Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Общие представления об основных путях репарации бактерий Ю
1.1. Фотореактивация 10
1.2. Эксцизионная репарация II
1.3. Пострепликативная репарация 17
1.4. Индуцибельная репарация, сопровождающаяся ошибками, или SOS репарация 22
1.5. Генетический контроль УФ-индуцированного мутагенеза и его связь с репарацией ДНК Глава 2. Действие плазмид на репарацию ДНК клетки и связанные с ней процессы 31
2.1. Связь действия плазмид с различными репаратив-ными путями клетки 36
2.2. О возможной роли интегративной супрессии в действии плазмид на выживаемость клеток и индуцированный мутагенез 49
2.3. Анализ плазмидных мутаций, влияющих на эффект плазмид 51
2.4. Изучение продуктов плазмидных генов, ответственных за эффект плазмид на репарацию ДНК и связанные с ней процессы 55
ЧАСТЬ II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 61
Глава I. Материалы и методы 61
Глава 2. Характеристика плазмиды 82
Глава 3. Влияние плазмиды Col 1Ъ-Р9 на выживаемость клеток
E»coli при действии различных агентов, повреж
дающих ДНК 92
3.1. Влияние плазмиды Сої 1Ъ-Р9 на выживаемость
клеток дикого типа 92
3.2. Действие плазмиды Сої ГЬ-Р9 на выживаемость клеток, дефектных по эксцизионной репарации .... 92
3.3. Действие плазмиды на выживаемость КЛЄТОКЕ.СОІІ , дефектных по рекомбинации и репарации 97
3.4. Действие плазмиды Col ГЬ~Р9 на выживаемость
после УФ-облучения мутантов гшиС и uvm 100
3.5. Действие аминокислотного голодания на защитный
эффект Col ГЬ-Р9 Ю5
Глава 4. Влияние плазмиды на индуцированный мутагенез IC4
4.1. Индукция мутаций под действием УФ-облучения . ... 104
4.2. Индукция мутаций под действием НГ и 2-АП НО
4.3. Влияние плазмиды Col ГЬ-Р9 на условно-спонтанный мутагенез в штамме DM1187 НО
Глава 5. Влияние плазмиды Col 1Ъ-Р9 на индукцию синтеза колицина EI 112
Глава б. Реактивация облученного ультрафиолетом фага 2 в
клетках E.coli , содержащих плазмиду Col ГЬ-Р9 Н6 6.1. Реактивация УФ-облученного фага А СІ857 в необлученных клетках 116
стр. 6.2. Реактивация фага Л СІ857 после УФ-облучения в облученных клетках 119
Глава 7. Рекомбинация в клетках E.coli , содержащих плазмиду Col Ib-P9 122
Глава 8. Анализ мутаций плазмиды Col 1Ъ-Р9 , изменяющих ее действие на УФ-индуцированный мутагенез 127
8.1. Получение и характеристика Col Ib:tQ?n5 мутант-ных плазмид 128
8.2. Локализация Col ГЬ 6-13::Т&5 мутации, снимающей действие плазмиды на УФ-мутагенез
8.3. Влияние плазмиды Col Ib-P9 drdl на выживаемость и мутагенез клеток E»coli после УФ-облучения 140
Глава 9. Сравнение действия плазмид и их мутантов на ИСК EI и выживаемость клеток при действии МС и УФ-облучения 14-2
9.1. Действие плазмиды рКШ.01 на ИСК EI 14-3
9.2. Влияние плазмиды рКШ.01 на выживаемость клеток после их обработки МС І4-5
9.3. Действие мутантных плазмид pGW12 и Col Ib:t(En5 на ИСК EI и выживаемость клеток после обработки МС 14-5
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ І49
ВЫВОДЫ 165
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 167
- Фотореактивация
- Связь действия плазмид с различными репаратив-ными путями клетки
- Характеристика плазмиды
- Индукция мутаций под действием УФ-облучения .
- Влияние плазмиды Col 1Ъ-Р9 на индукцию синтеза колицина EI
Фотореактивация
Фотореактивация - путь репарации, открытый первым / Kelner , 1949/.
Механизм фотореактивации состоит в следующем: под действием фермента фотолиазы пиримидиновые димеры одноэтапно переходят в мономерную форму на свету или при облучении клеток длинноволновым УШ светом /300-600 нм/ как в однонитевой, так и в двунитевой ДНК - II /Rupert , 1975/. Высокая специфичность фотолиаз к димерам цикло-бутанового типа служит удобным тестом для изучения роли этого типа повреждений в репарации и мутагенезе клеток после УФ-облучения.
До недавнего времени фотореактивация считалась самостоятельным путем репарации, не связанным с другими ее путями. Однако, Яматото с соавт. Aamamoto et al., 1983/ обнаружили в темноте увеличение в 15-20 раз количества выживших клеток мутанта recAifar+pur по сравнению с мутантомгесА рпг+ рш?+ ; мутация pur увеличивает количество и активность фотолиазы после действия Ш света. На основании этих данных авторы высказали предположение об участии фотолиазы также и в темновой репарации.
Связь действия плазмид с различными репаратив-ными путями клетки
На основании данных о снижении чувствительности клеток s»ty-phimurium и E.coli к УФ-облучению и увеличении количества УФ-индуцированных ревертантов в присутствии плазмиды Col I , Ховарт /Howarth , 1965,1966/ высказала предположение о кодировании плаз-мидой Col I продукта, принимающего участие в процессах репарации клетки. Ей не удалось, однако, сделать окончательный вывод о механизме действия плазмиды Col I . Дальнейшие исследования показали, что действие плазмид на выживаемость и мутагенез клеток после УФ-облучения связано с их влиянием на репарацию ДНК.
Из данных, представленных в табл.2, видно, что плазмиды, относящиеся к различным группам несовместимости, чаще всего одновременно увеличивают как выживаемость, так и УФ-индуцированный мутагенез в клетках дикого типа. Отмечено, что формы кривых выживаемости после действия УФ-света у штаммов, содержащие различные плазмиды, изменяются по-разному. Может быть изменен наклон кривой, как например, в присутствии плазмид BEl и ЕЕ 1-290 /Marsh » Smith , 1969/; может появиться "плечо" в начале кривой, как например, в присутствии плазмиды Col I /Howarth , 1965/; или кривые имеют обе вышеописанные особенности, как например, в присутствии плазмиды К46 / Drable , Stocker , 1968; Sweats et al ., 1976/.
Плазмиды, увеличивающие индуцированный мутагенез,в большинстве случаев увеличивают также и спонтанный мутагенез, например KELOl , R46 , N5 , pMG2 , R6 , R205 , хотя существуют плазмиды, действие которых на спонтанный мутагенез незначительно или отсутствует вовсе, например, pLS l , JR66a , R142 /Ch.ern.in ,Mikoyan , 1981/.
Одной из первых работ, в которой исследовалась связь действия плазмид на выживаемость бактерий с различными путями репарации, была работа Сиккарди /Siccardi , 1969/. Он исследовал действие 15 плазмид, определяющих лекарственную устойчивость или синтез колицинов, в штаммах uvrA"" , uvrB " , uvrCT , дефектных по первому этапу ЭР, и в штаммах recA , дефектных по рекомбинации. Было обнаружено, что количественно эффект плазмид R2, Rcl44 ,R42 , сі , с8 в штаммах uvr" был таким же, как в штамме дикого типа. Однако в мутантах uvr , содержащих эти плазмиды, выживаемость клеток не доходила до уровня, характерного для изогенных Uvr+ штаммов. Аналогичные данные были получены при исследовании действия других плазмид, например, RE13 и RE1-290 /Marsh , Smith , 1969/, тв/ Mortelmans , Stocker , 1976/, pMGl ,R2 , R931 , pMG15 /Lehrbach et al ., 1978/. Плазмиды pMGl ,R2 , R931 ,pMG15, pEMLOl и R46 увеличивали уровень УФ-индуцированного мутагенеза в uvrA , uvrB и uvrC мутантах /Lehrbach et al ., 1978; Walech , Stocker , 1979; Goze , Devoret , 1979/.
Характеристика плазмиды
Колициногенная плазмида Сої 1Ъ Р9 была впервые обнаружена в штамме Shigella sonnei Р9, по которому она и получила свое обозначение. Плазмида относится к lot группе несовместимости /Hedges » Datta , 1973/ и проявляет ряд интересных свойств, которые будут описаны ниже.
Молекулярная масса, репликация ДНК. Мол.масса ДНК плазмиды -61,5 мегадальтон; плазмида присутствует в клетках Е.соїі в количестве 1-2 копий /ciewll , Helinski , 1970/.
Репликация ДНК Col Гь-Р9 изучена мало. Показано, что для репликации этой плазмиды необходима ДНК-полимераза III / Goebel , 1974/. ДНК-полимераза I несущественна для репликации Col Гь-Р9 ; эта плазмида легко может быть передана вроІА мутанты и не элиминирует из них /Kingstttu?y , Helinski , 1970/.
Трансмиссивность. с0і 1ъ-Р9 -коньюгативная плазмида. Наличие I - лилей определяет чувствительность клеток, несущих col 1Ъ-Р9 , к I-специфическим ДНК-содержащим филаментозным бактериофагам Ifl и If2 / Meynell , Lawn , 1968/. Синтез половых ворсинок находится под негативным контролем репрессора, определяемого самой плазмидой. Col 1Ъ-Р9 может мобилизовать перенос в клетки реципиента различных нетрансмиссивных плаэмид, в том числе колици-ногенных плазмид Col El , Col к , передавая их в системе низкой или высокой частоты передачи /Hardy , 1975/.
Описан целый ряд мутантов плазмиды Col 1Ъ-Р9 с дерепрессиро 83 ванным синтезом половых ворсинок /drd/. Такие мутантные плазмиды передаются с высокой частотой в клетки реципиента /Edwards » Meynell , 1968; Dowman , Meynell , 1970; Derylo et al. , 1975/. Мутантные drd плазмиды придают клетке целый ряд интересных свойств: I - клетки, несущие Со1 1Ъ drd, растут медленнее и образуют колонии меньшего размера, чем клетки с плазмидой дикого типа; 2 - зоны, образуемые выделяющимся колицином lb на газоне индикаторного штамма, значительно больше вокруг колоний с мутантной плазмидой, чем с дикой, однако, количество колицина в клетках с Col 1Ъ-Р9 drd лишь немного больше или такое же, как в клетках с Col ь-ТЭ ; 3 - повышается чувствительность клеток с Col 1Ъ-Р9 к лизису при обработке их ЭДТА, лизоцимом и саркозилом, а также хлороформом и SDS /Dowman , Meynell , 1970/. По-видимому, все эти явления связаны с увеличением проницаемости клеток, несущих плазмиду, в результате изменения структуры клеточной оболочки.
Плазмида СоЗ 1Ъ-Р9 не осуществляет интегративную супрессию / Moody , Runge , 1972/ и, по-видимому, не мобилизует передачу хромосомных генов. В работе Муди и Хейса /Moody , Hayes , 1972/ было показано, что при передаче плазмиды Сої 1Ъ-Р9 при конъюгации не образовывались рекомбинанты Р+ , pro , his+ , strr , т.к. частота появления клонов, несущих эти маркеры после конъюгации была такой же, как и у клеток реципиента до конъюгации /10 / и не зависела от гесА гена.
Колицин и иммунитет к нему. Плазмида Col 1Ъ-Р9 определяет синтез одноименного колицина и иммунитет к нему колициногенной клетки. Синтез колицина в норме зарепрессирован. Клонирование ко-лицинового локуса показало, что гены синтеза колицина lb и белка иммунности к нему расположены рядом на плазмидной ДНК / Uemura , Mizobuchi , 1982; Воробьева и др., 1982/. При изучении экспрессии локуса, ответственного за синтез колицина ГЬ , в системе синтеза белка in vitro синтезировался белок с мол.массой 67000. Этот белок обладает убивающей активностью, соответствующей колици-ну 1Ъ . Кроме этого белка в ниэкомолекулярной области электрофореза в 10-20% полиакриламидном геле были обнаружены полипептид с мол.массой 13000 и два полипептида с мол.маесой меньше 10000. Было высказано предположение, что эти белки имеют отношение к иммунитету и репрессии гена колицина /Воробьева и др., 1982/.
Индукция мутаций под действием УФ-облучения
Мутация шшС , полученная в 1977 году Като и Шиноура / Zato , Schinoura , 1977/ полностью блокирует мутагенез, индуцированный УФ-светом и ММС и немного снижает выживаемость клеток после УФ-облучения. Мутации uvm , аллельные umuC оказывали аналогичное действие на клетки E.coli /steiiiborn , 1978, 1979/.
Данные по действию плазмиды Col 1Ъ-Р9 после УФ-облучения му тантов umuC и uvm представлены на рисунке ІІА,Б. В изогенных штаммах с нормальными репаративными свойствами, ТК701 и ла , плазмида ведет себя так же, как и в других штаммах, диких в отношении репарации /рис. ПА,Б/. Плазмида увеличивает также УФ-резис-тентность клеток с мутациями штС и шш. . При этом защитный эффект плазмиды был значительно выше в клетках мутанта шшС , чем в изогенном штамме шшС . в присутствии плазмиды в клетках с мутацией umuC достигался более высокий уровень выживаемости, чем в клетках изогенного шшС штамма с плазмидой /рис. НА/, Сходная картина наблюдалась в мутантах uvm /рис. ІІБ/.
В проведенных нами исследованиях действия плазмиды col ГЬ на выживаемость клеток E.coli , дефектных по различным путям репарации - это единственный случай, когда в присутствии плазмиды Сої ГЬ-Р9 выживаемость мутантных клеток /генетический дефект которых снижает выживаемость после УФ-облучения/ доходит до уровня даже более высокого, чем у изогенного дикого типа.
Влияние плазмиды Col 1Ъ-Р9 на индукцию синтеза колицина EI
ИСК EI относится к числу SOS функций и зависит отгесА+ и 1ехА+ генотипа /Teesman et al ., 1978/. Молекулярный механизм ИСК EI активно изучался; недавно было показано, что непосредственным репрессором гена колицина EI является белок ІезсА / Ebina et al ,9 1983/.
Чтобы определить, как влияет колициногенная плазмида Col lb на ИСК EI, плазмида Col El была передана с помощью трансформации в клетки E.coli , содержащие плазмиду со1 ГЬ-Р9 . Частота выхода трансформантов в клетках с плазмидой Сої 1Ъ-Р9и без нее была одинаковой, т.е. присутствие в клетках этой плазмиды не приводило к рестрикции Col El ДНК.
Уровень ИСК EI, вызванной УФ-облучением, был снижен в клетках содержащих плазмиду col 1Ъ-Р9/табл.9/. При индуцирующем воздействии НГ эффект плазмиды был таким же, как при действии УФ света: вприсутствии плазмиды в несколько раз снижался процент индуцированных клеток /табл.9/. Аналогичные данные были получены Лиходедом /1971/ при исследовании действия УФ-облучения на ИСК EI в клетках, содержащих плазмидуСої I . Ранее были получены данные Ховарт /Howarth , 1965/, что плазмида Col ГЬ-Р9 снижает ИСК Е2 в клетка? E.coli после УФ-облучения.
Чтобы выяснить, от каких хромосомных генов зависит снижающее ИСК EI действие Сої 1Ъ-Р9, определяли эффект плазмиды в штаммах E.coli , дефектных по репарации и рекомбинации. Синтез колицина Е] в штамме АВ1157 и его производных очень слабо индуцировался УФ-облучением и НГ, поэтому ИСК EI вызывалась в этих штаммах действием МС /табл.10/. В диком по репарации и рекомбинации штамме АВ1157 присутствие Col 1Ъ Р&нижало процент индуцированных клеток в 2-2, раза по сравнению со штаммом без плазмиды. Эффект этой плазмиды сохранялся также и в мутанте, дефектном по эксцизионной репарации /АВ1886 uvrA /.
В мутантах по гесА и 1ехАгенам, как известно, резко, на несколько порядков, снижен уровень спонтанной ИСК EI; на спонтанную индукцию синтеза колицина ГЬ-Р9 мутации эти почти не влияют / Hardy et al ., 1973/. Введение в клетки гесА"" и ІехА" плазмиды Col 1Ъ-Р9 не компенсировало необходимость в продуктах генов гесА и 1ехА для ИСК EI. МС не индуцировал синтез колицина EI в клетках, мутантных по генам гесА иІехА /концентрация МС 0,1 мкг/мл/ и в клетках с мутацией в генегесВ /концентрация МС 0,1 мкг/мл/ с плазмидой Сої ГЬ и без нее /табл.10/. Передать Col El ДНК в штамм JC3S81 с Col ГЬ-Р9не удалось.
