Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 10
1.1. Значение эндотелиоза в развитии гестоза 10
1.2. Патогенетические аспекты механизмов острого эндотелиоза с участием адгезивных молекул во время беременности, осложненной развитием гестоза 19
1.3. Гематоэнцефалический барьер: строение, роль и функции в организме 24
1.4. Нейроспецифические белки как маркеры нарушения резистентности гематоэнцефалического барьера 27
1.5. Профилактика и лечение гестоза :30
1.6. Состояние гематоэнцефалического барьера при гестозе 36
Глава 2. Материалы и методы исследования 40
2.1. Клиническая характеристика обследуемых женщин 40
2.1.1. Исследование: первый этап 40
2.1.2. Исследование: второй этап 57
2.2. Общее обследование 80
2.3. Специальные методы исследования 81
2.3.1. Иммунохимическое исследование 81
2.3.2. Методы статистического анализа 87
Глава 3. Результаты собственных исследований 89
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 122
Выводы 142
Практические рекомендации 144
Список литературы 145
- Значение эндотелиоза в развитии гестоза
- Патогенетические аспекты механизмов острого эндотелиоза с участием адгезивных молекул во время беременности, осложненной развитием гестоза
- Клиническая характеристика обследуемых женщин
- Иммунохимическое исследование
Введение к работе
Основными задачами акушерства являются создание оптимальных условий для осуществления женщиной функции материнства, сохранения ее здоровья и обеспечение рождения здорового потомства. Ведущая роль гестоза среди причин неблагоприятных перинатальных исходов определила характер всестороннего изучения этой проблемы.
По данным различных авторов частота гестоза колеблется от 1,4 % до 23,2%, а в специализированных стационарах высокого риска частота гестоза достигает 28-30% и не имеет тенденции к снижению [2, 60, 91, 99, 105, 108, 109, 114]. Гестоз по-прежнему остается одной из ведущих причин материнской смертности в России, занимая в различные годы 1-2-3-е место наряду с абортами и кровотечениями [38, 45, 39, 60, 77, 89, 114, 127]. В Москве МС от гестоза и его осложнений занимает одно из первых мест, составляя от 17 до 28% в год [38, 39, 45, 77].
Гестоз является основной причиной заболеваемости новорожденных (640 -780%о) и перинатальной смертности (18 - 30%о) [2, 91, 99]. По данным ВОЗ, у каждого пятого ребенка, родившегося от матери с гестозом, в определенной степени нарушено физическое и психоэмоциональное развитие, значительно выше уровень заболеваемости в младенческом и раннем детском возрасте [60].
Не всегда выраженность отеков, протеинурии и артериальной гипер-тензии отражает истинную тяжесть патологических процессов при гестозе. Анализируя данные зарубежной литературы, в 15-25% случаев при тяжелой преэклампсии и эклампсии, развитие судорожного синдрома прослеживалось на фоне умеренной гипертензии у каждой пятой пациентки [279, 280].
По данным мировой литературы, причиной множественных и разнообразных симптомов гестоза является системная активация эндотелия сосудов [49, 84, 89, 95, 99, 100, 107, 78, 97, 139, 147, 149, 163, 188, 204, 210, 221, 234, 237, 243, 274, 281, 283, 299]. При гестозе происходит иммунокомплексное
6 повреждение сосудов плаценты и жизненно важных органов, в том числе головного мозга, с развитием системного провоспалительного ответа [74, 79, 99, 154, 171, 188, 281, 297]. Актуален поиск чувствительных методов определения причин эндотелиальной дисфункции, учитывая её важную роль в гене-зе сосудистых нарушений у беременных, с целью прогнозирования и оценки степени тяжести гестоза.
Клинические проявления гестоза развиваются во второй половине беременности, после 22 недель. Время возникновения гестоза совпадает со стадией интенсивного роста и морфологического обособления высших структур головного мозга плода. Усложнение структурной организации мозга сопровождается интенсивным синтезом нейроспецифических белков. Так как по-давляющее большинство нейроспецифических белков обладают свойствами антигенов, любые нарушения проницаемости ГЭБ могут привести к выходу НСБ в кровеносное русло и запуску иммунологических нарушений с поражением эндотелиальных клеток сосудов (острый сосудистый эндотелиоз).
По мнению Караганова Я.Л. и зарубежных исследователей - Ara J., Ro- к mero R., Haller H., эндотелиоз сопровождается возникновением дезорганизации в лейкоцитарно-лимфоцитарного комплексе с повреждением эндотелия сосудов, сопровождаясь увеличением циркулирующих в крови эндотелиоци-тов и молекул клеточной адгезии (VCAM) [54, 135, 199, 191]. Молекулы клеточной адгезии обеспечивают лейкоцитарно - эндотелиальное взаимодействие. Растворимые формы этих молекул (sVCAM) обнаруживаются в плазме крови, и их концентрация служит показателем активации эндотелиальных клеток при гестозе.
Учитывая патоморфологические изменения в ткани головного мозга женщин и их плодов, погибших от тяжелых форм гестоза и его осложнений, неврологические симптомы, возникающие у беременных при нарастании тяжести гестоза и развитии эклампсии, гипоксически-ишемическое поражение ЦНС плода и новорожденного при наличии гестоза у матери, развитие эндотелиальной дисфункции у плодов пациенток с преэклампсией, а также сроки
возникновения гестоза (вторая половина беременности), совпадающие по времени с развитием ЦНС плода, назрела необходимость изучения маркера эндотелиоза VCAM и маркеров нарушения проницаемости ГЭБ на основании иммунохимического анализа НСБ - NSE (нейроспецифической енолазы), GFAP (глиофибриллярного-кислого протеина) в сыворотке крови беременных с гестозом. NSE является маркером повреждения зрелых дифференцированных нейронов, a GFAP - астроцитов [3, 13, 33, 92, 119, 120, 121, 122].
Цель исследования Целью исследования является клиническая оценка маркеров эндотели-альной дисфункции у пациенток с гестозом разной степени тяжести.
Для достижения цели исследования поставлены следующие задачи:
Провести клиническую оценку развития гестоза у пациенток с факторами риска в сопоставлении с содержанием в сыворотке крови НСБ (NSE и GFAP) и VCAM в сравнении с показателями у здоровых небеременных и здоровых женщин с физиологически протекающей беременностью.
Исследовать диагностическую и прогностическую значимость определения VCAM, НСБ (NSE и GFAP) у беременных в различные сроки беременности (18-40 недель).
Выявить корреляционную связь между концентрацией VCAM, NSE и GFAP в сыворотке крови беременных с гестозом разной степени тяжести и клинико-лабораторными данными, исходами беременности и родов.
Провести ретроспективный анализ эффективности комплексной терапии гестоза, с применением количественного динамического исследования VCAM, NSE, GFAP.
Научная новизна Доказано отсутствие у здоровых небеременных и здоровых беременных женщин клинических признаков и лабораторных критериев активации эндотелия. Установлено отсутствие достоверной разницы в концентрации VCAM
в сыворотке крови здоровых небеременных и здоровых женщин с физиологически протекающей беременностью.
Доказана прогностическая значимость повышения концентрации VCAM, NSE и GFAP в сыворотке крови беременных при прогнозировании возникновения гестоза: появление клинических признаков гестоза и повышения уровней VCAM, NSE и GFAP находятся в соответствии с нарастанием степени тяжести гестоза.
Выявлена прямая корреляционная связь между повышением уровней VCAM и уровнями НСБ (NSE и GFAP) в сыворотке крови матери при гесто-зе, что свидетельствует о наличии прямых причинно-следственных связей иммунного повреждения эндотелиоцитов матери в период интенсивного развития ЦНС плода (вторая половина гестации).
Практическая значимость
Исследование VCAM, NSE и GFAP в сыворотке крови беременных группы риска по развитию гестоза позволяет своевременно диагностировать возникновение этого осложнения, выработать тактику ведения беременности и терапию, а также прогнозировать степень его тяжести, что наблюдается при повышении содержания VCAM, NSE и GFAP выше нормативных значений.
Основными критериями тяжелого гестоза, при котором определяются максимальные уровни VCAM, NSE и GFAP, являются: манифестация гестоза до 30 - 34 недель беременности, длительность его течения свыше 6 недель и более, максимальная выраженность хотя бы одного из клинических симптомов гестоза (отеки, протеинурия, гипертензия), наличие фетоплацентарной недостаточности.
Понимание гестоза как иммунокомлексного повреждения эндотелия сосудов системы микроциркуляции позволяет применить новые методы диагностики, профилактики гестоза, оценить эффективность лечения, решить вопрос о возможности пролонгирования беременности, более точно оценить степень тяжести гестоза.
Основные положения, выносимые на защиту
У здоровых небеременных и беременных женщин с физиологически протекающей беременностью концентрации VCAM, NSE и GFAP в сыворотке крови не превышают установленных нормативных показателей, вне зависимости от возраста и срока беременности.
Повышение концентраций VCAM, NSE и GFAP в сыворотке крови беременных с высокой вероятностью позволяет прогнозировать развитие гестоза за 1 - 2 недели до его клинической манифестации.
Клинико-лабораторные признаки далеко не всегда отражают степень тяжести гестоза, тогда как маркеры активации эндотелия достоверно указывают на его возникновение. Количественное определение уровней VCAM, NSE и GFAP методом ИФА в сыворотке крови беременных позволяет оценить степень тяжести гестоза, независимо от типичного или атипичного его течения.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 16-20 апреля 2007г.; заседании Бюро ОКМ РАМН 26 апреля 2007 г; IX Всероссийском научном форуме "Мать и дитя", Москва, 2-5октября 2007 г.; региональном форуме «Мать и дитя» (Сочи, 2008).
Структура и объем диссертации Структура диссертации традиционна, ее текст изложен на 175 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 2 глав, посвященных материалам и методам исследования и результатам собственных данных, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Библиография включает 131 отечественного и 170 иностранных авторов. Текст диссертации проиллюстрирован 51 таблицей, 16 рисунками.
Значение эндотелиоза в развитии гестоза
Значение эндотелиоза в развитии гестоза Гестоз представляет собой симптомокомплекс полиорганной недостаточности, клинически манифестирующий с 22-24-й недели беременности, связанный с наличием живого плода и плаценты [99, 52, 76, 244, 268, 279, 280, 297]. Это осложнение, второй половины беременности, для которого характерен генерализованный сосудистый спазм, активация коагуляционной системы, агрегация тромбоцитов, эндотелиальная дисфункция и нарушение перфузии жизненно важных органов и плаценты. [55, 63, 64, 66, 99, 170]. Гестоз имеет прогрессирующее течение, которое может носить медленный (компенсированный, легкое течение), быстрый (субкомпенсированный, средней тяжести) и декомпенсированный (тяжелый) характер. Классическими осложнениями гестоза являются острая почечная и печеночная недостаточность, дыхательная недостаточность, отслойка сетчатки, преждевременная отслойка плаценты, HELLP-синдром, острый жировой гепатоз беременных, кровоизлияние в мозг, мозговая кома. У первобеременных гестоз развивается в 15 раз чаще, чем у повторнобеременных, а наличие его в предыдущей беременности увеличивает риск развития в дальнейшем на 7-13% [161, 173, 227].
Причины развития гестоза до конца не изучены. Среди факторов риска развития гестоза ведущее место принадлежит экстрагенитальным заболеваниям. При этом основное значение имеют артериальная гипертензия, эндокринная патология (сахарный диабет, ожирение, дислипидемия), заболевания печени и почек, аутоиммунные заболевания, тромбофилии. К другим факторам риска развития гестоза относят инфекции у матери, многоплодная беременность, наследственная отягощенность (гестоз у матери), неблагоприятные социальные и бытовые условия, наличие гестоза, перинатальной заболеваемости и смертности во время предыдущей беременности [71, 93, 142, 151, 185,201,222].
Патогенез гестоза может различаться у женщин с разными заболеваниями и практически здоровых, при многоплодной и одноплодной беременности, при наличии гестоза в предыдущей беременности.
На основании данных мировой литературы можно выделить несколько основных этиологических факторов, вовлеченных в развитие гестоза во время беременности [244, 269, 270, 279, 280, 297]: иммунологическая дизадапта-ция, плацентарная ишемия, генетическая предрасположенность и оксидант-ный стресс. Большинство авторов считают, что при гестозе имеет место сочетание этих факторов, приводящее к повреждению и нарушению функций эндотелия, развитию системного воспалительного ответа [49, 84, 89, 95, 107, 78, 97, 139, 147, 149, 163, 188, 210, 221, 234, 237, 274, 281, 283, 287, 299].
Согласно теории плацентарной ишемии, гестоз начинается с неспособности спиральных артерий адекватно расширяться в ответ на повышенные потребности в кровоснабжении плода и плаценты по мере прогрессирования беременности [38, 61, 76, 137, 140, 163, 154, 165, 166, 178, 191, 193, 217, 241, 249, 279, 297]. При этом инвазия трофобласта и последующее ремоделирова-ние маточно-плацентарных артерий, являются неполноценными: диаметр спиральных артерий составляет лишь 30-40 % необходимой величины для физиологического течения беременности [76].
Описаны две волны инвазии в плацентарное ложе матки интерстици-ального и эндоваскулярного цитотрофобласта. В процессе первой волны, которая начинается с 5-6 недель беременности, происходит гестационная перестройка эндометриальных сегментов спиральных артерий, а в процессе второй - перестройка и миометральных сегментов (в 14-18 недель). Данные изменения приводят к 5-8-кратному расширению диаметра этих сосудов, потере их способности реагировать на материнские вазомоторные стимулы, что позволяет существенно увеличить приток крови к развивающемуся плоду и плаценте [281]. При физиологически протекающей беременности частью нормального развития трофобласта является процесс апоптоза, при этом в кровотоке беременной может определяться незначительное количество апоп-
тотических микрофрагментов синцитиотрофобласта, внеклеточной эмбриональной ДНК и цитоплазматических белков (например, белка цитоскелета трофобласта цитокератина) [188, 190, 234, 243, 262, 274, 285]. При гестозе происходит снижение плацентарной перфузии, приводящее к образованию реактивных соединений кислорода, свободных радикалов, активации пере-кисного окисления липидов, оксидантному стрессу [22, 25, 42]. На фоне гес-тоза установлено повышение активности процессов апоптоза в плаценте и появление значительного количества микрофрагментов синцитиотрофобласта в крови беременных [190, 208, 211, 223, 235, 238, 262, 274]. Оксидантный стресс, возникающий при гестозе, как один из наиболее частых индукторов апоптоза, еще более стимулирует плацентарный апоптоз и некроз [167, 188, 208,211,212,288].
Нарушение процесса инвазии цитотрофобласта с развитием ишемии плаценты рассматривается как предрасполагающий фактор, так как отсутствует корреляция между материнскими и плодовыми проявлениями данного осложнения беременности [149, 210, 279]. В своих исследованиях зарубеж- / ные авторы только в 40 - 50% при умеренной преэклампсии и в 71 - 75 % при тяжелой преэклампсии, обнаружили отсутствие инвазии цитотрофобласта в миометральные сегменты спиральных артерий, а у здоровых беременных без гестоза в 13 - 20% инвазия трофобласта не отмечалась [137, 196].
Согласно гипотезе окислительного напряжения, оксидантный стресс, возникающий в ишемизированной плаценте, передается в системную циркуляцию матери, приводящий к повреждению эндотелия всех сосудов микроциркуляции и развитию эндотелиальной дисфункции, характерной для гестоза [44, 54, 56, 57, 86, 99, 100].
Патогенетические аспекты механизмов острого эндотелиоза с участием адгезивных молекул во время беременности, осложненной развитием гестоза
Важным достижением является признание большинством ученых в мире, что в основе развития клинических проявлений гестоза лежит генерализованное повреждение эндотелия сосудов. Повреждение эндотелия является частью системной воспалительной реакции, при которой происходят активация моноцитов, гранулоцитов и лейкоцитов, компонентов комплемента, системы свертывания крови, избыточная экспрессия молекул адгезии, повышенный выброс в кровоток провоспалительных цитокинов [127, 147, 149, 163, 190, 204, 210, 221, 235, 237, 244, 268, 272, 279, 281, 283, 297, 299].
Эндотелиоциты представляют собой метаболически активные клетки [79], участвующие в синтезе и метаболизме вазоактивных веществ (эндоте-линов, простагландинов Е2 и F2L, оксида азота); захвате и инактивации аце-тилхолина, катехоламинов, брадикинина, серотонина, гистамина и гепарина; выработке таких стимуляторов, как фактор роста сосудистого эндотелия [VEGF], щелочной фактор роста фибробластов [bFGF], фактор роста тромбоцитов [PDGF]; секреции цитокинов, регулирующих кроветворение, пролифе рацию и дифференцировку Т - и В-лимфоцитов; синтез компонентов базаль-ной мембраны [261].
Развитие гестоза связано с развитием системного воспалительного ответа [153, 152], основным элементом которого является дисфункция эндотелия (активизированный эндотелий)[157, 192, 200, 202, 258, 264, 266, 278]. Материнский системный воспалительный ответ характерен и для здоровых беременных в третьем триместре, но менее выраженный, чем при гестозе [190, 262,279,291].
Эндотелиальная дисфункция - это неадекватное образование в эндотелии различных биологически активных веществ, приводящих к изменению гомеостаза в организме [164, 189]. Среди факторов, выработка которых повышается при эндотелиальной дисфункции, и значимых для развития клинической картины гестоза ведущими являются простагландиныР2) тромбоксан, молекулы клеточной адгезии [189].
По мнению Караганова Я.Л. и зарубежных исследователей - Ara J., Romero R., Haller H., эндотелиоз сопровождается возникновением дезорганизации в лейкоцитарно-лимфоцитарном комплексе с повреждением эндотелия сосудов и увеличением циркулирующих в крови эндотелиоцитов, молекул клеточной адгезии [54, 135, 199].
Важная роль в повреждении эндотелия отводится продуцируемому эндотелием сосудов плаценты фактору некроза опухолей, содержание которого в крови при гестозе повышено [172]. Существенное значение в развитии дисфункции эндотелия при гестозе могут иметь и нейтрофилъные лейкоциты, способствующие активации тромбоцитарноэндотелиалъного и тромбоцитар-но-тромбоцитарного взаимодействия [227]. Многие маркеры эндотелиальной дисфункции принимают участие в формировании тромбогенного потенциала и тромборезистентности сосудов. При гестозе нарушается целостность эндотелиальной выстилки микрососудов, обнажаются субэндотелиальные структуры, что инициирует адгезию и агрегацию тромбоцитов и тромбогенез.
Таким образом, в основе развития гестоза лежит острое повреждение эндотелия сосудов (эндотелиоз), что отражается на активности и концентрации в сыворотке крови факторов, являющихся своеобразными маркерами «эндотелиальной дисфункции». К числу таких факторов относят тромбоксан А2, фактор Виллебранда, простациклин, тромбомодуллин, фибронектин, эндотелий-зависимый сосудорасширяющий фактор (оксид азота), тканевой активатор плазминогена и его ингибиторы, молекулы клеточной адгезии (Е-селектин, VCAM, ICAM, РЕСАМ-1), циркулирующие клетки эндотелия [78, 93, 95, 111, 138, 139, 151, 154, 166, 171, 190, 240, 243, 250, 261, 267, 289, 295, 296].
Результатом острого сосудистого эндотелиоза является повышение сосудистой (капиллярной) проницаемости при помощи индукции экспрессии молекул адгезии клеток сосудов (VCAM-vascular-cell adhesion molecules) [225]. Интактные эндотелиальные клетки обладают антиадгезивными и анти-коагуляционными свойствами, не экспрессируют молекулы адгезии [261], регулируют проницаемость сосудистой стенки, моделируя эффект агонистов вазоконстрикторов на сосудистую стенку [261]. «Активированные» эндотелиальные клетки индуцируют экспресию адгезивных молекул-ІСАМ и VCAM [225]. Отмечен стимулирующий эффект IL-1 и aNF на экспрессию эндотелиоцитами молекул клеточной адгезии (Е-селектина, ICAM, VCAM), активирующих адгезию лимфоцитов и моноцитов, облегчая их проникновение через ГЭБ [293]. Повышение адгезивности имеет большое значение в патогенезе дисфункции эндотелия. Миграция клеток - это сложный процесс, в котором на разных стадиях принимают участие несколько наборов молекул адгезии. Увеличение концентрации последних на поверхности эндотелиаль-ных клеток наблюдается при гестозе [225]. Циркулирующие лейкоциты обычно вступают лишь в мимолетные контакты с эндотелиальными клетками - фаза роллинга (прокатывания лейкоцитов вдоль эндотелия). Лейкоциты как бы «скользят» по поверхности эндотелия сосудистой стенки. Эта фаза обеспечивается взаимодействием вначале Р-, а затем L- и Е-селектинов с углеводными компонентами мембран клеток [146].
Клиническая характеристика обследуемых женщин
В соответствии с целями и задачами проведено обследование 106 женщин с гестозом разной степени тяжести (основная группа). Из них проспективный анализ произведен у 68 беременных женщин с развившимся гестозом разной степени тяжести и 38 беременных женщин с факторами риска, у которых впоследствии развился гестоз. Сформированы контрольная группа из 25 здоровых беременных с физиологически протекающей беременностью и группа из 20 здоровых небеременных женщин репродуктивного возраста (для исключения влияния беременности на уровень VCAM, NSE, GFAP). 2.1. Клиническая характеристика обследуемых женщин 2.1.1. Первый этап исследования Проведено проспективное обследование 50 беременных группы риска по развитию гестоза в сроки от 12 до 41 недель беременности. Целью исследования явилось проведение анализа уровней VCAM, NSE, GFAP у здоровых беременных с физиологически протекающей беременностью, здоровых небеременных и определение прогностической значимости повышения уровней VCAM, NSE, GFAP в сыворотке крови беременных в развитии гестоза. Исследование проводилось на базе клинического родильного дома № 11 (главный врач Т.З. Овешникова) и на базе перинатального центра №1 (главный врач - Леонова И.П. заслуженный врач России ).
Из 50 беременных выборочную совокупность составили 40 пациенток с повышенными уровнями VCAM, NSE, GFAP в сыворотке крови. Все пациентки прослежены до родов, оценены особенности течения беременности, способы родоразрешения и перинатальные исходы.
Для изучения уровней VCAM, NSE, GFAP в норме сформированы: контрольная группа из 25 здоровых беременных с физиологически протекающей беременностью и группа из 20 здоровых небеременных женщин репродуктивного возраста (для исключения влияния беременности на уровень VCAM, NSE и GFAP).
Критерии включения беременных в группу риска по развитию гестоза: отсутствие нейроинфекций, черепно-мозговых травм в анамнезе, нейродеге-неративных заболеваний, опухолей головного мозга; наличие факторов риска возникновения гестоза: сердечно-сосудистые заболевания (ГБ, НЦД), нейро-обменно-эндокринные заболевания, заболевания печени и почек.
Критерии включения беременных в контрольную группу: срок беременности 12 недель и более, физиологическое течение беременности, отсутствие симптомов гестоза, признаков НМППК, ФПН и ЗВРП во время настоящей беременности, нейроинфекций, черепно-мозговых травм, нейроде-генеративных заболеваний, опухолей головного мозга.
Критериями включения пациенток в группу здоровых небеременных являются отсутствие в анамнезе нейроинфекций, черепно-мозговых травм, нейродегенеративных заболеваний, опухолей головного мозга.
Основным критерием включения пациенток группы риска в исследование было выявление у них повышенных уровней VCAM, NSE и GFAP в сыворотке крови - выборочная совокупность из 40 беременных на первом этапе исследования составила основную группу.
Возраст беременных контрольной группы находился в пределах от 18 до 40 лет, в группе здоровых небеременных колебался от 17 до 40 лет, в основной группе - от 19 до 41 года. Средний возраст женщин по группам представлен в таблице 1.
Таким образом, в группе женщин с факторами риска, у которых развился гестоз, у каждой второй встречались нейрообменно-эндокринные заболевания (45 %), у каждой третьей беременной - заболевания сердечнососудистой системы (32,5 %), у каждой шестой - заболевания почек и моче-выводящих путей (17,5%). Данные показатели достоверно превышают те же показатели в группе здоровых небеременных женщин и контрольной группе. Статистически достоверных различий между группами по другим заболеваниям нет.
В структуре гинекологических заболеваний (таблица 3) среди беременных с факторами риска по развитию гестоза и в контрольной группе чаще всего встречались хронические воспалительные заболевания матки и придатков (32,5% и 8 % соответственно), эктопия и лейкоплакия шейки матки (37,5%) и 4 % соответственно), инфекции половых органов (35 % и 8 % соответственно). У 12,5 % беременных с факторами риска по развитию гестоза отмечена дисфункция яичников, 5% женщин страдали бесплодием.
Таким образом, беременные с факторами риска по развитию гестоза достоверно чаще страдали хроническими восполительными заболеваниями репродуктивной системы по сравнению со здоровыми беременными и небеременными женщинами.
Иммунохимическое исследование
В группе здоровых небеременных женщин концентрацию VCAM, NSE и GFAP определяли однократно в 1-ой фазе менструального цикла.
Процедура постановки твердофазного иммуноферментного анализа НСБ.
Для количественного определения НСБ в сыворотке крови использован метод иммуноферментного анализа - твердофазный (гетерогенный) вариант иммуноферментного анализа. Принцип метода состоит в одновременном взаимодействии антигена изучаемого образца со специфическими антителами, иммобилизованными на твердой матрице и конъюгатом таких специфических антител с ферментом. Количество связанного конъюгата выявляется с помощью хромогенного субстрата, вступающего в реакцию с ферментом. При этом интенсивность приобретенного окрашивания пропорциональна количеству антигена в образце.
В качестве твердой матрицы мы применяли 96-луночные полистирольные планшеты фирмы «Costar» (USA). Схема постановки иммуноферментного анализа НСБ приведена на рисунке 2. Внесение образцов биологических жидкостей; комплементарное связывание соответствующих НСБ с антителами; -Внесение конъюгата антител с ферментом; комплементарное связывание соответствующих идиотипов антител конъюгата с эпитопами НСБ; -Внесение субстратной смеси для энзима конъюгата, изменение цвета субстратной смеси, регистрируемое фотометром. Проведение иммуноферментного анализа включает несколько этапов, необходимых для экспериментального подбора оптимальных концентраций «посадочных» антител и стандартных проб с заданной концентрацией антигена для построения калибровочной кривой:
1. Активация планшета путем внесения образцов посадочных антител в различных концентрациях с интервалом от 0,00075 до 0,075 %.
2. Внесение в ячейки планшета образцов стандартного АГ в различных концентрациях (пробы для построения калибровочных кривых).
3. Внесение в ячейки планшета различных разведений конъюгата AT с пероксидазой хрена для определения наиболее оптимальных концентраций вторых антител.
Раствор антител готовили на покрывающем буфере, приготовленном по прописи: 1,59 г Na2C03, 2,93 г NaHC03, вода до 1000 мл.
Процедуру инкубирования антител проводили в течение 12 ч при 4 С. За это время происходит адсорбция антител на поверхности полистирольной твердой фазы дна и стенок ячеек (так называемая активация твердой фазы). Затем активирующий раствор сливали и ячейки промывали отмывающим буфером, приготовленным по прописи: Отмывающий буфер рН 7,0 Трис - 6,05г СаС12-1,Пг NaCI - 0,2 г Тритон Х-100- 1,0 мл Н20-до 1000 мл
После промывки в ячейки вносили по 100 мкл исследуемой биологической жидкости или другого раствора определяемого антигена; в отдельные ряды ячеек вносятся стандартные пробы с известной концентрацией антигена. Эти растворы оставляются в ячейках на 2 ч при комнатной температуре. За это время происходит связывание антигена с адсорбированными антителами. Несвязав-шиеся белки отмываются тем же промывочным буфером, и ячейки заполняются разведенным конъюгатом фермента с соответствующими антителами, приготовленным по методике, описанной выше. Инкубация с конъюгатом продолжается 3 ч при комнатной температуре, после чего несвязавшийся конъюгат тщательно отмывается тем же буфером.
Проявление ферментативной активности пероксидазы в связанном конъюгате проводится с использованием субстратного буфера. В качестве хромогенного субстрата применяли ортофенилендиамин в концентрации 0,4 мг/мл в цитрат-фосфатном буфере рН 4,5 (7,3г лимонной кислоты, 11,86г NaH2P04x2H20, вода до 1000 мл). В субстратную смесь непосредственно перед внесением в ячейки, добавляли 10 мкл 30 % перекиси водорода. Полную субстратную смесь разливали по лункам (по 100 мкл) и инкубировали 10-20 минут при комнатной температуре. Затем ферментативную реакцию останавливали внесением 100 мкл 4 М H2SO4. Считывание результатов проводили с помощью многоканального спектрофотометра Е1х 800 (Bio-Тек Instruments) при длине волны 490 нм. По результатам определения оптической плотности и известным концентрациям антигенов в стандартных пробах строили калибровочные кривые, которые использовали в дальнейшей работе для определения концентраций НСБ в исследуемых образцах биологических жидкостей. Калибровочные кривые строились путем графического отображения зависимости оптической плотности раствора от концентрации антигена в стандартном образце. Учитывали наличие фонового уровня оптической плотности, представленного соответствующими значениями отрицательных контрольных образцов, не содержащих специфических НСБ. По оси ординат откладывали разницу между исследуемыми и отрицательными контрольными пробами. Рабочим промежутком считали наиболее близкий к линейному участок кривой. В случае всех разработанных тест-систем определения НСБ, этот участок был определен в диапазоне концентраций от 1,0 до 120 нг/мл. Чувствительность тест-системы (минимальное количество АГ, которое возможно определить с ее помощью) определялась путем экстраполяции на ось абсцисс начальной точки линейной зависимости и составила, соответственно 1,0 нг/мл.
