Содержание к диссертации
Введение
Глава 1.Обзор литературы 12
1.1. Актуальность системы обеспечения качества лабораторных исследований 12
1.2. Основные этапы лабораторного анализа и сопряженные с ними проблемы 14
1.3. Примеры циклов проведения ВОК микробиологических исследований 16
1.4. Способы контроля качества количественных методов лабораторной диагностики 21
1.5. Проблемы стандартизации и унификации исследований 22
1.6. Автоматизация субъективных исследований 25
1.7. Качество в микробиологии и инфекционной иммунологии 28
1.8. Современное состояние проблемы качества диагностики урогенитальных инфекций 32
1.9 Микробиологическая диагностика инфекций, передаваемых пре имущественно половым путем 36
Глава 2. Материалы и методы 51
2.1. Общая характеристика пациентов 51
2.1.1. Пациенты с урогенитальными инфекциями 51
2.1.2. Пациенты с установленным диагнозом сифилис 55
2.2. Методы отбора биологического материала 61
2.3. Методы хранения и транспортировки биологического материала 64
2.4. Методы микробиологической диагностики 66
2.4.1. Методы диагностики трихомониаза 66
2.4.1.1. Методы микроскопической диагностики 66
2.4.1.2. Культуральный метод диагностики 71
2.4.1.3. Диагностика методом ПЦР 72
2.4.2. Методы диагностики микоплазмоза 72
2.4.3. Методы серологической диагностики сифилиса 75
2.5. Методы статистической обработки результатов исследований 82
Глава 3. Методологические подходы к процедуре контроля качества методов микробиологической диагностики. оптимизация процедуры контроля качества микроскопической диагностики трихомониаза 83
3.1 Понятие об иерархичности методов диагностики ИПППП 83
3.2 Обоснование принципиальной схемы процедуры контроля качества 84
3.3 Обоснование общей структуры исследования 94
3.4. Результаты микроскопической диагностики трихомониаза 96
3.5. Подходы к стандартизации микроскопической диагностики 138
3.6. Обоснование микроскопической диагностики с использованием систем цифровой обработки изображений 140
3.7. Подготовка контрольных материалов для оценки качества микроскопической диагностики трихомониаза 140
Глава 4. Оптимизация процедуры контроля качества культуральной диагностики микоплазмоза 151
4.1. Результаты культуральной диагностики с использованием различных питательных сред
4.2. Данные исследований по культуральной диагностике урогениталь-ного микоплазмоза
4.3. Результаты контроля питательных сред Liophilm 159
Глава 5. Оптимизация процедуры контроля качества серологической диагностики сифилиса 160
5.1. Результаты изучения специфического гуморального иммунитета при сифилисе 160
5.2. Оценка тест-систем существующих на рынке 161
5.3. Обоснование схемы контроля качества скрининговых тест-систем... 162
5.4. Разработка контрольной панели сывороток 164
5.5. Оценка эффективности скринингового агглютинационного метода серологической диагностики сифилиса на примере ТРРА 168
5.6. Результаты испытания иммуноблоттинга 170
Заключение 180
Выводы 190
Практические рекомендации 191
Список литературы 192
Приложение 216
- Основные этапы лабораторного анализа и сопряженные с ними проблемы
- Пациенты с урогенитальными инфекциями
- Обоснование принципиальной схемы процедуры контроля качества
- Данные исследований по культуральной диагностике урогениталь-ного микоплазмоза
Введение к работе
Актуальность проблемы. Интерес к методам этиологической лабораторной диагностики инфекций, передаваемых преимущественно половым путем (ИШТПП), в последние годы неуклонно возрастает. Это связано с широким распространением, ростом заболеваемости, а также с социальным и экономическим ущербом, которые всегда сопутствуют данной группе инфекционной патологии (Савичева A.M., 2004; Дмитриев Г.А., 2005; Иванов A.M., 2005; Borisenko К.К. et al., 1999; Majeroni B.A., 2007).
Микробиологическая диагностика ИПППП вышедшая в последнее десятилетие на качественно более высокий уровень, позволила перенести основную массу исследований из специализированных научно-исследовательских центров в лаборатории практического здравоохранения (Никулин Н.К., 1999; Аковбян В.А. и др., 2007). Вместе с тем, сложилась парадоксальная ситуация: с одной стороны появились перспективные, доступные и воспроизводимые методы, позволяющие подтвердить этиологию заболевания, с другой - возникли трудности с регламентацией проведения исследований и отсутствием способов управления процессом лабораторной диагностики путем выявления и предотвращения возможных ошибок (Меньшиков В.В., 2003; Рищук СВ., Костючек Д.Ф., 2005; Хоровская Л.А., 2007).
В дерматовенерологической службе России в силу разноплановости методологических подходов, разнообразия проводимых исследований, различного уровня квалификации исследователей, отсутствия необходимого контроля на разных стадиях процесса анализа высока вероятность получения недостоверных результатов, что негативно отражается на выборе средств и схем лечения ИПППП (Бойцов А.Г. и др., 2000).
При выборе метода этиологической диагностики урогенитальной инфекции, оптимального для применения в условиях конкретной диагностической лаборатории на первый план выдвигаются проблемы технического и экономического характера, а вопросы организации контроля качества, как правило, считаются второстепенными (Васильев М.М., 1998; Дмитриев Г.А., 2003).
Однако в настоящее время систематическая оценка качества выполняемых ла бораторных исследований признана неотъемлемой составляющей диагностического процесса (Приказ МЗ РФ №45, 2000; Назаренко Г.И., Кишкун А.А, 2001; Мош-кин А.В., Долгов В.В., 2004, Manual of Clinical Microbiology, 7 ed., 1999). Для большинства методов, используемых в лабораторной диагностике, требования к аналитическому качеству регламентированы руководящими документами (Гаранина Е.Н., 1997; Заикин Е.В. и др., 2000; Карпищенко А.И., Грашин Р.А., 2001; Кишкун А.А., 2004).
Несмотря на то, что лаборатории принадлежит одна из ведущих ролей в установлении диагноза ИІТШІП, обеспечение качества исследований, подразумевающее широкий спектр процедур, начиная с контроля качества оборудования и реагентов, ведения внутрилабораторного контроля и заканчивая проверкой клинической значимости результатов анализов на сегодняшний день, не осуществляется в полном объеме (Кудрявцева М.Б., 2000; Дмитриев Г.А., 2005).
В условиях сохранения неблагоприятной эпидемиологической обстановки по заболеваемости И1И11Д1 в Российской Федерации приоритетной задачей является проведение качественной диагностики этих заболеваний, что подразумевает разработку стандартизованной системы контроля качества работы лабораторий, занимающихся диагностикой ИІТШІП (Фриго Н.В. и др., 2004).
Существующая на данный момент система мониторинга качества диагностики урогенитальных инфекций предполагает обязательное участие КДЛ в программах федеральной системе внешней оценки качества ФСВОК, а также проведение внутрилабораторного контроля (Залесских Н.В., и др., 2004). Оценка качества диагностики ИПППП микроскопическим и серологическим методами осуществляется путем применения набора контрольных образцов - панельного тестирования.
В качестве контрольных образцов для оценки микроскопического метода диагностики ИПППП используются наборы микрофотографий, просматривая которые микроскопист должен сделать вывод о наличии или отсутствии в них возбудителя инфекции. Результаты данной диагностики сравниваются с заключением экспертной группы (Малахов В.Н., и др., 2002). Существующие на данный момент контрольные образцы, по мнению многих авторов, обладают рядом недостатков (Зу рочка А.В., Чукичев А.В., 2000; Егорова О.В., 2004). Коллекции не включают все описанные морфологические формы возбудителей, не используются все методики окраски, применяющиеся на практике. Также недостатком является возможность контроля только метода микроскопии в проходящем свете. Отсутствует алгоритм позволяющий использовать новую микроскопическую технику, обладающую дополнительными средствами визуализации изображения, в качестве средства для улучшения и контроля качества микроскопической диагностики ИІ1ШШ (Колупаев В.Е., 2000).
Контроль качества серологических методов диагностики ИПППП осуществляется посредством использования наборов (панелей) сывороток. В настоящее время отсутствуют официально утвержденные панели сывороток для контроля диагностики урогенитальных инфекций. Имеющиеся наборы представляют высокотит-ражные сыворотки с неизвестными критериями подбора, которые не охарактеризованы по наличию антител к наиболее иммуногенным антигенам возбудителя (Фри-го Н.В., и др., 2004).
Для контроля бактериологических методов диагностики урогенитальных инфекций метод панельного тестирования не применяется. Основными задачами системы мониторинга качества в этом случае является оценка качества питательных сред, и совершенствование интерпретации полученных исследований. Наименее отработаны данные принципы в культуральной диагностике условно-патогенных ИПППП требующих полуколичественного учета (Дмитриев Г.А., 2005). Поэтому требуется создание и внедрение в практику правил внутрилабораторного контроля качества бактериологических методов, предполагающих определение количества возбудителя в исследуемой пробе.
В этой связи возникает настоятельная необходимость совершенствования и внедрения в практику методов контроля качества ИПППП.
Все вышеизложенное и предопределило цель и задачи настоящего диссертационного исследования.
Цель работы: усовершенствовать методы контроля качества микробиологической диагностики инфекций, передаваемых преимущественно половым путем.
Задачи исследования.
1. Оценить состояние контроля качества внутрилабораторного этапа микробиологической диагностики ИППГШ в современных условиях.
2. Оценить возможности стандартизации микроскопической диагностики урогенитального трихомониаза и обосновать основные требования к контролю качества.
3. Определить возможные источники ошибок при проведении культуральной диагностики урогенитального микоплазмоза и обосновать методические подходы к повышению эффективности контроля качества при выявлении Mycoplasma hominis.
4. На примере сифилиса обосновать методы контроля качества серологической диагностики И11111111.
5. Обосновать алгоритмы проведения внутрилабораторного контроля качества микробиологической диагностики ИПППП.
Научная новизна исследования.
Показаны преимущества микроскопической диагностики трихомониаза с помощью принципиально новых оптических приборов - микровизоров, основанных на получении цифрового микроизображения. Впервые предложена серия микропрепаратов, с помощью которых возможно проведение контроля качества микроскопической диагностики трихомониаза с учетом всех, используемых на практике методов, наиболее значимых биологических материалов и атипичных морфологических вариантов возбудителя.
Продемонстрирована взаимосвязь между данными культуральной диагностики урогенитального микоплазмоза при использовании жидких и плотных питательных сред. Обоснована процедура внутрилабораторной оценки диагностической эффективности питательных сред, повышающая точность выявления этиологически значимых концентраций возбудителя.
На примере сифилиса показано, что разработке панелей сывороток, для контроля серологической диагностики, должны предшествовать исследования особенностей образования и динамики специфических антител. Установлено, что контрольные материалы должны быть охарактеризованы по содержанию антител ко всему спектру видоспецифичных микробных антигенов.
Практическая значимость.
Обоснованы предложения по разработке контрольных материалов и к самой процедуре оценки качества микробиологической диагностики ИПППП.
Систематизированы и предложены комплексы организационных мер в виде алгоритмов, позволяющих выявлять диагностические ошибки, и проводить целенаправленные действия, сводящие их возникновение к минимуму.
Разработанные контрольные материалы, в том числе, для оценки микроскопической и серологической диагностики, могут использоваться в условиях практических лабораторий.
Личное участие автора в получении результатов. Автором научно обоснована методология исследования, проанализированы результаты микроскопических, культуральных и серологических тестов, разработаны контрольные материалы для оценки качества микробиологической диагностики ИПППП, создан алгоритм поиска и устранения внутрилабораторных причин дефектов лабораторной диагностики ИПППП.
Автор лично планировал исследования, принимал непосредственное участие в микробиологическом обследовании больных, организовывал и участвовал в проведении всех видов анализа, а также осуществлял контроль качества методов диагностики. Автором лично формировалась база данных, проводилась их статистическая обработка и обобщение полученных результатов.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Применение стандартных, всесторонне охарактеризованных контрольных материалов - важное условие эффективной и достоверной микробиологической диагностики ИПППП.
2. Разработанные материалы для контроля качества микроскопического, куль-турального и серологического методов позволяют повысить эффективность и достоверность диагностики ИПППП.
Реализация и внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в научную, учебную и лечебно-диагностическую работу кафедры и кли ники кожных и венерических болезней, кафедры микробиологии, научно-исследовательского отдела передовых медико-биологических технологий ВМедА им. СМ. Кирова, СПб ГУЗ «КВД №4» и ГУЗ «Областного КВД» (С.-Петербург).
Апробация и публикация материалов исследования. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Санкт-Петербургского общества дерматовенерологов им. В.М. Тарновского (С.-Петербург, 2006, 2008) и Санкт-Петербургского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им И.И. Мечникова (С.-Петербург, 2007); 40-й научно-практической конференции дерматовенерологов и врачей смежных специальностей Санкт-Петербурга «Актуальные проблемы дерматовенерологии. Контроль и профилактика инфекций, передающихся половым путем» (С.Петербург, 2005); научно-практической конференции «Актуальные вопросы дерматовенерологии» (С.-Петербург, 2006); социальном форуме «Югра — территория здоровья» (Ханты-Мансийск, 2007); 2-ой Российской конференции «Иммунология репродукции: теоретические и клинические аспекты» (Сочи, 2007); 1-ой Национальной конференции с международным участием «Нейроинфекции» (Москва, 2007); XI Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (С.-Петербург, 2007); V Европейском конгрессе по протистологии и XI Европейской конференции по биологии беспозвоночных (С.-Петербург, 2007); научно-практической конференции «Актуальные вопросы этиологической диагностики инфекционных заболеваний» (Екатеринбург, 2008).
По материалам исследования опубликовано 27 печатных работ, из которых 9 в реферируемых журналах.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 226 страницах компьютерного набора, состоит из введения, 5 глав (обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав результатов собственных исследований), заключения, выводов, практических рекомендаций, приложения и указателя литературы, включающего 258 источников, в том числе 167 отечественных и 91 зарубежных. Текст содержит 42 таблицы и 14 рисунков.
Основные этапы лабораторного анализа и сопряженные с ними проблемы
Процесс проведения лабораторного исследования принято разделять на три основных этапа: преаналитический, аналитический и постаналитический. Аналитический этап полностью проходит в лаборатории, а два оставшихся этапа имеют как внутрилабораторную так и внелабораторную составляющую (Меньшиков В.В., 1999; Мошкин А.В., 2000; Кишкун А.А., 2003; Petersen P., et al., 1996).
Качество диагностики зависит от способов взятия биологического материала, его обработки, условий хранения и транспортировки, первичной обработки материала, точности выполнения аналитических процедур, а также процедуры интерпретации и выдачи результата исследования. Таким образом, на достоверность результата лабораторного анализа влияют все три этапа. Поэтому основная концепция контроля качества КДЛ включает совершенствование всех технологических и организационных процессов, влияющих на качество лабораторного исследования (Меньшиков В.В., 1995; Эль-Нейджи М.М. и др., 2001).
Преаналитический этап (ПЭ) — это комплекс мероприятий, выполняемых от взятия испытуемого образца до осуществления лабораторных измерений. Анализ ошибок лаборатории, обслуживающей многопрофильную больницу, показал, что только 7% из них произошли на аналитическом, тогда как 47 и 46% — на постаналитическом и преаналитическом этапах соответственно (Мошкин А.В., 2002). В другом исследовании, проведенном в 49 лабораториях поликлиник, сообщается, что 55,6% ошибок были выявлены на преаналитическом, 13,3% — на аналитическом и 27,8% — на постаналитическом этапе (Меньшиков В.В., 2001). Эти результаты красноречиво подтверждают всю необходимость разделения различных этапов лабораторного анализа и как следствие подходов к их контролю, поэтому на ПЭ необходимо строго следовать требованиям к взятию опытных образцов, их хранению и обработке (Меньшиков В.В., 2003).
Проведенный анализ литературных источников позволяет судить, о все большем увлечении специалистов по обеспечению качества подсчетами долей ошибок на разных этапах проведения лабораторного анализа (Меньшиков В.В., 2003; Libeer G.C., 2001). Вместе с тем, как отмечают многие авторы, деятельность направленная на усиление надзора лаборатории за пре- и постаналитическими этапами может оказаться неэффективной, если не проводится регулярный анализ и контроль за непосредственно аналитической фазой исследования, качественное выполнение которой является прямым показателем состоятельности лаборатории. (Тотолян А.А., 2001; Назаренко Г.И., Кишкун А.А., 2001; ЧиликинаГ.В., 2005).
Качество КЛИ на аналитическом этапе (АЭ) определяется на двух уровнях: внутрилабораторный контроль качества (КК) и внешняя оценка качества (ВОК). Стандартизация КЛИ на уровне внутрилабораторного КК заключается в обеспечении нормативных правильности и воспроизводимости измерений. ВОК — это система мер объективной проверки результатов КЛИ, проводимых внешней, независимой организацией для обеспечения сопоставимости результатов лабораторий между собой и с данными международных референсных учреждений (Малахов В.Н., 2000; Меньшиков В.В., 2000). В РФ ВОК осуществляется Федеральной системой (ФС) ВОК. Международная система ВОК работает на основе Международных стандартов ISO и EN 45001 (СРА, Великобритания; CCKLest, Нидерланды; SWE-DAC, Швеция; Labquality, Финляндия) (Тотолян А.А. и др., 2002; Griffin III C.W. et al., 1983).
Диагностическое значение полученного результата определяется его правильной интерпретацией. Именно поэтому не качественно проведенный заключительный, ПЭ диагностики может свести на нет ценность достоверно выполненного анализа (Меньшиков В.В., 1999). Интерпретация имеет особую важность в микробиологии. Оценить результаты микробиологического исследования иногда, бывает достаточно сложно, особенно при культуральном исследовании высококонтамини-рованного материала, при этиологической диагностике полиэтиологических заболеваний, при установлении этиологической роли потенциальных патогенов, оппортунистических патогенов, при одновременном использовании нескольких методов исследований (Скала Л.З. и др., 2004; Михайлова B.C. и др., 2004).
Таким образом, исходя из данных литературы, выделяют три этапа лабораторных исследований, доля непосредственного участия лаборатории в которых разнится. Дополнительного изучения требует процедура оптимизации проведения пре- и постаналитических этапов исследований в микробиологии. Кроме того, отсутствуют литературные данные о действующем алгоритме внутрилабораторного контроля качества важного для лаборатории аналитического этапа микробиологической диагностики венерических заболеваний.
Примеры циклов проведения ВОК микробиологических исследований Приказом Минздрава РФ № 117 от 3 мая 1995 г. было объявлено о создании общенациональной системы ВОК России, которая получила название Федеральной системы внешней оценки качества клинических лабораторных исследований (ФСВОК), и о регистрации КДЛ на участие в ее первом цикле (Приказ МЗ РФ № 117 от 1996 г.; Меньшиков В.В., 2000).
Работа ФСВОК направлена на выявление реальных погрешностей в рутинной работе лабораторий при анализе контрольных проб. Нормативные документы Минздрава РФ определяют, что каждая клиническая лаборатория обязана ежегодно участвовать в ФСВОК. Предъявление свидетельств об участии в ФСВОК в прошлые годы и письма, подтверждающего участие в текущем году, необходимо при аккредитации и инспекционных проверках лабораторий. Нормативные документы Минздрава также обязывают региональные и ведомственные органы управления здравоохранением и главных врачей лечебных учреждений обеспечивать возможность ежегодного участия подведомственных лабораторий в ФСВОК (Приказ МЗ и МП РФ №60 от 1996 г.; Малахов В.Н. и др., 2002).
Участие в ФСВОК подразумевает заключение договора оказания услуг между лабораторией заказчиком и некоммерческим партнерством «Центром внешнего контроля качества клинических лабораторных исследований». На основании данного договора лаборатория участвует во внешнем контроле заявленных видов исследования определяемые исполнителем как разделы ФСВОК.
Из 60 контрольных разделов заявленных ФСВОК в 2006-2007 году наибольший интерес в рамках работы вызвали оценки проведенных циклов по микросколии, бактериологической диагностике и инфекционной иммунологии.
Пациенты с урогенитальными инфекциями
За период проведения исследований (2005-2008) было выявлено и обследовано 1878 больных с УГИ. Из них у 1528 были диагностированы моноинфекции, а у 350 - смешанные УГИ.
С целью уточнения клинико-лабораторных особенностей течения УГИ, дополнительное обследование проводилось совместно со специалистами клиник Военно-медицинской академии им. СМ. ІСирова. Группы обследуемых формировались из пациентов, которые находились на обследовании и лечении в клиниках ВМедА (в том числе в клиниках: кожных и венерических болезней, акушерства и гинекологии), в ОКВГ №442 им. Соловьева, 1-ом Военно-морском госпитале, областном КВД, КВД №4 г. Санкт-Петербурга.
Возраст пациентов составил от 17 до 63 лет и распределился по возрастным группам следующим образом (таблица 2.1). Из представленных данных видно, что значительная часть больных (84,2%) находилась в возрасте до 40 лет.
В структуре обстоятельств выявления УГИ (таблица 2.2) обращает внимание преобладание активного посещения медицинского учреждения пациентами (66,8%). Доля мужчин, активно обратившихся к врачу, превышала таковую у женщин (72,2 и 52,7% соответственно) (р 0,05). Обследование по контакту проходили около 1/5 пациентов (17,2 мужчин и 19,5% женщин) (таблица 2.2). Доля женщин с выявленной УГИ в рамках диспансерного наблюдения составляла 12,8%. Причем все из выявленных при диспансеризации пациенток характеризовались стертость клинических признаков УГИ. Можно предположить, что при реализации планового клинико-лабораторного обследования мужчин, в настоящее время отсутствующего, эффективность контроля за УГИ может существенно повыситься.
Преобладающей моноинфекцией был трихомониаз (33,0%). Другие этиологические агенты инфекций по убыванию выявления располагались в следующей последовательности: Candida spp. - 18,1%; U. urealyticum - 9,7%; M. hominis - 8,0%; условно-патогенная микрофлора - 5,6%; С. trachomatis - 4,6%; N. gonorrhoeae - 1,5%; вирус простого герпеса 1 и 2 типов - 0,6%. Для отработки методологических подходов к контролю качества были выбраны группы пациентов с диагнозом трихомониаз (620 больных) и микоплазмоз (151 больной). В целях оценки информативности методов лабораторной диагностики уроге-нитального трихомониаза из числа всех больных была отобрана группа, состоящая из 75 мужчин и 62 женщин, которых обследовали комплексно, с помощью всех сравниваемых лабораторных методов диагностики. На каждого пациента была заведена электронная история болезни. Углубленному клинико-лабораторному и иммунологическому обследованию были подвергнуты 247 больных в различные периоды сифилиса. Сроки наблюдения за больными от начала заболевания до момента последнего исследования составили от 3 месяцев до 12 месяцев, в среднем 6 месяцев. Диагноз сифилиса у всех больных был установлен на основе анамнеза, эпидемиологического, клинического и лабораторного обследования, а также подтвержден положительными реакциями в стандартных серологических тестах (РСК с кардиолипиновым и трепонемными антигенами, МРП, РПГА, РИФ-абс. и РИТ).
При первичном и вторичном свежем периодах заболевания преобладали мужчины. Относительно низкое количество больных в позднем скрытом периодах объясняется в первую очередь низкой долей данных пациентов в общей структуре заболеваемости сифилисом. Для формирования группы инфицированных в инкубационном периоде существовали также трудности организационного характера, ввиду беспорядочной половой жизни и асоциального поведения больных. Возраст больных колебался от 14 до 72 лет. Их распределение по возрастным группам представлено в таблице 2.7. Из представленных данных видно, что значительная часть больных (72,5%) находилась в возрасте наибольшей половой активности (до 30 лет). Распространенность и характер клинических проявлений у обследованных больных манифестным сифилисом представлены в таблице 2.8. У 19 (65,5%) из 30 больных первичным сифилисом были обнаружены эрозивные шанкры, причем у 6 пациентов они имели вид царапин без инфильтрации в основании. Два и более шанкра имелось у 9 (31,0%) больных. У 16 (55,2%) больных отмечалось появление первичного аффекта одновременно со склераденитом. У 2 (6,8%) больных наблюдалась экстрагенитальная локализация твердого шанкра, проявлявшаяся в виде специфической ангины.
Розеолы были отмечены у 51 из 120 больных вторичным сифилисом, что составило 42,5%. У 11 больных наблюдалось слияние розеол. Папулы ладоней и подошв наблюдались у 33 (27,5%) пациентов, причем у 9 они были единственным клиническим проявлением вторичного рецидивного сифилиса. Папулы в области гениталий отмечены у 37 больных (30,8%). У 14 пациентов наблюдалась мелкоочаговая алопеция. В 10 случаях алопеция развивалась по диффузному или смешанному типу. Лейкодерма встречалась в 19,2% случаев вторичного сифилиса. Частота выявления широких кондилом - 15%.
Контрольную панель составляли 26 образцов сывороток пациентов, больных сифилисом и 2 образца сыворотки крови здоровых доноров (таблица 2.9). Диагноз сифилиса у всех пациентов был установлен на основании анамнеза, данных клинического и лабораторного обследования, а также подтвержден положительными реакциями в стандартных серологических тестах. В качестве контролен в опытах использовались сыворотки крови здоровых доноров. Сыворотки здоровых доноров были получены из лаборатории инфекционной иммунологии НИЛ №6 Военно-медицинской академии им. СМ. Кирова (к.м.н. с.н.с. Бельгесов Н.В.). Донорские сыворотки крови были отрицательными при исследовании в реакциях связывания комплемента с кардиолипиновым и культураль-иым трепонемным антигенами, в микрореакции преципитации с кардиолипиновым антигеном, а также в ИФА.
Обоснование принципиальной схемы процедуры контроля качества
Приступая к планированию схемы контроля качества микробиологических исследований необходимо рассмотреть алгоритм управления качеством количественных методов лабораторной диагностики.
Модель аналитического качества для медицинских лабораторий стран ЕС была разработана рабочей группой европейской ассоциации обеспечения качества в лабораторной медицине EQALM (Petersen P. et al., 1996). Третья составляющая модели — собственно контроль аналитического качества. В каждой медицинской лаборатории слежение за состоянием постоянных факторов (внешних и внутренних должно осуществляться посредством участия в программах внешней оценки качества, состояние переменных факторов оценивают по результатам внутрилабораторного контроля качества).
На рисунке 3.1 подробно раскрыт каждый пункт модели аналитического качества. На этапе планирования качества исследования определяют основы норм точности, зависящие от определенной биологической вариации, медицинских требований, оснащения КДЛ, экспертной оценки. В идеале, результатом этапа планирования качества исследования должен являться нормативный документ стандартизующий процедуру анализа и выдвигающий требование к его качеству.
Этап обеспечения качества это выполнение стандартизованных процедур по сведению к минимуму факторов, отрицательно влияющих на конечный результат исследования. Многообразие факторов влияющих на качество результатов клинических лабораторных исследований представлено в приложении 2. В этот этап также входит проверка материально-технического оснащения лаборатории, выбор оптимального метода исследования и предотвращение отрицательных влияний пре-аналитических ошибок диагностики.
Стадия контроля аналитического этапа лабораторного исследования подразумевает проведение внутрилабораторного контроля и внешней оценки качества. Данные формы контрольных мероприятий, дополняя друг друга, позволяют отслеживать систематические и случайные ошибки постоянных и переменных факторов формирующих аналитическое качество (приложение 3). Исходя из вышеперечисленного, в соответствии с принципиальной схемой микробиологической диагностики инфекционных заболеваний организация процедуры контроля качества представляется следующим образом. На этапе планирова 92
Для обеспечения качественной микробиологической диагностики необходима проверка и соответствие метрологическим нормам лабораторного оборудования. Отсутствие оборудования или использование изношенного, устаревшего, плохо содержащегося оборудования дает ненадежные результаты. Одним из важнейших факторов, влияющих на качество микробиологического исследования, несомненно, является личный фактор или, другими словами, персонал. Качество выполнения микробиологического исследования или постановки теста имеет прямую связь с качеством профессиональной подготовки и образования, личным опытом работника и условиями его найма, взаимоотношениями в коллективе. На результаты исследования большое влияние оказывают факторы внешней среды, в частности, неадекватная окружающая обстановка на рабочем месте, недостаточно или нерационально оборудованное рабочее место, слабая освещенность, плохая вентиляция, неадекватная температура, различные шумы, отсутствие безопасности и другие санитарно-гигиенические условия труда. Очевидную связь с качеством исследования имеют лабораторные материалы. Качество реагентов, химреактивов, красок, лабораторной посуды, питательных сред, лабораторных животных влияет на ценность диагностической информации. В современной лаборатории большая часть времени тратится на проведение преаналитического этапа, поэтому минимизация ошибок связанных с этим этапом является важным в обеспечении качества.
Следует подчеркнуть также роль качественной интерпретации результата. Интерпретация имеет особую важность в микробиологии. Интерпретировать результаты микробиологического исследования иногда, бывает достаточно сложно, особенно при культуральном исследовании высококонтаминированного материала, при этиологической диагностике полиэтиологических заболеваний, при установлении этиологической роли потенциальных патогенов, оппортунистических патогенов.
Для внутрилабораторного контроля и внешней оценки микробиологических методов диагностики возможно применение контрольных материалов позволяющих оценивать воспроизводимость и правильность тестов.
Поскольку в большинстве случаев критерии оценки результатов микробиологических исследований носят субъективный характер и в значительной степени зависят от индивидуального опыта и квалификации исследователя, для их контроля необходимо предусмотреть использование средств, способных документировать полученные результаты, с возможностью их предоставления при инспекционной проверке или кураторском визите.
Таким образом, схема процедуры контроля качества микробиологических исследований должна включать мероприятия по планированию качества, его обеспечению и контролю приводящие в итоге к повышению достоверности выдаваемых лабораторией отчетов об исследовании.
Данные исследований по культуральной диагностике урогениталь-ного микоплазмоза
С учетом того, что возбудители урогенитального микоплазмоза, по мнению большинства ученых, относятся к условно-патогенным микроорганизмам, для оценки их этиологического значения в каждом конкретном случае требуется количественное определение возбудителя в исследуемом материале (Раковская И.В., Вульфович Ю.В., 1995; Семенов Н.В., и др., 2001; Дмитриев Г.А., 2003; Gil-Juarez С, et al., 1996; Baseman J.B., et al., 2004).
Анализ рекомендаций, содержащихся в инструкциях к основным отечественным и ведущим зарубежным тест-системам, позволяет прогнозировать нестандар-тизованность процедуры идентификации микоплазм, которая используется на практике (таблица 4.2).
1 Среда для индикации арги-нинзависимых микоплазм жидкая НПО "Диагност-мед" Титр микоплазм определяют по изменению цвета индикатора в пробирке с разведением исследуемого материала в 10 раз. При изменении цвета среды только в исходной пробирке титр микоплазм соответствует менее 10000 ЦОЕ. При изменении цвета и в исходной пробирке и в пробирке с разведением материала в 10 раз титр более или равен 10000 ЦОЕ.
2 Микоплазма-50 НИИЭМим. Пастера Полуколичественная оценка титра М. hominis 104 ЦОЕ/мл и более производится в соответствии с изменением цвета индикатора в пробирке после разведения исследуемого материала в 10 раз. Результаты проб не учитываются при помутнении среды в пробирке с исследуемым материалом.
3 Mycoplasma Duo Bio-Rad Болезнетворный титр 104 ЦОЕ/мл определяется по изме- Рекомендовано использование транспортной среды. Тест-система позволяет прово нению цвета индикатора при однократном разведении материала в лунке планшета. дить диагностику уреаплазмоза.
4 Mycoplasma system plus Liofilchem Интерпретация полуколичественного определения титра возбудителя производится по изменению окраски в 3 лунках планшета. В первой лунке от 102 ЦОЕ/мл до 104 ЦОЕ/мл. Во второй от 104 ЦОЕ/мл до 105 ЦОЕ/мл и в третей более 104 ЦОЕ/мл. Дополнительно тест-система позволяет производить диагностику уреаплазмоза, трихомониаза и определять чувствительность к антибиотикам мико и уреаплазм. Изменение цвета в лунке 1 соответствует росту 5-20 колоний на питательной среде Mycoplasma Agar А7, во второй лунке 20-50 колоний и в третей лунке свыше 50 колоний. клинические проявления со стороны УГТ воспалительного характера, что позволяло говорить о этиологической роли микоплазм без анализа их количества в исследуемом материале. Одновременно анализ результатов определения титра возбудителя показал, что в значительном числе проб его концентрация не превышает этиологически значимых значений (с соответствии с инструкцией). В то же время, при обследовании 60 лиц с неподтвержденным диагнозом УГИ в 22,7-23,7% случаев были выявлены концентрации микоплазм, способные вызвать развитие воспалительных процессов. На наш взгляд, объяснением данных противоречий могла быть методика стандартного культурального исследования, которая отличается низкой достоверностью. В соответствии с данной методикой производится однократное разведение материала засеянного в жидкую питательную среду в 100 раз и при изменении цвета индикатора делается вывод о количестве материала 104 и более.
Надо отметить, что в инструкциях, в соответствии с которыми производится оценка результатов исследования, практически отсутствуют ссылки на литературные источники, определяющие порядок проведения культивирования микоплазм и не вполне ясна их состоятельность.
Дальнейшие исследования были посвящены определению соотношения ЦОЕ на жидких питательных средах и КОЕ на плотных средах, являющихся информативными критериями оценки количества микроорганизмов в биологическом материале. Была обоснована схема опыта по количественному выделению урогениталь-ных микоплазм на жидких и плотных питательных средах (рисунок 4.1). При этом определяли пороговые концентрации микоплазм, при которых еще происходило изменение цвета жидкой питательной среды при десятикратных разведениях исследуемого материала (т.е. определение титра). Результаты посева из пробирки с пороговой концентрацией микоплазм на плотную питательную среду позволяли произвести расчет соотношения ЦОЕ и КОЕ. Для определения диагностического критерия массивности роста микоплазм в концентрации более 104 было произведено титрование исследуемого материала на жидкой питательной среде, с одновременным высевом материала на две чашки Петри с плотной питательной средой с разведением для последующего подсчета выросших колоний.
В качестве материала для исследования были использованы клинические изо-ляты М. hominis выросшие на жидкой питательной среде "Микоплазма-50" (НИИ-ЭМ им. Пастера). Специфичность роста была подтверждена путем пересева материала на кровяной агар, плотную среду "Хейфлика" (НИЦФ) и исследования методом ПИФ.
Оценку соответствия цветообразующих единиц колониеобразующим производили путем последовательного титрования исследуемого материала до концентрации 10 10. Для этого 100 мкл материала, изменившего цвет индикатора в пробирке, содержащей питательную среду "Микоплазма-50", после подтверждения специфичности роста, переносили в такую же пробирку типа Eppendorf, содержащую 900 мкл свежеприготовленной жидкой питательной среды "Микоплазма-50". После тщательного перемешивания получали разведение исследуемого материала 10" . Одновременно из первой пробирки с исходным материалом осуществляли высев 100 мкл на 900 мкл жидкой среды для дублирующего контроля культуры мико-плазм при пересеве. Для выявления соответствия цветообразующих единиц колониеобразующим из исходной пробирки осуществляли высев материала по 10 мкл на 2 чашки Петри, содержащие плотную питательную среду "Хейфлика" (НИЦФ). Последовательно выполняя данные действия, добивались разведения исходного материала до концентрации 10"10. Пробирки с жидкой средой инкубировали в термостате 72 часа при температуре 37С. Чашки с плотной средой "Хейфлика" помещали в эксикатор со свечой, и инкубировали в термостате при температуре 37С.
В каждой серии разведений клинического материала определяли последнюю и предпоследнюю изменившую цвет индикатора пробирку с жидкой питательной средой. Для этих двух разведений производился учет колониеобразующих единиц. Для этого производился просмотр чашек и подсчет типичных колонии микоплазм в виде «яичницы-глазуньи», который начинали выполнять после 3 суток инкубации, окончательно учитывая их общее количество на 10 сутки.
В рамках раздела "обеспечение качества культуральной диагностики микоплазмоза" проведена оценка существующих методических подходов к полуколичественной интерпретации результатов. Поскольку в нашем исследовании было установлено несоответствие данных результатов диагностики микоплазмоза с использованием жидких питательных сред истинному содержанию микроорганизмов в материале из УГТ, был сделан вывод о низкой эффективности количественного определения М. hominis.
Недостатки такого рода можно избежать, перейдя от качественного определения возбудителя ( 104 ) к полуколичественному. Ними проведено изучение тест системы Mycoplasma System Plus фирмы Liofilchem Diagnostici (Италия) которая предназначена для полуколичественного определения концентрации микоплазм и уреаплазм. 102 титр 104; 104 титр 105; титр 105. Расширение этого спектра позволит избежать ошибок диагностики микоплазмоза.
