Введение к работе
Актуальность проблемы
Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в последние годы в лечении опухолевых заболеваний системы крови, борьба за продление жизни пациентов сохраняет свою актуальность до настоящего времени. Одной из ведущих причин гибели больных продолжают оставаться инфекционные осложнения. Число возможных этиологических агентов этих осложнений достаточно велико - бактерии, грибы и вирусы. Подверженность больных смешанным инфекциями обусловлена нарушениями в клеточном и гуморальном звеньях иммунитета, расширением входных ворот, вследствие повреждения кожи, слизистых оболочек, длительной катетеризацией центральных вен, активизацией эндогенной инфекции. Особенно часто такие осложнения наблюдаются у больных при проведении им высокодозовой химиотерапии или после осуществления больному трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, когда организм ослаблен как за счет опухолевого заболевания, так и за счет использования агрессивных программ терапии и иммуносупрессивной терапии (Бессмельцев С.С., Абдулкадыров К.М., 2004).
У онкогематологических больных и реципиентов гемопоэтических стволовых клеток тяжелые инфекционные осложнения выявлены у 42% умерших (Голенков А.К., Луцкая Т.Д. и др. 2012). Риск возникновения тяжелых бактериальных, грибковых, вирусных инфекций существенно повышается при развитии гранулоцитопении. Особенно высок риск развития инфекционных осложнений при уровне гранулоцитов менее 0,1109/л. (Бессмельцев С.С., Абдулкадыров К.М., 2004). В целом частота инфекционных осложнений при гемобластозах достигает 60-70%, при этом цитомегаловирусная (ЦМВ) инфекция встречается у 22–45% больных, ассоциированные инфекции – у 20–30%. Разработка эффективных методов терапии позволила добиться значительных успехов в лечении бактериальных и грибковых инфекций. Благодаря своевременному и грамотному применению антибактериальных препаратов, летальность больных гемобластозами с глубокой нейтропенией от инфекционных осложнений снизилась с 50% до 10% (Schimpff S.C., 1997).
Определенные результаты достигнуты в лечении вирусных инфекций. Внедрение мониторинга ЦМВ-виремии и превентивной терапии ЦМВ-инфекции привело к значительному снижению встречаемости ЦМВ болезни у иммунокомпрометированных пациентов (Балашов Д.Н., Шелихова Л.Н. и др. 2010; Ширяев С.Н., Боровкова А.С. и др., 2012; Ljungman P., 1997).
Тем не менее, вирусные инфекции, остаются актуальной проблемой для больных с иммуносупрессиями. Наиболее изученным из группы герпесвирусов является цитомегаловирус. Мало исследованы респираторные вирусы, хотя они играют большую роль в развитии инфекций у онкогематологических больных (Чеботкевич В.Н., Румель Н.Р., Абдулкадыров К.М., 2001; Whimbey E, Champlin RE, Couch RB. et al., 1996). Высокая частота вирусных инфекций наблюдается у больных лейкозами, особенно при использовании современных методов высокодозовой химиотерапии (Йовдий А.В., Шардаков В.И. и др., 2012). Течение вирусных, в частности герпетических инфекций, у данных групп больных, как правило, тяжелое и при отсутствии своевременной диагностики и терапии может угрожать жизни пациентов (Исаков В.А., Исаков Д.В., 2012).
Не меньшую проблему представляет инфекционный контроль донорской крови т.к. гемотрансфузионная терапия широко используются для лечения онкогематологических больных. Современные методы контроля донорской крови позволили до минимума снизить риск гемотрансфузионных инфекций. Этого удалось добиться совершенствованием отбора доноров, широким набором тестов скрининга крови на основные инфекционные агенты и внедрением эффективных методов инактивации патогенов в гемокомпонентах (Колотвин В.В., 2012; Кузнецов О.Е., Матвеев А.В. и др., 2012; Селиванов Е.А., Чечеткин А.В. и др., 2012). Значительно сложнее обеспечить инфекционную безопасность гемотрансфузий у иммуносупрессивных больных, для которых инфекционные агенты представляют смертельную опасность. К ним в первую очередь относятся вирусы группы герпеса.
Для диагностики вирусных инфекций у больных чаще всего используют молекулярно-биологические методы, в частности ПЦР. При необходимости обследования большого количества образцов при скрининге донорской крови на вирусы гепатита и ВИЧ разрабатываются методы ПЦР мультиплексного анализа в формате минипулов (Горская О.А., Попова М.В. и др., 2012). Разработаны методы ПЦР в реальном времени в мультиплексном формате и для выявления герпесвирусов среди доноров крови (Кузнецов О.Е., Матвеев А.В. и др., 2012). Однако предлагаемый в настоящее время спектр наборов для определения вирусов группы герпеса не полон и не позволяет проводить одновременную детекцию всех типов вирусов этой группы. Дальнейшее совершенствование методов диагностики возможно при использовании нанотехнологических методов, в частности биочипов. Анализ с использованием биологических биочипов - один из новейших и наиболее быстро развивающихся методов современной биологии и медицины. Эффективность применения биочипов обусловлена возможностью параллельного проведения большого числа специфических взаимодействий молекул биополимеров. При этом удается в достаточно простых экспериментах собрать и обработать на отдельных элементах биочипа огромное количество биологической информации (Мирзабеков А.Д., 2002, 2003), что особенно важно при необходимости проведения массовых исследований, в частности, при скрининге донорской крови и необходимости индикации большого количества инфекционных агентов в биоматериалах.
Таким образом, разработка новых методов диагностики инфекционных осложнений у онкогематологических больных с использованием биологических биочипов является актуальной проблемой в современной гематологии и вирусологии. Аналогичная работа до настоящего времени не проводилась, что и послужили основанием для проведения настоящего исследования.
Цель исследования.
Определение частоты и значимости вирусных инфекций у онкогематологических больных и маркеров герпесвирусов у доноров крови и совершенствование диагностики герпесвирусных инфекций путем использования олигонуклеотидных биочипов.
Задачи исследования:
-
Выявить частоту респираторных и герпесвирусных инфекций у онкогематологических больных.
-
Установить частоту выявления маркеров герпесвирусных инфекций у доноров крови.
-
Определить диагностическую ценность методов иммуноферментного анализа (ИФА) и полимеразной цепной реакции (ПЦР) при выявлении герпесвирусов у больных и доноров крови.
-
Разработать олигонуклеотидный биочип для выявления герпесвирусов человека и определить возможность его использования для индикации вирусов в биологическом материале.
Научная новизна исследования.
Впервые в России проведен мониторинг на расширенный спектр инфекционных агентов, включающий 15 возбудителей респираторных инфекций и вирусов группы герпеса. Установлен высокий удельный вес респираторных вирусов в структуре инфекционных осложнений у больных различными формами гемобластозов (до 62%).
Показано, что развитие острой пневмонии у онкогематологических больных в 42% случаев происходит на фоне активации вирусов группы герпеса, из которых наибольшую роль играет вирус Эпштейна-Барр.
Проведено изучение молекулярно-биологических (в ПЦР) маркеров герпесвирусных инфекций у доноров крови. Установлено, что чаще у доноров выявлялись маркеры активной ВЭБ инфекции (4,6%), реже других герпесвирусов (ЦМВ - 0 %, ВПГ1/2- 0,2% и ВГЧ6 -1,75%).
Разработан биочип для определения вирусов группы герпеса в биологическом материале (крови, ликворе, моче и др.).
Впервые показана возможность использования биочипа для эффективной идентификации различных герпесвирусов у онкогематологических больных.
Практическая значимость
На основании полученных данных о распространенности респираторных вирусных инфекций у онкогематологических больных представлено обоснование для проведения исследований на маркеры этих вирусов с помощью ПЦР в реальном времени.
Использование этих исследований в комплексе с общепринятыми бактериологическими и микологическими исследованиями позволит проводить раннюю этиотропную терапию инфекционных осложнений у больных.
Разработан и апробирован олигонуклеотидный биочип для выявления герпесвирусов человека и доказана возможность его использования для индикации вирусов биологическом материале (в крови, ликворе, слюне, мазки из зева и носа, моче и др.).
Определена частота выявления серологических (ИФА) и молекулярно-биологических (ПЦР) маркеров ЦМВ герпесвирусных инфекций у доноров крови, показана возможность и целесообразность выделения группы серонегативных доноров. Из-за вероятности сероконверсии эти лица требуют периодического контроля.
