоритм и разработаны принципы подготовки и ведения пациенток с миомой матки небольших размеров в программе ЭКО.
Проведенное исследование позволило улучшить диагностику состояния эндометрия у женщин с миомой матки перед программой ЭКО.
Внедрение современных методов диагностики позволило дифференцированно подходить к подготовке женщин с миомой матки к программе ЭКО, что в свою очередь улучшило исходы программ ВРТ.
Положения, выносимые на защиту:
-
Предикторами успешной имплантации в программе ЭКО являются высокий уровень клеток, содержащих зрелые пиноподии, высокая экспрессия ПР в строме эндометрия, высокая экспрессия LIF и VEGF-A в строме и эпителиальном слое, высокая экспрессия VEGF-A в сочетании с низкой экспрессией CLDN-5 в эндотелии сосудов эндометрия как при трубно-перитонеальном бесплодии, так и у пациенток с миомой матки и с миомэктомией в анамнезе.
-
Негативное влияние интрамуральной миомы матки на частоту наступления беременности в программе ЭКО определяется размером максимального интрамурального узла и его расположением по отношению к
границе с эндометрием и не зависит от числа и суммарного объема миоматоз-ных узлов.
3. Нарушение рецептивности эндометрия у женщин с интрамуральной миомой матки более 2,5 см в диаметре, расположенной ближе 5 мм к границе с эндометрием, в виде снижения числа клеток с развитыми пиноподиями, низкой экспрессии LIF в эпителиальном слое эндометрия в сочетании с высокой экспрессией ЭР, а также слабой экспрессии VEGF-A в эндотелии сосудов эндометрия в сочетании с выраженной экспрессией CLDN-5, может считаться предиктором неудачной попытки ЭКО и являться показанием для лапароскопической миомэктомии перед проведением программы ЭКО.
Личный вклад автора
Автор принимала непосредственное участие в выборе направления исследования, разработке цели и задач, обобщении, анализе, статистической обработки полученных результатов. Автором лично произведено обследование пациенток, пайпель-биопсия эндометрия. Автор принимала участие во всех этапах лечения методом ЭКО, в анализе гистологических препаратов.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.01.01- «акушерство и гинекология». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пункту 4 паспорта акушерства и гинекологии.
Апробация работы
Материалы исследования доложены и обсуждены на заседании межклинической конференции отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия (25 сентября 2013 года) и апробационной комиссии ФГБУ «НЦАГ и П им.акад. В.И.Кулакова» Минздрава России (7 октября 2013 года).
Внедрение результатов работы в практическое здравоохранение Результаты проведенных исследований внедрены в практику работы отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Структура и объем диссертации
Значение морфофункционального состояния эндометрия для имплантации
Практически для всех видов млекопитающих в менструальном цикле характерны две следующие закономерности: 1) возрастающая секреция эстрогенов в фазу селекции и развития фолликулов, которая в хронологическом плане лишь косвенно влияет на имплантацию; 2) выработка значительных количеств прогестерона в секреторную фазу цикла, что совпадает по времени с имплантацией. Считается, что в отличие от прогестерона эстрогены влияют на имплантацию опосредованно [20, 69, 151].
Эстрадиол выступает в качестве пермиссивного агента, тогда как прямое действие оказывают локальные, регулируемые им факторы - цитокины, молекулы адгезии, факторы роста [102]. Установлено, что для полноценной пролиферации эндометрия в течение фолликулярной фазы нормального менструального цикла необходима концентрация эстрадиола в маточном кровотоке в пределах 200—400 пг/мл при одновременном содержании прогестерона не более 4 нг/мл. Нормальная имплантация возможна при концентрации эстрадиола в сыворотке крови 50—100 пг/мл, однако уровень эстрадиола в периферической крови не всегда может являться прогностическим фактором в отношении успеха имплантации [127].
Эстрогены одновременно с пролиферацией клеток эпителия стимулируют развитие секреторного аппарата клетки и синтез рецепторов эстрогенов и прогестерона, посредством взаимодействия с которыми и осуществляется многогранное действие гормонов на клетки. Семейство стероидных рецепторов представляет собой класс белков, функционирующих преимущественно на ядерном уровне и являющихся, по существу, белками, регулирующими транскрипцию. В отсутствие лигандов стероидные рецепторы находятся в комплексе с белками теплового шока hsp90. Активация рецепторов при связывании с гормоном приводит к диссоциации комплекса рецептор - белок теплового шока и димеризации рецептора. Димер обладает способностью связываться с соответствующими, строго специфичными для стероидов последовательностями ядерной ДНК, что обеспечивает селективность в отношении каждого из них и влияние на транскрипцию генов-мишеней. Эстрадиол усиливает синтез собственных рецепторов, рецепторов прогестерона и рецепторов андрогенов [37, 98, 120].
Прогестерон не только не усиливает синтез собственных рецепторов, но, напротив, подавляет их так же, как и синтез рецепторов эстрадиола. Следовательно, количество определенного вида рецепторов зависит как от содержания соответствующего активного гормона в крови, так и от концентрации стероидов других классов [33, 109].
В настоящее время установлены а- и Р-субтипы эстрогеновых рецепторов. Первичная структура этих белков очень похожа, что позволяет предположить наличие для них общего механизма действия. Наивысший уровень экспрессии Р-рецептора обнаруживается в эпителиальных клетках эндометрия в преовуляторном периоде, а также в клетках стромы и эндотелиоцитах в позднюю секреторную фазу [51].
Экспрессия а-рецепторов максимальна в течение периовуляторного периода. Показано, что экспрессия (З-рецепторов выражена значительно в меньшей степени, за исключением поздней секреторной фазы менструального цикла. Указывается на связь Р-эстрогеновых рецепторов с активным ан-гиогенезом в этот период [108].
Известно, что прогестерон инициирует децидуализацию. В эндометри-альных клетках прогестерон оказывает действие преимущественно через активацию прогестероновых рецепторов (ПР), которые относятся к семейству ядерных рецепторов. Взаимодействие прогестерона и его рецепторов запускает специфические структурные и функциональные изменения в прогестероновых рецепторах, что провоцирует взаимодействие лиганда рецепторного комплекса с генами, регулирующими их транскрипцию. Прогестероновые рецепторы включают два различных по размеру белка из единственного гена: ПР-А и ПР-В. Прогестероновому рецептору-А недостает 164 N-терминальных аминокислот прогестеронового рецептора-В, он транскрипци-онно менее активен. ПР-А является доминантной изоформой, вовлеченной в децидуализацию hESC (человеческие эндометриальные стромальные клетки) in vivo и in vitro. У мышей отсутствие ПР-А демонстрирует нарушение деци-дуального ответа имплантирующейся бластоцисты [69].
Определение содержания эстрогеновых и прогестероновых рецепторов в эндометрии в период окна имплантации имеет важное прогностическое значение в программах ВРТ.
В эндометрии наблюдаются две морфологически идентифицируемые фазы: пролиферация и секреция. Одновременно с этим он может находиться в различных состояниях, а именно в нейтральной, рецептивной, нерецептивной или рефрактерной фазах. Наличие рецептивной и нерецептивной фазы в течение менструального цикла согласуется с гипотезой о том, что рецептив-ность эндометрия является регулируемым процессом [76].
Активация «окна имплантации» характеризуется значительными ультраструктурными изменениями в морфологии эндометриальных эпителиальных клеток [122]. Специфический морфологический маркер рецептивности эндометрия - эктоплазматические протрузии эндометриальных эпителиальных клеток или пиноподии, активность которых ограничена коротким временным периодом, соответствующим «окну имплантации» [126]. Появление пиноподии в эндометрии в середину секреторной фазы — процесс, связанный с наивысшей концентрацией прогестерона в крови. Он включает следующие стадии: развивающиеся пиноподии, полностью развитые и регрессирующие пиноподии.
Первый признак развивающихся пиноподии — появление выпячиваний на поверхности клеток, сопровождающихся редукцией микроворсинок. Их верхушки сливаются, формируя гладкую и тонкую мембрану, в результате полного исчезновения выступов. Выступы достигают максимального размера и появляется складчатость — полностью развитые пиноподии. Эта стадия длится менее 48 ч, далее выпячивания уменьшаются, маленькие верхушки микроворсинок появляются снова на мембранах, которые становятся морщинистыми, и размер клеток увеличивается — регрессирующие пиноподии [122].
Влияние миомы матки и миомэктомии на эффективность программы ЭКО
Ультразвуковое исследование выполняли на аппарате «Flex Focus 1202» (фирма «В-К Medical ApS», Дания) с использованием трансвагинального датчика с частотой 7,1 МГц, измерения проводились при опорожненном мочевом пузыре с использованием одноразового презерватива.
Всем пациенткам выполняли трансвагинальное ультразвуковое исследование матки и яичников с определением количества антральных фолликулов, наличия объемных образований в малом тазу, структуры эндометрия, величины М-эхо на 3-5 день менструального цикла, в течение исследуемого цикла для определения дня овуляции и в день выполнения пайпель-биопсии эндометрия. УЗ-мониторинг стимуляции функции яичников осуществляли на 2-3 день цикла, на 4-5 день стимуляции суперовуляции, далее ежедневно или через день до введения овуляторной дозы хорионического гонадотропина. Особое внимание уделялось росту и динамике состояния эндометрия.
Биопсию эндометрия проводили в амбулаторных условиях с соблюдением правил асептики и антисептики. Через 5-6 дней после определения дня овуляции с помощью УЗИ и мочевого теста, основанного на определении увеличения уровня лютеинизирующего гормона (ЛГ) в моче. В середине лю-теиновой фазы, под ультразвуковым контролем из матки с помощью аспира-ционной кюретки Pipelle de Cornier («Laboratorie C.C.D.», Франция) в цикле, предшествующем стимуляции суперовуляции, получали биоптат эндометрия [74, 147].
Материалы биоптатов фиксировали в 10% нейтральном формалине в течение 24 часов. После обработки образцов по стандартной общепринятой унифицированной методике их заключали в парафин. Среды толщиной 5 мкм готовили на роторных микротомах и окрашивали гематоксилином и эозином.
Исследование гистологических препаратов проводилось в световом микроскопе при увеличении от х50 до х400. Гистологические заключения формулировали в 1 патологоанатомическом отделении ФГБУ « НЦ АГ и П имени академика В.И. Кулакова Минздрава России» (руководитель проф. Е.А. Коган) в соответствии с современными стандартами, изложенными в общепринятых фундаментальных руководствах [18, 113].
Также проводилась оценка удельного веса клеток поверхностного эпителия с наличием пиноподий в световом микроскопе при увеличении х400. Структурный анализ пиноподий проводился на окрашенных парафиновых срезах с использованием светового микроскопа «CytoViva Technologies Inc.», Auburn, AL, США с использованием традиционной микроскопии с разрешением выше 100 нанометров. Такое разрешение позволяет достичь реально оптического увеличения до х 7000.
Уровни экспрессии эстрогеновых а и прогестероновых рецепторов, LIF, VEGF-A, клаудина-5 в эндометрии оценивались с помощью иммуноги-стохимических реакций в серийных парафиновых срезах. Демаскировка антигенов производилась в ретривере при 100С.
На следующем этапе все срезы промывались в дистиллированной воде и буферном растворе. Неспецифическое связывание антител блокировалось путем инкубации с 10% эмбриональной телячьей сывороткой в течение 20 минут. Затем на 1 час при комнатной температуре добавлялись монокло-нальные мышиные антитела к эстрогеновым рецепторам а, клон 1D5 (Dako, США; разведение 1:35), моноклональные мышиные антитела к прогестеро-новым рецепторам, клон 636 (Dako, США; разведение 1:50), мышиные поли-клональные антитела к LIF (R&D Systems, США; разведение 1:100), антитела моноклональные мышиные к человеческому VEGF-A, клон VG1 (Dako, США; разведение 1:100), антитела поликлональные кроличьи к клаудину 5 (Santa Cruz Biotechnology INC., США; разведение 1:200). Ставились положительные и отрицательные контроли.
Анализ результатов иммуногистохимических реакций для ЭР-а и ПР проводился с учетом количества окрашенных клеток и интенсивности окраски в поверхностном эпителии, железах и строме эндометрия, используя метод гистологического счета HISTO Score по формуле: HS = 1а+2Ь+Зс, где а - процент слабо окрашенных клеток, b - процент умеренно окрашенных клеток, с - процент выраженно окрашенных клеток, 1,2,3- интенсивность окрашивания, выраженная в баллах. Степень выраженности экспрессии ЭР и ПР оценивали: 0-10 баллов -отсутствие экспрессии, 11-100 баллов - слабая экспрессия, 101-200 баллов -умеренная экспрессия, 201-300 баллов - выраженная экспрессия. Результаты реакций для LIF оценивались по окрашиванию цитоплазмы клеток поверхностного эпителия и желез, стромы и пиноподий в эндометрии. Результаты реакций для VEGF-A оценивались по окрашиванию цитоплазмы клеток поверхностного эпителия и желез, стромы и эндотелия эндометрия. Результаты реакций для клаудина-5 оценивались по мембранному окрашиванию эпителиальных клеток и клеток эндотелия сосудов эндометрия.
Результаты реакции оценивали в баллах от 0 до 6, где отсутствие экспрессии - 0 баллов - 0% окрашенных клеток, низкая экспрессия - до 2 баллов - до 20% окрашенных клеток, средняя экспрессия - 4 балла - от 21 до 40% окрашенных клеток, высокая экспрессия - 6 баллов - более 41% окрашенных клеток.
На следующем этапе исследования было проведено 158 циклов стимуляции функции яичников в программе ЭКО и ПЭ в отделении вспомогательных технологий в лечении бесплодия ФГБУ «НЦ АГ и П имени академика В.И. Кулакова Минздрава России» (руководитель - профессор Е.А. Калинина).
Оценка функционального состояния гипоталамо гипофизарно-яичниковой системы
Частота наступления беременности в 1-ой группе женщин с миомой матки составила 23,1%), во 2-ой - у пациенток после миомэктомии - 30,2%), в группе после миомэктомии - 41,5%. При этом статистически достоверным было снижение частоты наступления беременности в группе с миомой матки по сравнению с группой без патологии миометрия.
Частота имплантации составила 11,9%, 16,2% и 23,9% соответственно. И была достоверно выше в группе без патологии миометрия, чем в группе женщин с миомой матки и после миомэктомии.
В частоте прерывания беременности (25,0%), 6,3% и 13,6% ) и эктопической беременности (8,3%), 6,3% и 0% соответственно) достоверных различий между группами выявлено не было.
Рождением живого ребенка завершились 66,1% беременностей в 1-ой группе, 87,5%) - во 2-ой и 86,4% - в 3-ей. При этом частота родов в 1-ой группе была достоверно ниже, чем в группе без патологии миометрия.
У женщин с наступившей беременностью, независимо от группы, отмечалась общая тенденция к более высокому содержанию клеток со зрелыми пиноподиями, более высокой экспрессией ПР в строме и, наоборот, менее выраженной экспрессией ЭР как в строме, так и в железах и поверхностном эпителии (табл. 26).
Количество клеток, содержащих зрелые пиноподии, было достоверно выше в подгруппе пациенток с наступившей беременностью после миомэк-томии (во 2-ой группе). Также у женщин с удачной попыткой ЭКО более высоким было содержание ПР в строме эндометрия (достоверные различия получены в группе женщин после миомэктомии и группе без патологии мио-метрия).
Более низкий уровень экспрессии ЭР в строме в подгруппах с наступившей беременностью не был подтвержден статистически. Соотношение ПР/ЭР достоверно не отличалось ни в одной из групп.
Также была выявлена общая для всех групп женщин с удачной попыткой ЭКО тенденция к более высокому содержанию у как LIF, так и VEGF во всех исследуемых участках эндометрия и в эндотелии (табл. 24). В отношении экспрессии CLDN-5 в эндотелии была выявлена обратная зависимость (экспрессия CLDN-5 была ниже у пациенток с удачной попыткой ЭКО).
У женщин с миомой матки достоверной была разница экспрессии LIF в эпителии, VEGF-A - в строме и CLDN-5 - в эндотелии. В группе пациенток после миомэктомии достоверными были изменения экспрессии VEGF и CLDN-5 в эндотелии. В группе без патологии миометрия достоверная разница была выявлена в экспрессии LIF в строме и эпителии, VEGF - в эпителии и эндотелии и CLDN-5 в эндотелии. Таким образом, единая тенденция для всех групп была выявлена в отношении более низкой экспрессии CLDN-5 в эндотелии женщин с удачной попыткой ЭКО. Кроме того, для эндотелия также были характерны более высокие концентрации VEGF в группе после миомэктомии и в группе без патологии миометрия. Сходная, достоверно более высокая концентрация LIF была определена в эпителии женщин с миомой матки и в группе без патологии миометрия.
Таблица 24 Сравнительная оценка % клеток с пиноподиями, эспрессии эстрогеновых и прогестероновых рецепторов эндометрия относительно исходов попытки ЭКО и ПЭ 1 Оцениваемый показатель, M±sd, баллов I группаМиома матки(п = 52) II группаМиомэктомия(п = 53) III группаБез патологии миометрия(п = 53) Наступившая беременность п=12 Не наступившая беременность п=40 Наступившая беременность п=16 Не наступившая беременность п=37 Наступившая беременность п=22 Не наступившая беременность п=31 1 % клеток с развитыми пиноподиями 31,3±13,2 21,0±16,9 27,5±13,9 15,0 14,7 34,5±15,9 31,8±13,7 ПР строма, H-score, баллы 160,0±40,2 144,8±41,8 185,6±33,9 154,3±57,3 170,5±28,9 148,8±48,9 ПР эпит/жел, H-score, баллы 130,8±57,9 138,6±52,1 140,3±67,7 151,2±68,1 135,3±73,3 147,3±57,6 ЭР строма, H-score, баллы 45,8±31,7 50,7±26,6 59,4±30,2 61,4±36,9 68,0±47,7 71,5±63,9 ЭР эпит/жел, H-score, баллы 75,8±36,5 96,6±54,9 86,9±49,5 91,4±56,6 96,5±56,2 100,6±68,7 Соотношение рец., ПРстр/ЭРстр. 4,1±1,8 4,0±2,3 3,9±2,1 3,2±1,7 3,3±1,2 3,1±1,5 р 0,05 - статистически достоверные различия, сравнение внутри каждой группы (т-тест или тест Манна-Уитни) Таблица 25 Сравнительная оценка экспрессии LIF, VEGF-A, CLDN-5 в эндометрии относительно исходов попытки ЭКО и ПЭ 1 Оцениваемый показатель, М±Бс1,баллов I группаМиома матки(п = 52) II группаМиомэктомия(п = 53) III группаБез патологии миометрия(п = 53)
Наступившаябеременностьп=12 Не наступившая беременность п=40 Наступившаябеременностьп=16 Не наступившая беременностьп=37 Наступившая беременностьп=22 Не наступившая беременность п=31 р 0,05 - статистически достоверные различия, сравнение внутри каждой группы (тест Манна-Уитни) Поскольку пациенткам с миомой матки в данном исследовании уделялось особое внимание, нами был проведен углубленный анализ зависимости результатов ЭКО от сопутствующих факторов в первой группе.
Эффективность программы ЭКО и влияние миомы матки на наступление беременности
Высокая частота распространенности миомы матки, дискутабельность проблемы ее влияния на фертильность, особенно при применении вспомогательных репродуктивных технологий, недостаточность и противоречивость данных о влиянии интрамуральной и субсерозной миом на исход программ ВРТ определили актуальность темы нашего исследования, целью которого явилась оптимизация тактики подготовки пациенток с трубно-перитонеальным фактором бесплодия и миомой матки к программе ЭКО с учетом особенностей рецептивности эндометрия.
Изучение доступной нам литературы показало, что на сегодняшний день нет ясного представления о влиянии миомы матки на морфофункцио-нальное состояние эндометрия у женщин с бесплодием. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что миома матки опосредованно, через изменение процессов ангиогенеза и трофики тканей, может оказывать негативное влияние на рецептивность эндометрия и, тем самым, на исход программ ВРТ. Несколько полнее исследована роль субмукозных миом и доказано их влияние на рецептивность эндометрия, чем обусловлены рекомендации об обязательном удалении таких узлов до планирования беременности. Влияние интер-стициальных и интерстициально-субсерозных миом требует дальнейшего изучения с позиции исследования морфологических и биохимических маркеров рецептивности эндометрия, выявления новых местных регуляторных молекул, задействованных в реализации репродуктивной функции.
В нашем исследовании мы опирались на опыт ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава России, согласно рекомендациям которого размер интерстици-ального или субсерозного миоматозного узла 4 см и более является показанием для миомэктомии перед программой ЭКО.
В соответствии целью и задачами исследования были сформированы три группы пациенток: 52 женщины с интрамуральной (или интрамуральной в сочетании с субсерозной) миомой до 4 см без деформации полости матки; 53 женщины, перенесших миомэктомию без вскрытия полости матки не менее чем за 6 месяцев до начала лечения бесплодия методом ЭКО; 53 женщины с трубно-перитонеальным бесплодием без патологии миометрия.
Все пациентки были в возрасте от 18 до 45 лет, имели регулярный менструальный цикл, страдали первичным или вторичным бесплодием трубного происхождения, не имели противопоказаний к проведению ЭКО и вынашиванию беременности.
Критериями исключения пациенток из исследования явились: бесплодие, обусловленное мужским фактором, отсутствием овуляции или неуточ-ненного генеза, наружный и внутренний генитальный эндометриоз, субму-козное расположение миоматозного узла, интерстициальные миоматозные узлы с центрипетальным ростом, деформирующие полость матки, интерсти-циальный или субсерозный узел более 4 см в диаметре, шеечное и перешеечное расположение миоматозных узлов, мено-метроррагии, выраженный болевой синдром, период после миомэктомии менее 6 месяцев, полипы и гиперплазия эндометрия, внутриматочные синехии, перегородки, пороки развития, кистозные образования яичников, сочетание миомы матки и бесплодия с другой гинекологической патологией, тяжелые соматические и эндокринные заболевания.
В исследовании применялись общеклинические и специальные методы обследования.
Также проводилась оценка удельного веса клеток поверхностного эпителия с наличием пиноподий и структурный анализ пиноподий. С помощью иммуногистохимических реакций в серийных парафиновых срезах оценивался уровень экспрессии эстрогеновых а и прогестероновых рецепторов, LIF, VEGF-A, клаудина-5 в эндометрии.
На следующем этапе исследования было проведено 158 циклов стимуляции функции яичников по «короткому» протоколу с рФСГ и антГнРГ в отделении вспомогательных технологий в лечении бесплодия ФГБУ «НЦ АГ и П имени академика В.И. Кулакова Минздрава России» (руководитель -д.м.н. Е.А. Калинина).
Статистическую обработку данных проводили методами математической статистики, принятыми в медицинских и биологических исследованиях с использованием компьютерной программы Statistica 10.
Анализ клинико-анамнестических данных обследуемых пациенток показал, что длительность бесплодия составляла в среднем 4,1±1,9 лет и статистически достоверно между исследуемыми группами не различалась. Частота первичного и вторичного бесплодия составила 37,3% и 62,7% соответственно. Более чем у каждой второй пациентки (57,9%) с вторичным бесплодием в анамнезе отмечены искусственные аборты. Самопроизвольные аборты в анамнезе имели 19,3% женщин, внематочную беременность - 36,8%.
Характерным для менструальных циклов большинства обследуемых пациенток было своевременное менархе (в 74,7% случаев) и регулярный менструальный цикл на момент обследования (в 100% случаев). Пациентки с миомой матки чаще отмечали более длительные, обильные и болезненные, по сравнению с двумя другими группами женщин, менструации.
Наиболее часто диагностируемыми гинекологическими заболеваниями явились: хронический сальпингоофорит (55%), ИППП (35,4%), патология эндометрия (20,9%) и заболеваний шейки матки (19%).
Выявлена высокая частота лапароскопических вмешательств на органах малого таза. Диагностическая гистероскопия составила 63,9%.
В группе пациенток без патологии миометрия по сравнению с двумя другими отмечена меньшая частота искусственных абортов, но в то же время более высокая встречаемость случаев внематочной беременности, диагностической лапароскопии и операций на яичниках.
Более половины женщин (51,3%) имели одну и более неудачных попыток ЭКО в анамнезе, 12% пациенток - 3 и более. На 2 попытки ЭКО в анамнезе чаще указывали пациентки с миомой, на 3 и более - пациентки, перенесшие миомэктомию. При клинико-лабораторном обследовании проведено исследование функционального состояния гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы, которое не выявило отклонений от нормальных значений ни в одной из групп пациенток.
Значимых различий между группами пациенток в отношении параметров фолликулогенеза, оогенеза и раннего эмбриогенеза также не было выявлено.
При морфологическом исследовании эндометрия среднее количество клеток с развитыми пиноподиями в группе женщин с миомой матки и в группе женщин, перенесших миомэктомию, было достоверно ниже, чем в группе без патологии миометрия. В то же время, у женщин с наступившей беременностью, независимо от группы, отмечалась общая тенденция к более высокому содержанию клеток со зрелыми пиноподиями, которая была достоверной в подгруппе пациенток после миомэктомии (во 2-ой группе).
Изучение рецепторной активности эндометрия не выявило значимых различий в экспрессии ЭР и ПР в строме, поверхностном эпителии и железах, за исключением достоверно более высоких значений экспрессии ПР в строме в группе женщин после миомэктомии. Соотношение ПР/ЭР также достоверно не отличалось ни в одной из групп.
Полученные нами данные, с одной стороны, свидетельствуют о более благоприятных изменениях стромальной экспрессии рецепторов прогестерона у женщин после миомэктомии, а с другой - об общности рецепторной активности у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием, вне зависимости от сопутствующей патологии миометрия.
Изучение молекулярных маркеров рецептивности показало, что в группе с миомой матки по сравнению с контролем экспрессия LIF и VEGF-A во всех исследуемых тканевых структурах была достоверно ниже, a CLDN-5 — выше.
У женщин с наступившей беременностью в программе ЭКО независимо от группы отмечалась общая тенденция к более высокой экспрессии LIF. При этом у женщин с миомой матки была выявлена более достоверно высокая экспрессия LIF в эпителии, существенное снижение экспрессии VEGF-A в строме и поверхностном эпителии/железах эндометрия
Полученные нами различия в экспрессии маркеров рецептивности были соотнесены с характеристиками интрамурального миоматозного узла у женщин 1-ой группы. Были получены достоверные различия экспрессии ЭР и LIF в эпителии и железах эндометрия, VEGF-A и CLDN-5 в эндотелии сосудов эндометрия при расположении интрамурального узла более 2 см в диаметре ближе 5 мм к границе с эндометрием.
Результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод о влиянии расположения и размеров миоматозного узла на выраженность экспрессии целого ряда молекул рецептивности. При этом в эндометрии изменяются не только показатели ангиогенеза и проницаемости сосудистой стенки (VEGF, CLDN-5), подавление экспрессии LIF, но и выявляется гиперэкспрессия ЭР в строме, которая может играть важную роль в неудачной имплантации.
Полученные нами данные свидетельствуют о негативном влиянии ин-трамуральной миомы матки (или сочетания интрамуральной и субсерозной миом) на частоту наступления беременности, имплантации и родов в программе ЭКО. В то же время, наличие миомы матки не влияло существенным образом на частоту самопроизвольного прерывания беременности и эктопической беременности.
При этом нами было выявлено значимое влияние размера максимального интрамурального узла и его расположения по отношению к эндометрию. Показатели успешной имплантации достоверно отличались при размерах максимального интрамурального узла более 2,5 см и его расположении ближе 5 мм к границе с эндометрием. В то же время, нами не было выявлено достоверных различий в частоте имплантации в зависимости от числа мио-матозных узлов и их суммарного объема. Возможным объяснением этому может служить сочетанныи характер поражения миометрия с наличием не только интрамуральных, но и субсерозных узлов, число и суммарный объем которых могли существенно повлиять на статистические расчеты.
Таким образом, подтвержденное нами достоверное снижение частоты имплантации в группах с миомой матки и после миомэктомии может быть объяснено нарушением рецептивности эндометрия. При этом достоверные различия количества зрелых пиноподий, экспрессии ЭР, LIF, VEGF и CLDN-5 были выявлены как у пациенток с миомой матки, так и у женщин, перенесших миомэктомию (по сравнению с пациентками без патологии миометрия).
Эндометрий женщин с неудачной попыткой ЭКО независимо от сопутствующей патологии миометрия характеризуется более высоким содержанием клеток со зрелыми пиноподиями, более высокой экспрессией ПР в строме и, наоборот, менее выраженной экспрессией ЭР как в строме, так и в железах и поверхностном эпителии. Также характерной является более высокая экспрессия LIF и VEGF во всех исследуемых участках эндометрия и в эндотелии, и более низкая экспрессия CLDN-5 в эндотелии.
Среди женщин с интрамуральной миомой матки наиболее выраженные изменения рецептивности эндометрия выявлены при размере основного узла более 2,5 см и его расположении ближе 5 мм к эндометрию. При этом отмечается гиперэкспрессия ЭР в строме эндометрия, снижается уровень LIF в эпителии и железах, снижается экспрессия VEGF и возрастает экспрессия CLDN-5 в эндотелии сосудов.
Изучение молекулярных механизмов влияния миомы матки на репродуктивную функцию может играть решающую роль в определении тактики подготовки пациенток с данной патологией к программам ВРТ. Лучшее понимание механизмов, лежащих в основе рецептивности и имплантации, позволит клиницистам путем коррекции соответствующих причин бесплодия прийти к широкому внедрению переноса одного эмбриона, что снизит частоту материнских и перинатальных осложнений, связанных с многоплодной беременностью. Этот факт будет иметь не только медицинское, но и социальное, и экономическое значение.
