Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Формы и причины невынашивания беременности 12
1.2. Невынашивание беременности, обусловленное хромосомными аберрациями 29
1.3. Генные причины невынашивания беременности 39
Глава 2. Материалы и методы исследования 66
2.1. Клинический раздел 67
2.2. Клинико-лабораторные методы 69
2.3. Цито генетическое исследование кариотипов супругов с разными формами невынашиванием беременности L..70
2.4. Молекулярно-биологическое исследование полиморфных аллелей 14 генов у супругов с невынашиванием беременности 71
2.5. Биохимические исследования 77
2.6. Статистическая обработка результатов 78
Глава 3. Ретроспективный раздел исследований 80
3.1. Клинический мониторинг пациенток с невынашиванием и привычным невынашиванием беременности 80
3.2. Характеристика пациенток с первичным и вторичным невынашиванием беременности 112
3.3. Обсуждение 136
Глава 4. Проспективный раздел исследований . 141
4.1. Клиническая характеристика небеременных женщин с разными формами невынашивания беременности в анамнезе 141
4.2. Особенности течения и исходов настоящей беременности у обследованных женщин 158
4.3. Обсуждение 171
Глава 5. Цитогенетическая характеристика супружеских пар с разными формами невынашивания беременности в анамнезе 177
5.1. Цитогенетическая характеристика супружеских пар с различным числом самопроизвольных выкидышей в анамнезе 178
5.2. Цитогенетическая характеристика супругов с первичным и вторичным з
невынашиванием беременности в анамнезе 181
5.4. Цитогенетическая характеристика супругов в зависимости от наличия врожденных пороков развития у плода в анамнезе 182
5.5. Обсуждение 183
Глава 6. Тестирование полиморфизма некоторых генов в супружеских парах с невынашива нием беременности 189
6.1.Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфизма 13 генов у женщин, мужчин и у супружеских пар в зависимости от числа самопроизвольных выкиды шей в анамнезе 189
6.1.1. Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов по генам системы детоксикации GSTM1, GSTT1, GSTP1 189
6.1.2. Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов по 2-м генам фолатного цикла MTHFR и MTRR 201
6.1.3. Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов генов факторов свертывания крови (FI, FII, FV) 210
6.1.4. Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфизма генов HLA II класса (DRB1, DQA1,DQB1) и гена HLA-G 215
6.1.5. Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфизма гена васкулярно-эндотелиального фактора роста VEGF 224
6.2. Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфизма 13 генов у женщин, мужчин и у супружеских пар в зависимости от акушерского анамнеза 226
6.2.1. Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов по генам системы детоксикации GSTM1, GSTT1, GSTP1 226
6.2.2. Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов по 2-м генам фолатного цикла MTHFR и MTRR 237
6.2.3. Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов генов факторов свертывания крови (FI, FII, FV) 244
6.2.4. Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфизма генов HLA II класса (DRB1, DQA1,DQB1) и гена HLA-G 249
6.2.5. Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфизма гена васкулярно-эндотелиального фактора роста VEGF 258
6.3. Обсуждение 259
Глава 7. Глютатионтрансферазная активность плаценты при невьшашивании беременно
сти 272 7.1. Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов по 3-м генам GSTM1, GSTT1,
GSTP1 в плацентах у женщин с невынашиванием беременности 272
7.2. Глютатионтрансферазная активность в плацентах у женщин с невынашиванием беременности в зависимости от генотипов 3-х генов детоксикации GSTM1, GSTT1,GSTP1 276
7.3. Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов по гену эндотелиальной NO-синтазы eNOS в плацентах у женщин с невынашиванием беременно сти 283
7.4. Обсуждение 284
Глава 8. Анализ уровня гомоцистеина при невынашивании беременности 288
8.1. Уровень гомоцистеина у женщин, мужчин и у супружеских пар с самопроиз вольными выкидышами в анамнезе в зависимости от генотипов 2-х генов MTHFR,MTRR 288
8.2. Обсуждение 294
Заключение 301
Выводы 304
Практические рекомендации 307
Список литературы
- Невынашивание беременности, обусловленное хромосомными аберрациями
- Молекулярно-биологическое исследование полиморфных аллелей 14 генов у супругов с невынашиванием беременности
- Особенности течения и исходов настоящей беременности у обследованных женщин
- Цитогенетическая характеристика супругов в зависимости от наличия врожденных пороков развития у плода в анамнезе
Введение к работе
Актуальность проблемы. Репродуктивное состояние и деторождение - наиболее значимые показатели здоровья, как индивидуума, так и в целом популяции (Э.К. Айламазян, 1997; В.И. Кулаков, 2002; О.Г. Фролова, 2005). В условиях неблагоприятной демографической ситуации, когда каждые пять лет на 20% уменьшается число женщин, способных родить ребенка, особенно актуально сохранение и развитие беременности у супружеских пар, желающих иметь детей (В.Е. Радзинский и соавт., 2008). По данным коллегии МЗ РФ (2006), ежегодно в нашей стране каждая пятая желанная беременность завершается самопроизвольным абортом.
Причины самопроизвольного прерывания беременности настолько разнообразны, что до сих пор создание единой классификации затруднено. Вопрос о начале и объеме обследования супругов широко дискутируется в литературе. За рубежом общепринята точка зрения, что детальное обследование необходимо начинать после трёх повторных выкидышей, в отечественном акушерстве – рекомендуется после двух, в настоящее время некоторые ученые отмечают необходимость обследования супругов после одного выкидыша (Н.Г. Кошелева, 2002; В.М. Сидельникова, 2005; О.Г. Фролова, 2005). Известно, что риск потери беременности после первого выкидыша составляет 13-17%, после двух самопроизвольных выкидышей риск возрастает в 2 раза и составляет 24%, после трех доходит до 30%, а после четырех – достигает 50% (А.А. Агаджанова, 2003).
В последние годы в зависимости от акушерского анамнеза выделяют две формы невынашивания беременности (НБ): первичное – когда все беременности заканчивались самопроизвольными выкидышами и вторичное – когда в анамнезе наряду с выкидышами, были и/или медицинские аборты, роды, внематочная беременность (S.M. Quensby, 1993; Kenneth J. Ward, 2000; И.Н. Фетисова, 2007).
Одной из ведущих причин НБ ранних сроков принято считать генетический фактор. На протяжении последних 50 лет, понятие «генетические причины НБ» включало в себя только наличие хромосомных аберраций как у супругов с выкидышами в анамнезе, так и у абортусов (J.G. Boue et al., 1970; Н.П. Бочков, 1997; G.M. Surrat, 1990; В.М. Сидельникова, 2005). НБ может быть обусловлено, так и наличием наследственной предрасположенностью. НБ – это мультифакториальное заболевание: результат действия «функционально ослабленных» вариантов (аллелей) множества генов на фоне неблагоприятных внешних и внутренних факторов (В.С. Толмачев, 1986; Г.Р. Мутовин 1997; Иващенко Т.Э. и др., 2007). В мире в настоящее время изучен аллельный полиморфизм более 40 генов, относящихся к генной сети НБ.
Согласно современным представлениям, проблему НБ нельзя решать только во время беременности. Для выяснения причин выкидышей, а также для оценки состояния репродуктивной системы супругов необходимо комплексное обследование (женщин и мужчин) вне беременности. Особую важность приобретают разработки новых высокотехнологических диагностических подходов, направленных на раннее, досимптоматическое выявление супружеских пар высокого риска по НБ (В.С. Баранов, Э.К. Айламазян, 2009).
Целью исследования явилась разработка новых подходов диагностики и профилактики разных форм НБ на основе комплексного клинико-генетического анализа данной патологии, а также создание научной базы для составления генетического паспорта репродуктивного здоровья супружеской пары.
Задачи исследования
-
Изучить динамику изменений анамнестических данных, частоты и структуры гинекологической и экстрагенитальной патологии, характера и частоты осложнений беременности и родов и их исходов для плода у женщин с разным числом выкидышей в анамнезе на протяжении последних 20 лет (ретроспективный мониторинг каждые 5 лет), с учетом первичного и вторичного НБ;
-
Выявить частоту и структуру хромосомной патологии у супружеских пар с разным числом самопроизвольных выкидышей; при первичном и вторичном НБ;
-
В парах с разным числом выкидышей в анамнезе; с первичным и вторичным НБ, изучить особенности аллельного полиморфизма 13 генов: системы детоксикации (GSTM1, GSTT1, GSTP1); фолатного обмена (MTHFR, MTRR); факторов свертывания крови (FI, FII, FV); HLA-системы (DQA1, DQB1, DRB1, HLA-G); факторов роста (VEGF);
-
Изучить особенности аллельного полиморфизма 3-х генов II фазы системы детоксикации GSTT1, GSTМ1 и GSTР1 и гена дисфункции эндотелия NOS3 в плацентах у родильниц с НБ;
-
Выявить связь «функционально ослабленных» аллельных вариантов генов II фазы детоксикации GSTT1, GSTМ1 и GSTР1 с глутатион-S-трансферазной активностью в плацентах женщин с НБ;
-
Проанализировать влияние пола, возраста, числа самопроизвольных выкидышей, генотипа по генам фолатного цикла MTHFR и MTRR на уровень гомоцистеина в крови в парах с НБ;
-
Разработать алгоритм обследования и тактику ведения супружеских пар с разным числом выкидышей в анамнезе, с первичным и вторичным НБ.
Научная новизна и теоретическая значимость работы
Впервые проведен клинический мониторинг - за последние 20 лет (каждые 5 лет: 1983, 1988, 1993, 1999, 2003) по материалам НИИАГ им. Д.О. Отта СЗО РАМН. Осуществлено комплексное динамическое изучение анамнестических данных, частоты и структуры гинекологической и экстрагенитальной патологии, характера и частоты осложнений беременности и родов, а также и их исходов у женщин с разным числом выкидышей в анамнезе, с учетом первичного и вторичного НБ. Впервые проведен анализ частоты и структуры хромосомной патологии у супружеских пар с разным числом самопроизвольных выкидышей; и при первичном и вторичном НБ. Впервые изучены особенности аллельного полиморфизма 13 генов, контролирующих важнейшие для сохранения беременности метаболические системы: гены системы детоксикации (GSTM1, GSTT1, GSTP1); гены, фолатного обмена (MTHFR, MTRR); гены факторов свертывания крови (FI, FII, FV); гены главного комплекса гистосовместимости HLA-системы (DQA1, DQB1, DRB1, HLA-G); фактора роста (VEGF) в парах с разным числом выкидышей в анамнезе, и выявлена их роль при первичном и вторичном НБ. Впервые установлено целесообразность генетического тестирования аллельного полиморфизма десяти генов (GSTT1, GSTМ1, GSTР1, MTHFR, MTRR, DQA1, DQB1, DRB1, HLA-G, VEGF) для прогнозирования риска НБ при разном числе выкидышей в анамнезе и восьми генов (GSTT1, GSTМ1, GSTР1, MTHFR, MTRR, DQA1, DQB1, DRB1) для прогнозирования первичного НБ. Впервые установлена корреляция глутатион-S-трансферазной активности с «функционально ослабленными» аллельными вариантами генов II фазы детоксикации GSTT1, GSTМ1, GSTР1 в плацентах женщин с НБ. Впервые проведено сравнение уровня гомоцистеина в крови у женщин и мужчин с учетом числа самопроизвольных выкидышей, в зависимости от генотипа по генам фолатного обмена MTHFR и MTRR.
Практическая значимость работы
Проведенные исследования позволили определить необходимые и эффективные генетические методы комплексной диагностики различных форм НБ, определить группы повышенного риска по НБ на основе генетического тестирования полиморфизма генов; разработать алгоритм генетического обследования и тактику ведения супружеских пар с разным числом выкидышей в анамнезе, с первичным и вторичным НБ.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Большую роль в НБ играет наследственная предрасположенность обоих супругов. Парам с НБ необходимо проводить дифференцированное клинико-генетическое обследование с учетом количества выкидышей в анамнезе, первичного и вторичного НБ;
-
За последние 20 лет у женщин со спонтанными абортами в анамнезе выявлен значительный рост аллергической, соматической и акушерско-гинекологической патологии особенно в период с 1993 по 1998 годы.
-
Особенности анамнестических данных, гинекологической и экстрагенитальной заболеваемости, течения настоящей беременности, родов и послеродового периода, состояния и заболеваемости новорожденных доказывают правомочность выделения двух форм НБ – первичного и вторичного. У женщин с первичным НБ в 1,5-2 раза по сравнению с вторичным выше частота осложнений беременности, родов и неблагоприятных исходов для плода и новорожденного.
-
Риск НБ и его форм зависит от функционального состояния генов системы детоксикации, фолатного цикла, главного комплекса гистосовместимости HLA-системы, факторов свертывания крови, факторов роста. Относительный вклад генетических и средовых факторов варьирует в каждом конкретном случае, и их необходимо оценивать в супружеской паре.
-
Наличие сочетаний определенных «функционально неблагоприятных» генотипов по изученным генам у супружеских пар с НБ ассоциировано с числом выкидышей.
-
У супружеских пар с первичным НБ выявлена ассоциация с большим числом «функционально неблагоприятных» аллелей и генотипов, чем у пар с вторичным, что свидетельствует о существенной роли генетических факторов при первичным НБ.
Апробация работы и личный вклад автора
Основные положения диссертации доложены на на межлабораторных заседаниях в НИИАГ им.Д.О. Отта СЗО РАМН, 2001-2008, Х Международном конгрессе по генетике человека в Вене, Австрия, 2001г., на I Конференции по Превентивной медицине, Виши, Франция, 2001г., на IV Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей, Санкт-Петербург, 2001г., на Научно-практической конференции «Невынашивание беременности и недоношенный ребенок», Петрозаводск, 2002г., на 1-ом Евро-Азиатском конгрессе, Санкт-Петербург, 2004г, на III Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», Москва, 2006г. Результаты работы используются в практике работы акушерского отдела, лаборатории пренатальной диагностики наследственных заболеваний, лаборатории биохимии НИИАГ им.Д.О. Отта СЗО РАМН, в Городском центре профилактики, диагностики и лечения невынашивания беременности, в Медико-Генетическом Центре г.Санкт-Петербурга, в учебный процесс кафедры акушерства и гинекологии Санкт-Петербургского Государственного университета. Клинические наблюдения проводились автором лично в отделении патологии беременности НИИАГ им.Д.О. Отта СЗО РАМН (руководитель – проф., д.м.н. Аржанова О.Н.). Цитогенетические и молекулярно – генетические исследования проводили в лаборатории пренатальной диагностики наследственных болезней НИИАГ им.Д.О. Отта СЗО РАМН с участием автора (руководитель – член-кор. РАМН, проф., д.м.н. Баранов В.С.) В лаборатории биохимии НИИАГ им. Д.О. Отта СЗО РАМН (руководитель – проф., д.б.н. Арутюнян А.В.) проведено определение глютатион-S-трансферазная активность в плацентах. Исследование уровня гомоцистена в крови проводили в Городском Медико-Генетическом Центре, в Российском НИИ Гематологии и Трансфузиологии, в лаборатории биохимии НИИАГ им.Д.О. Отта СЗО РАМН. Обработка, анализ и интерпретация полученных данных выполнены автором лично.
По теме диссертации опубликованы 41 научная работа, в том числе 7 – в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 345 страницах машинописного текста и состоит из ведения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы, содержащего 227 отечественных и 178 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 112 таблицами и 70 рисунком.
Невынашивание беременности, обусловленное хромосомными аберрациями
Поздний токсикоз беременных занимает одно из первых мест, оказывающих влияние на НБ. Частота преждевременных родов при позднем токсикозе колеблется от 9,5 до 28%; при сочетанных формах токсикоза в три раза выше, чем при чистых [30,98,132]. Такой большой диапазон колебания объясняется фоном, на котором развился поздний токсикоз [136].
НБ является одним из основных факторов риска развития плацентарной недостаточности [14,83,148]. По данным литературы, в 47,6-77% случаев НБ осложняется плацентарной недостаточностью. Угроза прерывания беременности может быть одновременно причиной плацентарной недостаточности и её следствием. По частоте возникновения она занимает второе место среди всех осложнений беременности. Угрожающий выкидыш отмечается у 91% женщин с установленным диагнозом «плацентарная недостаточность» [148,149,206,207]. У беременных с угрозой прерывания развивается как первичная, так и вторичная плацентарная недостаточность. Первичная плацентарная недостаточность развивается в сроки формирования плаценты (до 16-ой недели беременности) и чаще встречается у женщин, в анамнезе которых имеются гинекологические заболевания, повторные самопроизвольные выкидыши, искусственные аборты и неразвивающаяся беременность, а также у беременных с бесплодием в анамнезе. Вторичная плацентарная недостаточность возникает после завершения формирования плаценты и обусловлена экзогенными влияниями, прежде всего - заболеваниями, перенесенными во время беременности. Развитие плацентарной недостаточности приводит к внутриутробной задержке плода, осложненному течению раннего неонаталь-ного периода у недоношенных детей и является одним из звеньев механизма прерывания беременности [14,67,82,83,120]. Плацентарная недостаточность приводит не только к увеличению перинатальной смертности (по данным Г.М. Савельевой, перинатальная смертность составляет 60%), а также способствовать высокой частоте соматической и инфекционной заболеваемости новорожденных, служить причиной нарушений физического и умственного развития плода [149].
Факторами, ведущими к преждевременному прерыванию беременности, являются аномалии прикрепления плаценты. Причины предлежания и низкого прикрепления плаценты разнообразны: недостаточное развитие дециду-альной ткани в связи с гормональными расстройствами или атрофическими и воспалительными изменениями эндометрия, многократные выскабливания полости матки и др. Это приводит к нарушению васкуляризации эндометрия, ухудшению условий имплантации и плацентации [22,77,185]. По данным некоторых авторов, частота преждевременных родов при предлежании плаценты примерно в 5 раз выше, чем при её нормальном расположении [9,151]. Как предлежание плаценты, так и отслойка нормально прикрепленной плаценты имеют тенденцию повторяться при последующих беременностях, поэтому оба эти нарушения являются постоянными факторами недонашивания.
Различные экстуагенитальные заболевания (гипертоническая болезнь, гипотоническая болезнь, гиповитаминозы, органические и функциональные болезни центральной нервной системы, анемия, пороки сердца, бронхиальная астма и другие) являются причиной НБ на более поздних сроках [30,90,98,218,219,220,226,381]. Известно, что в группе пациенток с гипотонией беременность почти в 3 раза чаще заканчивается преждевременно [14].
Большое значение в НБ придается иммунологическим факторам [14,61,276,306,320,367,374]. В настоящее время известно, что около 80% всех раннее необъяснимых случаев повторных выкидышей связано с иммунологическими нарушениями во взаимоотношениях между матерью и плодом. [2]. Наличие генов и, соответственно, белков отцовского происхождения позволяет рассматривать плод как аллотрансплантант по отношению к материнскому организму. Иммунологические взаимоотношения между матерью и плодом бывают аллоиммунными и аутоиммунными, и те и другие могут быть причиной НБ [78].
При аллоимунных нарушениях иммунный ответ направлен против антигенов плода отцовского происхождения, чужеродных для организма матери [2,185]. Примером, аллоиммунных взаимодействий служит гемолитическая болезнь новорожденных в связи с Rh- или АВО-сенсибилизацией, а также наличие у супругов повышенного количества общих антигенов системы HLA [1,2,62].
Аутоиммунные реакции направлены против собственных тканей матери, плод же страдает вторично от возникших изменений в состоянии матери. Примером таких взаимодействий является антифосфолипидный синдром, диффузнотоксический зоб, миастения, аутоиммунный оофорит, системная красная волчанка и другие заболевания. У 27% пациенток с привычным невынашиванием есть аутоиммунные нарушения [14].
В работах Beer А. & Kwak J., 2000, иммунологические нарушения при репродуктивной патологии (НБ, бесплодии, неудач ЭКО) разделяют на 5 категорий [252,253,254].
К первой, наиболее важной, относят совместимость супругов по системе HLA, ведущей к неэффективному «камуфляжу» плаценты, делающей её доступной к иммунной атаке со стороны материнского организма. Система HLA контролирует взаимодействия всех иммунокомпетентных клеток организма, распознавание своих и чужеродных (в том числе измененных собственных) клеток, запуск и реализацию иммунного ответа и, в целом, обеспечивает выживание человека как вида в условиях экзогенной и эндогенной агрессии [227].
Молекулярно-биологическое исследование полиморфных аллелей 14 генов у супругов с невынашиванием беременности
Известно, что GST присутствуют в самых разных тканях, и начинают синтезироваться еще в эмбриональном периоде развития [335,339]. Полиморфизм генов, контролирующих их синтез, может приводить к повышению или снижению активности соответствующих ферментов, и таким образом, быть причиной дисбаланса между ферментами I и II фаз [307,357]. Логично предполагать, что следствием такого дисбаланса может быть накопление в организме матери, отца и плода различных токсинов, приводящих к угрозе прерывания беременности на ранних сроках.
Результаты исследования полиморфизма генов системы детоксикации при ПНБ неоднозначны. Впервые в 1996 году Hirvonen A. et al. [403], была показана, ассоциация функционально ослабленных аллелей гена GSTM1 с привычной потерей плода на ранних сроках. Однако в работе шведских авторов [361], не было обнаружено какой-либо связи функционально ослабленных аллелей гена GSTP1 с риском ПНБ. Японские ученых подтвердили роль «функционально ослабленного» генотипа GSTM1 0/0 у женщины с ПНБ [299].
В России исследование полиморфизма генов системы детоксикации при ПНБ проведены в Северо-Западном и Центральном регионах, причем исследование было проведено не только на женщинах, но в целом на супружеских парах с нарушенной репродукцией [31,33,53,54,55]. С 1999 по 2007 годы нами исследован полиморфизм трех генов GSTM1, GSTT1 и GSTP1 у 264 супружеских пар Северо-Западного региона с НБ в анамнезе. Была установлена достоверная ассоциация ПНБ с наличием функционально ослабленных аллелей 3-х генов II фазы детоксикации GSTM1, GSTT1 и GSTP1 [33,54,55,140]. Московские ученые не обнаружили статистически значимых различий в час 47 тотах полиморфных аллелей в генах системы детоксикации между лицами с нормальной и нарушенной репродукцией [31,208].
В последние годы появились работы по изучению роли GST в формировании репродуктивного здоровья у мужчин. Так, в 1998 году впервые было высказано предположение о связи делеций в гене GSTM1 с мужским бесплодием [302]. Результаты этого исследования указывают на нарушение акросо-мальной реакции сперматозоидов у мужчин с GSTM1 0/0 генотипом. Затем S.S.Chen с соавт. (2002) выявили положительную корреляцию генотипа GSTM1 0/0 с бесплодием у мужчин с варикоцеле [267]. Согласно полученным данным, наличие генотипа GSTM1 0/0 неблагоприятно сказывается на устойчивости сперматозоидов к продуктам перекисного окисления липидов и способствует снижению мужской фертильности.
Тестирование генов II фазы детоксикации позволяет идентифицировать индивидуумов с «быстрыми» и «медленными» типами метаболизма ксенобиотиков и определять тактику ведения данных пациентов, а также организовать рациональную профилактику НБ.
II группа. Гены метаболизма фолиевой кислоты и витамина В12. За последние десятилетие хорошо изучена группа генов, принимающих участие в метаболизме фолиевой кислоты и витамина В12. Высокие концентрации активной формы фолиевой кислоты необходимы для превращения избытка гомоцистеина в метионин. Кофакторами ферментов метаболических путей метионина выступают витамины, самыми важными из которых являются фо-лиевая кислота, пиридоксин (витамин В6), цианокобаламин (витамин В12) и рибофлавин (витамин В1). Фолатный цикл является сложным каскадным процессом, в котором задействовано много разных ферментов (рис. 1.3.4). Основными 4 ферментами, обеспечивающими превращение фолиевой кислоты на разных этапах цикла, являются MTHFR, MTRR, MTR и ТС. Известно, что снижение активности этих ферментов — является одной из важных причин накопления гомоцистеина в организме.
Фолатный цикл и цикл метионина: Примечание: 5,10-метилентетрагидрофолат-редуктаза (MTHFR) является ключевым ферментом фолатного цикла. Она катализирует превращение 5,10-метилентетрагидрофолата (5J0-CH2HF) в 5-метилтетрагидрофолат (5-CHiHF) -активную форму фолиевой кислоты. 5-CHsHF служит донором метильных групп и основным источником тетрагидрофолата (THF) в витамин В -зависимом реметилирова-нии гомоцистеина в метионин, катализируемым ферментом метионин-синтазой (MTR). Метионин, в свою очередь, после превращения в S-аденозилметионин (SAM), является основным донором метильных групп, необходимых для метилирования ДНК, РНК, белков и фосфолипидов. При переходе витамина Ви в окисленную форму, происходит подавление активности MTR. Для восстановления функции MTR необходимо дополнительное метилирование с помощью фермента метионинсинтазредуктазы (MTRR).
Можно выделить несколько возможных причин действия повышенного гомоцистеина на организм женщины и плода:
Одним из важных факторов, способствующих увеличению уровня гомоцистеина в крови, может быть наследственная предрасположенность. На сегодняшний день, изучен полиморфизм генов - MTHFR, MTRR, MTR, ТС (табл. 1.3.1). Продукты этих генов - ферменты задействованы в одном каскаде метаболизма. Рядом исследователей было отмечено значительное увеличение риска развития акушерской патологии, связанной с повышенным уровнем гомоцистеина в крови, при наличии полиморфных аллелей в нескольких генах фолатного цикла [293]. Для полиморфизма генов MTHFR, MTRR, MTR, ТС показана достоверная ассоциация с репродуктивной патологией, и в частности с НБ. Полиморфизм гена MTHFR С/Т наиболее изучен. Аллель С-677-Т - результат точечной мутации, в результате которой аланин заменен на ва-лин. При этом нормальный аллель — это аллель С, мутантный аллель - Т. Термолабильный вариант 677Т сопряжен с нарушением фолатного метаболизма, результатом чего является повышение уровню гомоцистеина и тром-бофилия. У носителей аллеля Т во время беременности наблюдается дефицит фолиевой кислоты.
Несмотря на большое число работ, в которых изучали С/Т полиморфизм гена MTHFR у пациенток с НБ в анамнезе, единого мнения о наличии таковой ассоциации до настоящего времени нет (табл. 1.3.2).
Так, в исследованиях из разных стран Европы, Азии, Америки подтверждено, что наличие аллеля Т гена MTHFR повышает риск привычной потери плода в 4-10 раз. Более того, в одном из последних исследований продемонстрирована ассоциация С/Т полиморфизма гена MTHFR даже с одним самопроизвольным выкидышем раннего срока в анамнезе.
Особенности течения и исходов настоящей беременности у обследованных женщин
Всем супружеским парам для выявления причин невынашивания беременности проводилось комплексное обследование, включающее в себя: клинические, биохимические, инструментальные методы исследования, консультации и осмотр специалистов - эндокринолога, терапевта, генетика, при необходимости иммунолога, андролога и других.
Микробиологическое обследование с целью выявления генитальной инфекции проводилось в лаборатории микробиологии НИИАГ им. Д.О.Отта (руководитель - проф., д.м.н. Савичева A.M.) с целью выявления генитальной инфекции. Для выявления Ch. Trachomatis применялись методы культураль-ной диагностики и цепной полимеразной реакции. Для выявления М. hominis U. Urealyticum использовали методику посевов на искусственные питательные среды, разработанные М.А. Башмаковой (1972) и ПЦР. Для выявления бактериальной флоры применялись бактериологические и бактериоскопиче-ские методы.
Гормональные методы исследования использовали для диагностики причин невынашивания беременности. Они включали определение содержания в сыворотке крови ФСГ, ЛГ, пролактина, эстрадиола и прогестерона, определение 17КС в суточной моче по показаниям (в лаборатории эндокринологии НИИАГ им. Д.О.Отта, руководитель - проф., д.м.н. Потин В.В.).
Ультразвуковое сканирование органов малого таза проводили всем женщинам вне и во время беременности на ультразвуковом приборе Medisson-8000 в лаборатории патофизиологии плода НИИАГ им. Д.О.Отта (руководитель - проф., д.м.н. Павлова Н.Г.). По показаниям проводилась диагностическая лапароскопия и гистероскопия на 18-22-й день менструального цикла для исключения маточного фактора в отделении гинекологии НИИАГ им. Д.О.Отта (руководитель - проф., д.м.н. Беженарь В.Ф.).
Исследование спермограммы с изучением кинетики сперматозоидов, спермагглютинации, резистентности проводилось у мужчин из супружеских пар с невынашиванием беременности.
Определение антифосфолипидных, антиспермальных, антиовариальных антител осуществляли методом имуноферментного анализа в лаборатории иммунологии НИИАГ им.Д.О.Отта РАМН (руководитель -проф., д.м.н. Сельков С.А.).
Цитогенетическое исследования выполнялись сотрудниками цитогенети-ческой группы (руководитель — д.б.н. Кузнецова Т.В.) в лаборатории прена-тальной диагностики наследственных болезней НИИАГ им. Д.О.Отта . Традиционные цитогенетические исследования проводили по следующим показаниям: 1) наличие в анамнезе двух и более спонтанных абортов на ранних сроках беременности; 2) рождения ребенка с хромосомными аномалиями, множественными врожденными пороками развития, 3) мертворождение в анамнезе, 4) по желанию пары, планирующей настоящую беременности (в данную группу входили супруги с одним спонтанным выкидышем в анамнезе). Материалом для исследований служила периферическая венозная кровь из локтевой вены, взятая у супругов. Всего 438 пар.
Хромосомные препараты получали из культуры лимфоцитов периферической крови по стандартной методике, предложенной Hungerford (1965). Хро 71 мосомы идентифицировали после дифференцированного окрашивания (С-метод, G-метод) при увеличении 1125. При анализе метафазных пластинок учитывали не менее 11 метафаз. В случае обнаружения хромосомных аберраций (дицентрики, кольца, парные фрагменты, хромосомные и хроматидные разрывы, пробелы) анализировали по 100 метафазных пластинок. Для выяснения добавочного хромосомного материала неизвестного происхождения, уточнения точек разрыва в хромосомах проводили гибридизации in situ клонированных последовательностей ДНК с метафазными и интерфазными хромосомами (Chandler М.Е., Yunis J.J.,1978; Юров Ю.Б.,1984)
Приготовление хромосомных препаратов из ткани плаценты и лимфоцитов пуповины крови плода осуществлялось с помощью оригинальных методов, разработанных в лаборатории пренатальной диагностики наследственных болезней НИИАГ им. Д.О.Отта (B.C. Баранов и др., 1995).
Запись цитогенетического и молекулярно-цитогенетического диагноза производилась по международной номенклатуре стандартизации цитогене-тических исследований.
Молекулярно-биологические исследования полиморфизмов 14 генов выполнялись автором совместно с сотрудниками молекулярной группы (к.б.н. Малышевой О.В., к.б.н. Деминым Г.С., научными сотрудниками- Та-расенко О.А., Матвеевой Н.И.) под руководством - проф., д.б.н. Иващенко Т.Э. в лаборатории пренатальной диагностики наследственных болезней НИИАГ им. Д.О.Отта. Исследованные гены и их полиморфизмы приведены в таблице 2.4.1.
Проведено исследование 353 образцов ДНК супругов с различными формами невынашивания беременности в анамнезе (247 женщин и 106 мужчин), 108 образцов ДНК женщин из контрольной группы, 132 образца ДНК
Цитогенетическая характеристика супругов в зависимости от наличия врожденных пороков развития у плода в анамнезе
А отсутствие реабилитационных мероприятий после перенесенного случая невынашивания беременности в 50% случаев приводит к выкидышу при повторной беременности [104,185].
На основании ретроспективного анализа 1425 историй родов женщин с самопроизвольными выкидышами нами была проведена оценка структуры и динамики причин НБ в зависимости от количества выкидышей и особенностей акушерского анамнеза за 20 лет с интервалом каждые 5 лет (1983, 1988, 1993, 1998 и 2003 годы). Клинический мониторинг включал в себя исследование анамнестических данных, состояния репродуктивной системы, экстрагениталь-ной заболеваемости, данных за течением настоящей беременности, родов и послеродового периода, состояния и заболеваемости новорожденных, гистологического исследования плацент.
Анализ динамики изменений частоты и структуры причин как ПНБ, так и НБ по годам выявил наметившуюся общую тенденцию к увеличению возраста женщин, отягощенности аллергического анамнеза, гинекологических заболеваний (увеличение частоты воспалительных заболеваний матки и придатков, эн-дометриоза и миомы матки, сочетанной урогенитальной инфекции, гиперанд-рогенемии различного генеза), экстрагенитальной патологии (увеличение частоты сердечно-сосудистых заболеваний, патологии почек, почти пятикратный рост числа заболеваний щитовидной железы).
Была проведена оценка детородной функции у пациенток с ПНБ и НБ по годам. В обеих группах отмечена положительная динамика роста частоты бесплодия (как первичного, так и вторичного), числа замерших беременностей, увеличение частоты выкидышей произошедших на ранних сроках. При этом у женщин с НБ на протяжении пяти лет отмечен рост искусственных абортов в анамнезе, после которых последующая беременность самопроизвольно прерывалась, у женщин с ПНБ частота абортов оставалась на одном уровне.
Нами был проведен анализ особенностей течения настоящей беременности, родов и послеродового периода у пациенток с НБ и ПНБ по годам. Среди пациенток как с одним выкидышем в анамнезе, так и с повторными, выявлено уве 138 личение частоты преждевременного прерывания повторной беременности: если в 1983 году примерно 5% последующих беременностей заканчивалась выкидышем, то в 2003 году около 15% желанных беременностей прервались раньше срока. С каждым годом наблюдался рост частоты угрозы прерывания последующей желанной беременности в обеих группах, при этом отмечен резкий подъем числа пациенток в обеих группах с постоянной угрозой прерывания на протяжении всей беременности. Так в 1983 году только у каждой десятой женщины наблюдалась угроза прерывания в I, II и III триместрах, в 1998 и 2003 годах - у каждой третьей-четвертой беременной. Среди пациенток с НБ и ПНБ отмечены тенденции к росту частоты гестозов при течении беременности примерно на 15%. Отмечено снижение аномалий родовой деятельности в 5-6 раз, если в 1983 году у каждой седьмой роженицы была диагностированы аномалии родовой деятельности, то в 2003 году - только у каждой двадцатой.
В обеих группах отмечен рост частоты операции кесарево сечения, за период с 1983 по 2003 годы она выросла более чем в 5 раз.
Как показали наши исследования, в обеих группах наблюдался рост числа новорожденных с гипотрофией разной степени и внутриутробной инфекцией различной этиологии. Так в 1983 году частота новорожденных с гипотрофией была около 1% в обеих группах, в 1993 году -3%, в а в 2003 году выросла до 10%. Одновременно отмечен рост внутриутробных инфекций различной этиологии почти в 10 раз в группе с НБ, и в 3 раза в группе с ПНБ.
Таким образом, в результате клинического мониторинга историй родов у женщин с НБ и ПН с интервалом каждые 5 лет на протяжении 20 лет нами были выявлены однонаправленные тенденции к росту частоты различной патологии, ведущей к преждевременному прерыванию беременности.
Хотя, в обеих группах с НБ и ПНБ на протяжении изученных лет отмечен рост одних и тех же показателей, в то же время частота их отличается между собой. При наличии равнозначных факторов, приводящих к самопроизвольному прерыванию беременности в обеих группах, у пациенток с повторными вы 139 кидышами в анамнезе частота многих показателей достоверно выше, чем у женщин с единственным спорадическим выкидышем.
В научных публикациях последних лет при формировании изучаемых выборок выделяют две формы НБ: первичное - когда у женщины в анамнезе все беременности заканчиваются самопроизвольным прерыванием в разные сроки и вторичное - когда беременности заканчиваются как выкидышами, так и\или медицинскими абортами, родами, внематочной беременностью. [2,185,373,386,399].
Ретроспективный сравнительный анализ 1425 историй родов пациенток с первичным и вторичным НБ и ПНБ в анамнезе позволил не только подтвердить, но и существенно уточнить клинические характеристики превичного и вторичного НБ. Выявленные достоверные отличия анамнестических данных, гинекологической и экстрагенитальной заболеваемости, течения настоящей беременности, родов и послеродового периода, состояния и заболеваемости новорожденных, частоты плацентарной недостаточности по данным гистологического исследования, доказывают правомочности выделения 2 форм невынашивания беременности.
Характерным для первичного НБ (с единственным спорадическим выкидышем в анамнезе) являются: молодой возраст пациенток (50% женщин 25 лет), первичное бесплодие, гиперпролактинемии и гиперандрогенемии, двурогая матка; высокая частота замерших беременности в анамнезе, аномалии родовой деятельности.
В группе с вторичным НБ - возраст более 30 лет (30% женщин), высокая частота воспалительных заболеваний матки и придатков, сочетанная урогени-тальная инфекция в анамнезе.
Основными причинами спорадического выкидыша (первичного НБ) являются эндокринные, инфекционные и анатомические причины. При вторичном НБ большую роль играют предшествующие выкидышу искусственные аборты, вследствие которых развиваются хронические воспалительные заболевания матки и придатков и истимико-цервикальная недостаточность, ведущих к преждевременному прерыванию беременности.
Характерным для первичного ПНБ является: 30% пациенток моложе 25 лет, высокий уровень нарушений менструального цикла, бесплодия (как первичного, так и вторичного), гиперпролактинемии и гиперандрогенемии, хронического гастрита; повышенная частота неразвивающихся беременностей в анамнезе, почти 60% выкидышей происходили до 8 недели беременности; аномалии родовой деятельности в родах.
В группе с вторичным ПНБ были выявлены свои особенности: старший возраст пациенток (52% 30 лет), высокая частота экстрагенитальной патологии (варикозной болезни, миокардиодистрофии, хронического пиелонефрита, мочекаменной болезни), достоверное увеличение числа самопроизвольных выкидышей в анамнезе на поздних сроках (после 16 недель), при течении настоящей беременности - высокая частота угрозы прерывания и плацентарной недостаточности, а в родах — хронической гипоксии плода.
При этом в обеих группах с ПНБ как с первичным, так и с вторичным отмечен одинаково высокий уровень отягощенности аллергического анамнеза, хронических воспалительных заболеваний матки и придатков, сочетанной уроге-нитальной инфекции, истмико-цервикальной недостаточности.
Таким образом, ретроспективный анализ большой выборки пациенток с НБ в анамнезе, позволили прийти к заключению, что структура и частота причин, ведущих к прерыванию беременности, на протяжении 20 лет претерпели существенные изменения. Наши исследования позволяют сформировать новые подходы к выявлению причин НБ, определения объема обследования женщин групп высокого риска НБ, выбора тактики ведения и лечения пациенток с различными формами НБ.
