Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы. 16
1.1 Молекулярная визуализация в онкогематологии для оценки инициального поражения, раннего ответа на терапию и остаточного заболевания у пациентов с лимфомами. Использование позитронно-эмиссионной томографии с 3 -дезокси-3 -18F-флуоротимидином в диагностики онкологических заболеваний. 16
1.2 Роль молекулярной визуализации в неинвазивной оценке новых методов лечения (адоптивная Т-клеточная терапия) при лечении онкологических заболеваний и для лечения вирусных осложнений у пациентов после ТГСК. 31
1.3 Роль ген-направленной терапии фермент пролекарство для создаваемых ген-репортерных систем. 47
ГЛАВА 2. Материалы и методы. 55
2.1 Характеристика больных включенных в данную работу, ПЭТ и анализ результатов, клиническая оценка и наблюдение. 55
2.2 Характеристика методик использованных для выполнения in vitro и in vivo экспериментов 63
2.2.1 Ретровирусные векторы 63
2.2.2. Клеточные линии и их культивирование 64
2.2.3 Проточная цитофлуометрия и флуоресцентная микроскопия 65
2.2.4 Трансдукция и селекция Т-клеток 66
2.2.5 Анализ цитотоксической функции Т -клеток в отношении специфических клеток-мишеней 67
2.2.6 Стимуляция Jurkat клеток in vitro и in vivo 67
2.2.7 Оценка накопления радиофармпрепаратов: 2-флюоро-2 -деокси-1--D- 68 арабинофуранозил-5-этилурацила (FEAU) и пенцикловира (PCV) в трансдуцированных U87 клетках и накопления FEAU трансдуцированными Т-клетками in vitro 2.2.8 Оценка чувствительности к лекарственным препаратам 68
2.2.9 Экспериментальные группы животных 69
2.2.10 Компьютерная томография 69
2.2.11 Оценка накопления радиопроб, меченных изотопом 18F, – FEAU и 9-[4-флюоро-3-(гидроксиметил)бутил]гуанина (FHBG) 70
2.2.12 Измерение накопления радиомеченных проб в образцах тканей 70
2.2.13 Гистологический анализ 71
2.3 Статистическая обработка материала. 71
ГЛАВА 3. Результаты исследования 72
3.1 Прогностическое значение оценки инициального поражения и раннего ответа на терапию при помощи ПЭТ с 18F-ФЛТ у пациентов с неходжкинскими лимфомами 72
3.2. Создание и оценка ген-репортерных систем на основе человеческого гена деоксицитидинкиназы, для использования в клинических протоколах неинвазивной визуализации результатов клеточной терапии 79
3.2.1 Создание и in vitro оценка химерных ген-репортерных с истем на основе деоксицитидинкиназы человека 80
3.2.2 In vivo неинвазивная оценка экспрессии химерных ген-репортерных систем на основе гена деоксицитидинкиназы человека, обладающих специфичностью к радиофармпрепаратам производным пиримидинов в экспериментальных животных с помощью ПЭТ 85
3.3 In vitro оценка и неинвазивное мониторирование распределения и З
локализации опухоль-специфических Т -клеток трансдуцированных CAR и ген -репортерной системой
3.3.1 In vitro оценка эффективности трансдукции человеческих Т -лимфоцитов ген-репортерной системой и CAR, и оценка их функциональной активности 88
3.3.2 ПЭТ/КТ визуализация локализации адоптивных опухоль-специфических Т-клеток трансдуцированных ген-репортерной системой и CAR 93
3.3.3 Гистология и иммунофлюоресцентный анализ образцов опухолевой ткани 96
3.4. Создание и оценка двойной ген-репортерной системы для визуализации двух независимых молекулярно биологических процессов в пределах одного организма (визуализация локализации и активация ген-модифицированных Т -клеток) 97
3.4.1 Создание и in vitro оценка химерных ген-репортерных систем обладающих специфичностью к радиофармпрепаратам производным пуринов 98
3.4.2 Неинвазивная визуализация экспрессии ген-репортерных систем обладающих специфичностью к радиофармпрепаратам производным пуринов в экспериментальных животных с помощью ПЭТ 103
3.4.3 Создание и in vitro оценка химерных ген-репортерных систем обладающих специфичностью к радиофармпрепаратам производным пиримидинов 106
3.4.4 Неинвазивная визуализация экспрессии химерных ген-репортерных систем обладающих специфичностью к радиофармпрепаратам производным пиримидинов в экспериментальных животных с помощью ПЭТ. 110
3.4.5 Сравнительная, неинвазивная in vivo оценка экспрессии вновь созданных ген-репортерных с истем на основе мутированного варианта HSV1k, обладающих специфичностью к радиофармпрепаратам производным пуринов и/или пиримидинов в пределах одного организма с помощью ПЭТ. 112 3.5 Создание и тестирование двойной ген-репортерной системы для визуализации локализации и оценки CD3 и/или CAR-зависимой активации Т -лимфоцитов. 116
3.5.1 In vitro оценка эффективности флюоресцентной визуализации и количественной оценки CD3 и CAR-зависимой активации Т -лимфоцитов, трансдуцированных NFAT-регулируемой ген-репортерной системой 116
3.5.2. ПЭТ визуализация локализации и CD3-зависимой активации Т -лимфоцитов на модели Jurkat инфильтратов используя двойную ген-репортерную систему 121
3.6. In vivo неинвазивная оценка возможности элиминации опухолевых клеток экспрессирующих ген-репортерные системы A167Ysr39tk и/или dCKDM 125
Обсуждение 132
Выводы 140
Практические рекомендации 143
Сокращения 145
Список литературы 147
- Роль молекулярной визуализации в неинвазивной оценке новых методов лечения (адоптивная Т-клеточная терапия) при лечении онкологических заболеваний и для лечения вирусных осложнений у пациентов после ТГСК.
- Проточная цитофлуометрия и флуоресцентная микроскопия
- Создание и оценка ген-репортерных систем на основе человеческого гена деоксицитидинкиназы, для использования в клинических протоколах неинвазивной визуализации результатов клеточной терапии
- Создание и оценка двойной ген-репортерной системы для визуализации двух независимых молекулярно биологических процессов в пределах одного организма (визуализация локализации и активация ген-модифицированных Т -клеток)
Введение к работе
Актуальность проблемы. За последние десятилетия многообещающие методы лечения на основе генной и клеточной терапии перешли из лабораторной в клиническую стадию исследования. Значительную роль во внедрении данных методов в широкую практику играет прогресс в совершенствовании мониторинга терапевтического эффекта, в частности с помощью методов неинвазивной молекулярной визуализации. Молекулярная визуализация как комплекс методов может быть определена как «визуализация процессов на молекулярном ур овне в реальном времени». Выделенная в отдельное направление около двадцати лет назад, в настоящее время молекулярная визуализация представляет собой сплав клиники, фармакологии, функциональной диагностики и ядерной медицины со значительным влиянием клеточной и молекулярной биологии, химии, радиохимии и физики элементарных частиц (R.Blasberg, 2002). Широкое использование молекулярной визуализации в лабораторной практике стало одним из основных источников получения информации о механизмах и путях регуляции практически всех значимых онкогенов и онкопротеинов (R. Blasberg, 2002), факторов лекарственной устойчивости (H.Bigott, 2005), неоангиогенеза (R.Rossin, 2007; J.Massague, 2008), пролиферации (D.Solit, 2006) и метастазирования злокачественных клеток (M.Scholz, 2007), что способствует более глубокому пониманию биологических процессов гемопоэза и канцерогенеза, и созданию новых методов диагностики и лечения гематологических и онкологических заболеваний.
Биомаркерная, или «суррогатная», визуализация основана на мониторировании
вторичных молекулярно-генетических мишеней и отражает внутренние молекулярно-
генетические процессы. Примером подобного подхода является визуализация молекул
фтордезоксиглюкозы меченной 18F (18F-ФДГ) с помощью позитрон-эмиссионной
томографии (ПЭТ) у пациентов с гематологическими и онкологическими заболеваниями
(C.Hoekstra, 2000). Использование 18F-ФДГ у пациентов с опухолями различного генеза в
том числе и с лимфомами, для инициальной диагностики и оценки ответа на терапию в
настоящее время становится неотъемлемой частью лечебных протоколов. Накопление 18F-
ФДГ в тканях прямо пропорционально метаболизму глюкозы в клетках. Однако,
повышенный метаболизм клетки далеко не всегда свидетельствует о ее
злокачественности, что в свою очередь влияет на специфичность данного метода. В ряде доклинических и клинических исследований была показана зависимость между накоплением радиофармпрепарата аналога тимидина (3’-дезокси-3’-18F-флуоротимидин (18F-ФЛТ)) при ПЭТ и пролиферативной активностью клеток, что в отличии от метаболизма глюкозы можно считать более специфичным маркером для оценки роста опухоли (M.Wagner, 2003). 18F-ФЛТ являясь производным тимидина и отражая активность
клеточной пролиферации, может служить косвенным маркером для оценки механизмов транспорта и метаболизма целого ряда радиофармпрепаратов производных нуклеозидов создаваемых для других типов молекулярной визуализации в частности с использованием репортерных генов.
Поиск высокоспецифичных биологических методов лечения основанных на естественных механизмах распознавания и удаления чужеродного антигена без повреждения здоровых тканей организма, привел к разработке методов адоптивной клеточной иммунотерапии. Адоптивная иммунотерапия (от англ. аdopt - усыновить) – это метод клеточной терапии, при котором пациенту вводятся иммунные эффекторные клетки крови, атакующие специфические мишени. Это отличает адоптивную иммунотерапию от клеточных вакцин, которые предполагают активную иммунизацию и, следовательно, образование эффекторных клеток in vivo. Примером адоптивной иммунотерапии может являться терапия лимфоцитами, активированными интерлейкином-2 (IL-2) ex vivo. Введение адоптивных опухолеспецифических Т-клеток пациентам с онкологическими заболеваниями является фундаментально новым экспериментальным методом, имеющим значение для изучения процессов опухолевой иммуно-патофизиологии. Введение антигенспецифических цитотоксических Т -лимфоцитов оказалось эффективным в лечении инфекций, вызванных реактивацией цитомегаловируса (ЦМВ) и вируса Эпштейна-Барр (ЭБВ) после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) при ряде онкологических заболеваний (H.Einsele, 2002; M.Dudley, 2003; S.Gottschalk, 2005; K.Straathof, 2005; Heslop, 2010; Uhlin, 2010; Feuchtinger, 2010; Peggs, 2011).
Необходимым условием адоптивной противоопухолевой терапии является мониторирование распространения, локализации и специфической активации вводимых пациентам с терапевтическими целями опухолеспецифических Т -клеток, которое позволяет проводить контроль и коррекцию иммунотерапии в режиме реального времени в соответствии с наблюдаемым терапевтическим эффектом и предотвращать развитие возможных нежелательных реакций.
Наиболее адекватным методом для мониторирования п ротивоопухолевой
клеточной терапии является неинвазивная молекулярная визуализация в частности с
использованием репортерных генов (A.Jacobs, 2001; M.Iyer, 2005; I.Penuelas, 2005;
P.Acton, 2005; A.Minn, 2005; M.Doubrovin, 2007). Общее научное направление применения
репортерных генов для неинвазивной визуализации с использованием радиоактивно
меченных проб было впервые описано в середине 90-х годов XX века, однако и по сей
день ведется поиск оптимальных пар репортерный ген и репортерная проба для
избирательной визуализации молекулярно-биологических процессов. Создание
оптимальных моделей, в частности с применением репортерных генов, позволит проводить неинвазивную визуализацию (мониторирование) ген-модифицированных Т -клеток в клинических протоколах клеточной терапии у пациентов с гематологическими и онкологическими заболеваниями в режиме реального времени.
Цель исследования
Контроль эффективности противоопухолевой химио- и иммунотерапии у больных гематологическими и онкологическими заболеваниями с помощью неинвазивной оценки биологических процессов онко-, гемо- и иммуно-генеза методами молекулярной визуализации.
Задачи
-
Определить прогностическую взаимосвязь накопления ПЭТ с 18F-ФЛТ (маркера пролиферации) при инициальной диагностике поражений у пациентов с диффузной В-клеточной крупноклеточной лимфомой и после 1-го курса лечения с результатами противоопухолевой терапии.
-
Оценить возможность неинвазивного определения пролиферативной активности опухоли при использовании радиофармпрепаратов – аналогов тимидина для стандартизации результатов ген-репортерной визуализации у пациентов.
-
Обеспечить повышение чувствительности и специфичности визуализирующих методов исследования биологии опухолей и противоопухолевого ответа путем создания комплексных ген-репортерных систем в том числе с генами человеческой природы, позволяющих осуществлять доклиническую разработку (in vitro, in situ (флуоресцентная микроскопия и FACS)), и клиническое тестирование in vivo неинвазивными методами радионуклидной диагностики с использованием позитрон-эмиссионной томографии.
-
Оценить сохранность функциональной активности и специфичности различных клеточных линий, включая человеческие Т-клетки трансдуцированные созданными ген-репортерными системами и химерным антиген специфическим рецептором.
-
Провести мониторинг локализации, персистенции и оценку активации ген-модифицированных Т -клеток используя созданные ген-репортерные системы с соответствующим радиофармпрепаратом путем неинвазивной ПЭТ-визуализации. Оценить возможность суицидальной элиминации введенных клеток, трансдуцированных созданными ген-репортерными системами из организма пациента при необходимости.
Научная новизна
В данной работе впервые:
была проанализирована эффективность использования ПЭТ с 18F-ФЛТ для оценки пролиферативной активности клеток у пациентов с диффузной В -клеточной крупноклеточной лимфомой в сравнении с ПЭТ с 18F-ФДГ и выполнена оценка прогностического значения накопления 18F-ФЛТ до начала лечения и после 1-го курса противоопухолевой терапии у данной группы пациентов.
разработаны и испытаны ген-репортерные системы, на основе гена тимидин киназы вируса простого герпеса 1-го типа и гена деоксицитидинкиназы человека, обладающие специфичностью к радиофарпрепаратам производным пуринов A167Ysr39tk/GFP; и производным пиримидинов R176QYsr39tk/GFP и dCKDM для динамической, неинвазивной, оценки различных молекулярно-биологических процессов в пределах одного организма.
продемонстрирована возможность стабильной, эффективной трансдукции Т -клеток, здоровых доноров, ген-репортерными системами A167Ysr39tk/GFP, dCKDM/GFP и химерным антиген специфическим рецептором; доказано сохранение функциональной активности ген-модифицированных Т-клеток.
проведен долгосрочный неинвазивный мониторинг введенных ген-модифицированных Т-лимфоцитов трансдуцированных dCKDM/GFP ген-репортерной системой и химерным рецептором.
создана NFAT-регулируемая двойная ген-репортерная система, позволяющая проводить неинвазивную оценку активации Т-лимфоцитов в режиме реального времени in vitro и in vivo при помощи ПЭТ.
проведена оценка «суицидальной» активности в созданных ген-репортерных системах: A167Ysr39tk с ганцикловиром и dCKDM с цитарабином, на различных клеточных линиях, как in vitro, так и in vivo.
Научно-практическая значимость
Результаты выполненного анализа дают основания заключить, что использование ПЭТ/18F-ФЛТ, не уступает по своей диагностической значимости в определении инициальных очагов поражения при сравнении с ПЭТ/18F-ФДГ, но позволяет в зависимости от интенсивностиего накопления проводить н еинвазивную дифференциальную диагностику различий пролиферативной активности опухолей и нормальных клеток.
Установленная взаимосвязь между значениями инициального накопления 18F-ФЛТ и
результатом лечения (достижение полной и /или парциальной ремиссии) помогает в
стратификации пациентов на группы риска и как следствие, в выборе протокола лечения. Использование ПЭТ с 18F-ФЛТ дает возможность проводить раннюю оценку ответа на терапию и показывает взаимосвязь между накоплением 18F-ФЛТ с выживаемостью без прогрессии, помогает в определении группы пациентов с плохим прогнозом на ранних этапах проводимой терапии и дает возможность использования альтернативной терапии у таких пациентов для достижение лучших результатов лечения.
Использование разработанных и протестированных ген-репортерных систем, обладающих специфичностью к радиофармпрепаратам производным ациклогуанозинов и/или пиримидинов, дает возможность изучать различные (два и более) молекулярно-биологические процессы в пределах одного организма с помощью ПЭТ. Созданная и апробированная в Т-клетках человека ген-репортерная система, на основе человеческого гена деоксицитидинкиназы, позволяет использовать ее для неинвазивного мониторирования Т-клеток при адоптивной Т-клеточной терапии.
Наличие «суицидальной активности» в мутированных вариантах гена тимидинкиназы HSV-1 и деоксицитидинкиназы человека к пролекарствам ганцикловиру и цитарабину, соответственно, позволяет элиминировать введенные ген-модифицированные Т-клетки из организма при необходимости.
Использование созданной NFAT-индуцированной двойной ген-репортерной системы, для ПЭТ, позволит осуществлять мониторинг локализации и количественной оценки CD3- и CAR - зависимой активации ген-модифицированных Т-лимфоцитов, что дает возможность проводить оценку эффективности Т-клеточной терапии и проводить ее коррекцию. Дополнительно, и спользование NFAT-индуцированной двойной ген-репортерной системы для визуализации и количественной оценки активации Т -лимфоцитов in vivo в экспериментальных целях позволяет проводить как фундаментальные исследования молекулярно-биологических процессов, происходящих с Т -лимфоцитами in vivo, так и разрабатывать новые подходы к диагностике и лечению состояний, при которых информация о локализации и функциональном состоянии Т-клеток может влиять на прогноз и тактику терапии.
Внедрение в практику
1) Начаты клинические испытания репортерных систем для визуализации ген-модифицированных цитотоксических Т -лимфоцитов с искуственным рецептором в онкологическом Центре Мемориал Слоан-Кеттеринг, Нью-Йорк, США.
-
ПЭТ с 18F-ФЛТ предложен для включения в протокол клинических испытаний визуализации поражений у пациентов с лимфомами в онкологическом центре Мемориал Слоан-Кетткринг, Нью-Йорк, США.
-
Мультифункциональная репортерная система на основе гена деоксицитидинкиназы человека используется для неинвазивной визуализации и мониторирования экспериментальных моделей иммунного ответа в условиях адоптивной клеточной терапии ген-модифицированными цитотоксическими Т-лимфоцитами в лаборатории Молекулярной Визуализации исследовательского центра М. Цукермана, Нью-Йорк, США.
Роль молекулярной визуализации в неинвазивной оценке новых методов лечения (адоптивная Т-клеточная терапия) при лечении онкологических заболеваний и для лечения вирусных осложнений у пациентов после ТГСК.
Создание и оценка двойной ген-репортерной системы для визуализации двух независимых молекулярно биологических процессов в пределах одного организма (визуализация локБиомаркерная или «суррогатная» визуализация основана на мониторировании вторичных молекулярно-генетических мишеней и отражает внутренние молекулярно генетические процессы. Данный тип визуализации является наиболее привлекательным направлением для развития и клинического внедрения в ближайшее время. Главным основанием для этого является наличие большого числа радиофармпрепаратов и методов, которые можно использовать для мониторинга путей регуляции молекулярно биологических процессов на молекулярном уровне, имеющих значение для развития онкологических заболеваний. Примером подобного подхода является визуализация молекул глюкозы, меченных изотопом 18F, с помощью ПЭТ (27). В настоящее время 18F флуородеоксиглюкоза широко используется у пациентов с онкологическими заболеваниями, как с целью диагностики, так и для оценки ответа при назначении химио и лучевой терапии (8, 28-30). Метод «опосредованной» неинвазивной молекулярной визуализации основан на использовании репортерных генов с соответствующей репортерной пробой, что значительно повышает специфичность и как следствие диагностическую значимость в сравнении с «суррогатной» визуализацией. Именно гематология и онкология стали основными областями приложения достижений молекулярной визуализации. Так, применение молекулярной визуализация в гематологоии и онкологии играет существенную роль в инициальной диагностике, стадировании, оценки раннего ответа на терапию и определении остаточного заболевания. Метод молекулярной визуализации с использованием репортерных генов позволяет изучать процессы специфической активации, миграции и пролиферации Т -лимфоцитов, при адоптивной клеточной терапии, что представляет особый интерес для фундаментальной и клинической гематологии, онкологии и иммунологии.
Неходжкинские лимфомы (НХЛ) представляют собой гетерогенную группу злокачественных лимфопролиферативных заболеваний, различающихся по биологическим свойствам, морфологическому строению, клиническим проявлениям, ответу на терапию и прогнозу. Диффузные В -крупноклеточные лимфомы (ДВККЛ) -самые частые виды НХЛ высокой степени злокачественности, для которых характерно агрессивное течение с плохим прогнозом. В последние годы возможности эффективного лечения НХЛ, особенно ДВККЛ, значительно улучшились с введением в практику комбинированной иммунохимиотерапии – сочетания курсов полихимиотерапии (ПХТ) с использованием химерного моноклонального анти-CD20 антитела ритуксимаба, которая стала стандартом лечения этой опухоли (31, 32). Однако около 30% больных ДВККЛ не достигают стойкой ремиссии после терапии первой линии и, в конечном итоге, умирают от прогрессии заболевания. Современная терапия 2-й линии, базирующаяся на использовании высокодозной химиотерапии с последующей аутологичной трансплантацией стволовых клеток, эффективна у 30%-35% пациентов, не ответивших на терапию или рецидивировавших после терапии первой линии (33). Поэтому проблема повышения эффективности лечения все еще актуальна и продолжаются исследования в разных направления с целью решения этой задачи.
Очевидно, что клиницистам очень важно иметь надежные «прогностические маркеры», которые инициально можно использовать для выбора максимально эффективной программы лечения, а в динамике выполнения этой программы - как критерии оценки эффекта, основываясь на которых можно было бы проводить коррекцию терапии. Эти проблемы решают уже много лет, прогностические показатели постоянно обновлялись по мере появления все более информативных диагностических методик. На основании тщательного изучения всех проявлений НХЛ было установлено, что несмотря на появление современных подходов, все еще значимыми факторами неблагоприятного прогноза остаются известные давно клинико-лабораторные показатели, такие как возраст больного (старше 60 лет), общее состояние больного, повышение уровня лактатдегидрогеназы в сыворотке крови, распространенность и локализация опухоли при наличии более одного экстранодального очага поражения. Эти показатели вошли в международный прогностический индекс (МПИ), определение которого является стандартным при оценке прогноза для пациента (34).
Однако, даже в рамках одной прогностической группы пациентов со сходным МПИ существуют значительные различия в результатах лечения, что дает основание продолжать поиск более четких прогностических критериев.
Мониторинг эффективности лечения, как правило, осуществляется по оценке размера опухоли с помощью компьютерной томографии (КТ). К сожалению, по данным КТ даже с использованием различных препаратов с целью контрастирования очагов поражения, невозможно определить различия между опухолевой тканью и остаточным образованием (фиброз, некроз). Кроме того, оценка раннего ответа на терапию при помощи КТ не является достоверной методикой, потому что для уменьшения размеров опухоли на фоне проводимой терапии может потребоваться длительное время. Разработка и и спользование методов молекулярной визуализщации, основанных на определении различных радиофармпрепаратов (РФП) при помощи позитрон-эмиссионной томографии (ПЭТ), в дополнении к существующим неинвазивным методам оценки параметров первичной опухоли, этапного или раннего ответа на терапию может стать тем «прогностическим маркером», значение которого будет, безусловно, коррелировать с исходом заболевания. Была показана эффективность ПЭТ с фтордезоксиглюкозой (18F-ФДГ) в диагностике ДВККЛ и доказана высокая чувствительность данной методики в определении очагов опухолевого поражения (35-37). Показана взаимосвязь м ежду накоплением 18F-ФДГ в остаточной опухоли после окончания терапии и выживаемостью (36-38). В ряде работ изучалась прогностическая значимость исследований ПЭТ/КТ с 18F-ФДГ на ранних стадиях лечения и было показано, что выполнение промежуточной-ПЭТ (П-ПЭТ) после 2-4 курсов ПХТ с ритуксимабом может помочь определить пациентов с высоким риском развития рецидива (39-41). Однако, до настоящего времени не обнаружена достоверная корреляция между накоплением 18F-ФДГ при выполнении П -ПЭТ и риском развития рецидива или прогрессии заболевания у пациентов с НХЛ высокой степени злокачественности. Отсутствие корреляции отчасти связано с наличием противоречивых результатов, получаемых в исследованиях. Так, у некоторых пациентов отмечена длительная безрецидивная выживаемость несмотря на положительный результат накопления 18F-ФДГ после П-ПЭТ (40-43).
Использование ПЭТ с 18F-ФДГ в онкологии и у пациентов с лимфомами, в частности для инициальной диагностики и оценки ответа на терапию, в настоящее время становится неотъемлемой частью протоколов ведения таких больных и является одним из наиболее чувствительных и специфичных методов. Накопление 18F-ФДГ в тканях прямо пропорционально метаболизму глюкозы в клетках, что, в свою очередь, не всегда является приоритетом опухолевых клеток и, таким образом, влияет на специфичность данного метода. Тот факт, что специфичность накопления 18F-ФДГ далека от идеальной, заставляет вести беспрерывный поиск РФП с лучшей тропностью к опухолевой ткани. В ряде доклинических и клинических исследованиях была показана зависимость между накоплением 18F-ФЛТ при ПЭТ и пролиферативной активностью клеток, что в отличие от метаболизма глюкозы можно считать более специфичным маркером для оценки опухоли (44-47). ализации и активация ген-модифицированных Т -клеток)
Проточная цитофлуометрия и флуоресцентная микроскопия
Первым опытом явилось исследование, начатое в 1991 году, по лечению рака яичника у 9 пациентов с III стадией заболевания в рецидиве после лечения платиной и таксолом (187). У одного из пациентов была зарегистрирована полная ремиссия, длившаяся в течении года. Ряд клинических исследований I/II фазы были проведены с целью определения токсичности и подбора безопасной дозы вирусного вектора, используемого для доставки суицидального гена тимидинкиназы-HSV1 у пациентов с различными онкологическими заболеваниями. Herman и совт. в своей работе с экспериментальной терапией пациентов с раком простаты оценили токсичность и терапевтический ответ при использовании схемы HSV1k/GCV, где в качестве средства доставки применялся аденовирусный вектор. Восемнадцать пациентов, включенных в исследование, были разделены на четыре группы. Первая и третья группы состояли из четырех пациентов и по пять пациентов было включено во вторую и четвертую группы. Начиная с первой группы и по возрастающей, пациенты получили от 1х108 до 1х1011 вирусных частиц. Только у одного пациента из 4-й группы получивших самое высокое количество частиц отПервым опытом явилось исследование, начатое в 1991 году, по лечению рака яичника у 9 пациентов с III стадией заболевания в рецидиве после лечения платиной и таксолом (187). У одного из пациентов была зарегистрирована полная ремиссия, длившаяся в течении года. Ряд клинических исследований I/II фазы были проведены с целью определения токсичности и подбора безопасной дозы вирусного вектора, используемого для доставки суицидального гена тимидинкиназы-HSV1 у пациентов с различными онкологическими заболеваниями. Herman и совт. в своей работе с экспериментальной терапией пациентов с раком простаты оценили токсичность и терапевтический ответ при использовании схемы HSV1k/GCV, где в качестве средства доставки применялся аденовирусный вектор. Восемнадцать пациентов, включенных в исследование, были разделены на четыре группы. Первая и третья группы состояли из четырех пациентов и по пять пациентов было включено во вторую и четвертую группы. Начиная с первой группы и по возрастающей, пациенты получили от 1х108 до 1х1011 вирусных частиц. Только у одного пациента из 4-й группы получивших самое высокое количество частиц отмечалось развитие тро мбоцитопении четвертой степени и гепатотоксичности третьей степени. Три пациента ответили на терапию снижением уровня простат-специфичного антигена (PSA) в сыворотке крови больше чем на 50%, которое сохранялось от 6 недель до 1 года. Таким образом, впервые была показана безопасность использования схемы HSV1k/GCV, где в качестве метода доставки применялся аденовирусный вектор и, впервые, продемонстрирована противоопухолевая активность суицидальной генной терапии у пациентов с раком простаты (188).
Klatzmann и совт. в исследовании у 8-ми пациентов с метастазирующей меланомой оценили безопасность применения суицидальной генной терапии с использованием в качестве метода доставки суицидального гена, клеток М11, продуцирующих ретровирусный вектор. Несмотря на то, что у всех пациентов включенных в исследование был отмечен прогресс за болевания, при последующем длительном наблюдении была отмечена хорошая переносимость суицидальной генной терапии. Развившиеся очаги некроза в опухолях трансдуцированных HSVk у 3-х из 8 пациентов после введения GCV могут служить признаком потенциальной э ффективности данной терапии (189). Еще в одной работе на 16-ти пациентах с метастазами в печени при раке толстой и прямой кишки была показана безопасность использования аденовирусного вектора в качестве метода доставки суицидального гена при инъекции непосредственно в ткань опухоли в дозе 1х1013 вирусных частиц (190).
Опухоли центральной нервной системы, в частности глиобластомы, стали одной из наиболее часто используемых моделей в клинических исследованиях с применением HSV1k/GCV схемы. Вероятнее всего это связано с тем, что на поздних стадиях этот вид опухолей часто не подлежит ни хирургической ни лучевой терапии, а выживаемость, даже при отсутствие отдаленных метастазов, очень низкая. В этом случае использование суицидальной генной терапии, дополнительно к стандартным методам терапии, выглядит перспективным на фоне результатов полученных в экспериментах на животных. Более того, предварительно проведенные исследования с ретровирус-опосредованной трансдукцией клеток глиобластомы геном тимидинкиназы-HSV1 и с последующим, системным введением GCV показали хорошую переносимость и эффективность у пациентов (191-193).
Rainov и совт. в 2000 г. опубликовали данные законченного мультицентрового, рандомизированного, клинического исследования у пациентов с многоформной глиобластомой, которое хотя и не показало статистически достоверной разницы в эффективности терапии с дополнительным использованием суицидальной генной терапии по сравнению с группой пациентов получавших стандартную терапию, но подтвердило безопасность и выполнимость данной методики в клинических условиях. В исследование было включено 248 пациентов с впервые диагностированной, раннее нелеченной многоформной глиобластомой. Пациенты были разделены на две группы: первая группа получала стандартную терапию (хирургия+лучевая терапия), тогда как вторая группа получала стандартную терапию и суицидальную ген терапию. Вирусный вектор, несущий ген тимидинкиназы-HSV1 вводился в опухоль во время оперативного вмешательства, далее через 14 дней начиналось внутривенное введение GCV (в дозе 5 мг/кг х 2 раза в день в течение 1 часа, в течение 14 дней). Медиана выживаемости в первой группе составила 365 дней против 354 дней в группе где дополнительно использовалась генная терапия, а доля 12 месячной выживаемости составила 55 и 50% в контрольной группе и в группе с использованием генной терапии, соответственно (194).
Создание и оценка ген-репортерных систем на основе человеческого гена деоксицитидинкиназы, для использования в клинических протоколах неинвазивной визуализации результатов клеточной терапии
Были успешно созданы и протестированы новые репортерные гены, обладающие специфичностью в отношении радиофарпрепаратов ациклогуанозиновых (A167Ysr39tk) и пиримидиновых (R176Qsr39tk) производных. Репортерный ген A167Ysr39tk может быть использован как суицидальный ген в сочетании с GCV и как репортерный ген с радиофармпрепаратом -ЬНВСг для ПЭТ у пациентов, получающих производные пиримидинов. Несмотря на минимальную активность в отношении ациклогуанозиновых производных, репортерный ген R176Qsr39tk может быть использован в комбинации с ациклогуанозинспецифическим репортерным геном A167Ysr39tk для совместной ПЭТ-визуализации двух независимых клеточных популяций или молекулярно-биологических процессов в одном организме при последовательном введении радиофармпрепаратов Ь Т7Т7 Создание и тестирование двойной ген-репортерной системы для визуализации локализации и оценки CD3 и/или CAR-зависимой активации Т-лимфоцитов.
Одним из ключевых моментов в процессе активации Т-клетки через Т-клеточный рецептор (TCR) является активация ядерного фактора активированных лимфоцитов (nuclear factor of activated lymphocytes (NFAT)), являющегося транскрипционным фактором для различных цитокиновых генов, в том числе для гена интерлейкина-2 (ИЛ-2). Селективная экспрессия репортерного гена в результате активации NFAT позволяет: 1) оценить антигенспецифичность исследуемой популяции Т -лимфоцитов, трансдуцированных репортерной системой; 2) выявить популяции Т-клеток с полной или неполной антигенспецифичной активацией по данным иммунофенотипирования маркеров активации; 3) оценить эффективность антигенпрезентации при использовании антигенпрезентирующих клеток для создания антигенспецифичных цитотоксических Т -лимфоцитов.
In vitro оценка эффективности флюоресцентной визуализации и количественной оценки CD3 и CAR-зависимой активации Т -лимфоцитов, трансдуцированных NFAT-регулируемой ген-репортерной системой
С целью оценки мониторинга CD3- и CAR-зависимой активации in vitro, а в дальнейшем и для in vivo неинвазивной оценки, клетки предшественники Т-лимфоцитов человека (Jurkat), были трансдуцированы: 1) химерным антиген специфическим рецептором (Pz1); 2) ген-репортерной системой A167Ysr39tk/GFP с селективной экспрессией репортерного гена при активации NFAT (репортерный ген находится в транскрипторной зависимости от искусственного NFAT-промотора (NFAT-A167Ysr39tk/GFP)); 3) химерным репортерным геном dCKDM/RFP, экспрессия которого находится под контролем постоянного промотора LTR (рис. 38, а, б, в).
При помощи проточного сортирующего цитофлюориметра (по флюоресцентному сигналу RFP и APC), и после селекции клеток с использованием неомицина (500мкг/мл) была получена клеточная популяция с максимальной позитивной трансдукцией (рис. 39). При контрольной проточной цитофлюометрии более чем 90% Jurkat клеток стабильно экспрессировали Pz1 (окраска при помощи APC) и ген-репортерную систему dCKDM/RFP находящуюся под индукцией постоянного LTR промотера (рис. 39, в, г). Эффективность трансдукции Jurkat клеток, векторами несущими Pz1 и dCKDM/RFP, составила 85% (рис. 39, г). Следует отметить, что без проведения специфической стимуляции Jurkat клеток, при контрольной проточной цитофлуометрии, экспрессия GFP в Jurkat клетках, трансдуцированных ген-репортерной системой NFAT-A167Ysr39tk/GFP, не превышала 1%, (рис. 39, в).
Оценка экспрессии химерного рецептора Pz1 и ген -репортерных систем NFAT-A167Ysr39tk/GFP и dCKDM/RFP. а – нетрансдуцированные Jurkat клетки (контроль); б - экспрессия NFAT-A167Ysr39tk/GFP и dCKDM/RFP; в – экспрессия NFAT-A167Ysr39tk/GFP и Pz1; г – экспрессия dCKDM/RFP и Pz1. Данные проточной цитофлюориметрии.
Чрез 24-48 часа после начала in vitro стимуляция Jurkat клеток анти-CD3 антителами или на PC3 клетках, несущих простат специфический мембранный антиген (PC3PIP), с помощью проточной цитофлюориметри, выполняли оценку активированных Jurkat клеток, тр ансдуцированных индуцируемой ген-репортерной системой NFAT-A167Ysr39tk/GFP. Нетрансдуцированные Jurkat клетки служили в качестве негативного контроля. Полученные данные проточной цитофлюориметрии представлены на (рис. 40). трансдуцированными экспериментальными векторами до и после их стимуляции анти-CD3-антителами. Накопление 3Н-FEAU в Jurkat клетках, трансдуцированных Pz1 NFAT-A167Ysr39tk/GFP и dCKDM/RFP, мало отличались друг от друга при его оценке в клетках до и после стимуляции и были статистически значимо выше (р 0,05), чем накопление в нетрансдуцированных Jurkat клетках. Накопление 3Н-PCV в нестимулированных Jurkat клетках, трансдуцированных Pz1, NFAT-A167Ysr39tk/GFP и dCKDM/RFP, не отличалось от накопления в нетрансдуцированных клетках. Однако, после стимуляции, полученные значения н акопление 3Н-PCV были статистически значимо выше (р 0,05), чем в трансдуцированных Jurkat клетках до стимуляции и нетрансдуцированных клетках.
Результаты представлены на основе трех независимых экспериментов. N/T – не трансдуцированные; NS – не стимулированные; S – стимулированные. Полученные результаты позволили сделать следующие выводы: 1) накопление радиофармпрепаратов in vitro является достаточным для проведения подобного эксперимента in vivo; 2) было получено подтверждение специфического накопления радиофармпрепаратов и зависимость от активации NFAT-индуцируемого промотора после стимуляции трансдуцированных Jurkat клеток CD3-антителами. Накопления 3Н-FEAU в клетках, трансдуцированных dCKDM подтвердило специфичность данной ген-репортерной системы к радиофармпрепаратам производным пиримидинов. Тогда как, накопление 3Н-PCV было отмечено только в клетках, трансдуцированных NFAT-A167Ysr39tk/GFP после их стимуляции (как результат активации NFAT-зависимой ген-репортерной системы, репортерный ген которой обладает специфичностью к радиофармпрепаратам производным пуринов).
ПЭТ визуализация локализации и CD3-зависимой активации Т-лимфоцитов на модели Jurkat инфильтратов используя двойную ген-репортерную систему ПЭТ-визуализация CD3-зависимой активации Jurkat клеток in vivo проводилась как описано в «Материалах и методах». По достижении инфильтратами размеров 0.5-1.0 см в диаметре, что было необходимо для их достаточной васкуляризации, в нутривенно вводили радиофармпрепараты 18F-FEAU и 18F-FHBG. Вначале оценивалось накопление РФП, до стимуляции, в Jurkat инфильтратах из клеток, экспрессирующих Pz1, NFAT-A167Ysr39tk/GFP и dCKDM/RFP. Первым водили 18F-FEAU, через 24-часа вводили 18F-FHBG. ПЭТ исследование выполняли через 2-часа после введения вышеуказанных РФП. До стимуляции было получено высокое накопление 18F-FEAU, в то время как накопление 18F-FHBG было неотличимо от фонового сигнала (рис. 42, а, б).
Создание и оценка двойной ген-репортерной системы для визуализации двух независимых молекулярно биологических процессов в пределах одного организма (визуализация локализации и активация ген-модифицированных Т -клеток)
В отличие от ПЭТ с 18F-ФЛТ, прогностическая значимость промежуточного исследования ПЭТ с 18F-ФДГ у пациентов с лимфомой высокой степени злокачественности была оценена у относительно большого количества больных. Предварительные исследования показали, что оценка изменений метаболической активности после первых трех курсов химиотерапии у пациентов с лимфомой может стать значимым прогностическим маркером как для оценки OS так и для PFS (40, 212, 213). Однако, гетерогенность опухолевой популяции, широкая вариабельность сроков проведения исследований ПЭТ с 18F-ФДГ после окончания циклов или их очередности не позволяет систематизировать и достоверно оценить значения полученных данных. Кроме этого Moskowitz и соавт. показали, что у большинства пациентов страдающих ДВККЛ с положительным результатом, накопление радиофармпрепарата 18F-ФДГ, после выполненной промежуточной П ЭТ было получено отрицательное гистологическое заключение (43). Такое различие вероятнее всего отражает отсутствие выраженной корреляции между ранним ответом на терапию и скоростью изменения метаболической активности в новообразовании. Альтернативное использование 18F-ФЛТ, отражающего пролиферативную активность клеток опухолевого образования может выявить более достоверную взаимосвязь между оценкой раннего ответа на терапию по накоплению РФП и прогнозом заболевания. Результаты нашего исследования продемонстрировали корреляцию между PFS и отрицательным результатом в накоплении 18F-ФЛТ после П-ПЭТ (рис. 9 и рис. 11). Значения SUVmax были достоверно выше у пациентов с диагностированным рецидивом или прогрессией заболевания чем у пациентов без рецидива. Было показано, что полученные значения SUVmax 18F-ФЛТ после П-ПЭТ мало отличались от значений SUVmax полученных после З -ПЭТ у пациентов с остаточным образованием диагностированном на КТ. Данное наблюдение позволяет предположить более тесную временную взаимосвязь между снижением пролиферативной активности опухолевых клеток по сравнению с их метаболической активностью в ответ на лечение и, как следствие, дает возможность проводить оценку раннего ответа на терапию, используя ПЭТ с 18F-ФЛТ.
Анализ полученных данных показал, что использование ПЭТ с 18F-ФЛТ у пациентов с ДВККЛ высокой степени злокачественности не уступал по своей диагностической значимости ПЭТ с 18F-ФДГ на инициальном этапе диагностики и после окончания терапии. Была установлена взаимосвязь между значениями инициального накопления 18F-ФЛТ и результатом лечения: пациенты у которых после окончания лечения была зарегистрирован полный ответ, инициально имели значения накопления 18F-ФЛТ ниже чем пациенты с частичным ответом. Дополнительно было показано, что использование ПЭТ с 18F-ФЛТ дает возможность проводить раннюю оценку ответа на терапию на 10-12 сутки после окончания первого курса, что как минимум на 6 недель раньше, чем время оценки с ФДГ. Для получения достоверных диагностических критериев, позволяющих стратифицировать пациентов по исходу заболевания при лимфомах высокой степени злокачественности на основе накопления 18F-ФЛТ необходимо дальнейшее изучение на большей группе пациентов со строгим соблюдением сроков выполнения ПЭТ с 18F-FLT и интервалов между курсами противоопухолевой терапии, что позволит систематизировать полученные данные и определить, может ли данная методика выступать в качестве адекватного «прогностического маркера». Дополнительно, определение пролиферативной активности клеток опухоли, используя 18F-ФЛТ, позволяет комплексно оценить активность транспортной и фосфорилирующей системы клетки. Такая возможность оценки может быть использованы для нормализации 134 показателей накопления радиофарпрепаратов производных нуклеозидов при их количественной оценке у пациентов с помощью ПЭТ в других методах молекулярной визуализации, в частности с использованием репортерных генов.
Вирусные инфекции остаются частой причиной заболеваемости и смертности у пациентов с иммуносупрессией после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток . Хорошо известны основные возбудители инфекций – это цитомегаловирус, Эпштейна–Барр вирус и аденовирус. Хотя общее количество случаев развития ЭБВ-ассоциированного лимфопролиферативного заболевания в пострансплантационном периоде не так велико, использование стандартной терапии не всегда бывает успешным. Во многих клинических исследованиях была показана безопасность и эффективность адоптивной иммунотерапии как в отношении вирусных заболеваний (развившихся у пациентов после ТГСК ) так и в лечении новообразований. Залогом эффективного, широкого использования клеточной терапии является возможность ее неинвазивного контроля. В этой связи использование молекулярной визуализации, в частности с применением репортерных генов, может существенно повлиять на прогресс Т -клеточной терапии и вывести ее на существенно новый уровень.
Нами были успешно созданы репортерные гены на основе мутированных вариантов гена HSV1k и гена деоксицитидинкиназы человека, обладающие специфичностью к радиофармпрепаратам пуриновых и пиримидиновых производных соответственно, для изучения различных (двух и более) молекулярно-биологических процессов в пределах одного организма с помощью ПЭТ.
Так, на основе гена человеческой деоксицитидинкиназы (dCK) был успешно создан и протестирован репортерный ген (dCKDM). Из всех известных деоксирибонуклеозидкиназ человека, dCK играет основную роль в процессе образования 135 монофосфатных форм деоксицитидина (dC), деоксиаденозина (dA), деоксигуанозина (dG) и ряда препаратов-аналогов нуклеозидов, используемых в протоколах лечения больных с онкогематологическими заболеваниями (214-216). Несколькими группами исследователей было показано, что селективные мутации в активном центре dCK улучшают активность белка и расширяют диапазон каталитической активности dCK, включая фосфорилирование деокситимидина (dT) (217-219). Детальный анализ выше изложенных результатов явился основанием для предположения о том, что мутированные варианты dCK, обладающие способностью фосфорилировать dT, могут быть использован в качестве репортерного гена. Были успешно созданы и протестированы различные мутированные варианты dCK в экспериментах in vitro (см. таблица 7, 8 и рис. 12, 13). По результатам in vitro экспериментов был выбран мутированный вариант гена dCK с заменой аргинина на метионин в 104 положении (R104M) и аспарагиновой кислоты на аланин в 133 положении (D133A), для проведения in vivo экспериментов. Результаты in vivo экспериментов достоверно подтвердили, что белок репортерного гена dCKDM обладает специфичностью и высокой фосфорилирующей активностью в отношении радиофармпрепаратов производных пиримидинов для успешного выполнения ПЭТ (см. рис. 14, 15). Созданный репортерный ген dCKDM в сочетании с клинически перспективной репортерной пробой 18F-FEAU может быть использован для неинвазивной визуализации трансдуцированных Т-клеток человека, что и отражено в нашей работе. Было показано, что лимфоциты человека могут быть успешно трансдуцированны dCKDM и химерным антигенным рецептором без изменения фенотипа и функциональной активности ген-модифицированных Т -клеток (см. рис. 17, 18).
