Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 15
1.1 Получение ГСК из периферической крови методом лейкоцитафереза 15
1.1.1 Определение оптимального момента для проведения лейкоцитафереза 18
1.1.2 Объем обработанной крови и кратность выполнения лейкоцитафереза 19
1.2 Транспортировка нативных ГСК 22
1.2.1 Влияние продолжительности транспортировки на ГСК 23
1.2.2 Холодовая цепь при транспортировке ГСК 25
1.2.3 Влияние низкочастотных вибраций на ГСК 28
1.3 Редукция объема трансплантационного материала 30
1.3.1 Целесообразность выполнения редукции объема материала 30
1.3.2 Влияние редукции объема материала на ГСК 31
ГЛАВА 2. Материалы и методы 39
2.1 Характеристика пациентов, порядок получения и работы с материалом 39
2.2 Лабораторные методы исследования 46
2.3 Методы математической статистики 49
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 52
3.1 Результаты оптимизации процесса получения ГСК 52
3.1.1 Определение оптимального момента для проведения лейкоцитафереза 52
3.1.2 Управление продолжительностью лейкоцитафереза 56
3.1.3 Алгоритм пролонгирования процедуры лейкоцитафереза 59
3.2 Оценка влияния продолжительной транспортировки на ГСК 61
3.2.1 Метод расчета трансплантационной дозы, с учетом снижения способности ГСК к восстановлению кроветворения в процессе транспортировки 68
3.2.2 Результаты клинической апробации метода расчета 69
3.3 Влияние редукции объема трансплантационного материала на ГСК 73
3.3.1 Эффективность редукции объема материала 73
3.3.2 Негативное влияние редукции объема материала на ГСК 74
3.3.3 Клиническая апробация результатов редукции объема материала 78
3.3.4 Метод оптимизации процесса подготовки трансплантационного материала к криохранению 82
Заключение 84
Выводы 95
Практические рекомендации 96
Список сокращений и условных обозначений 98
Список литературы 99
- Определение оптимального момента для проведения лейкоцитафереза
- Холодовая цепь при транспортировке ГСК
- Лабораторные методы исследования
- Результаты клинической апробации метода расчета
Определение оптимального момента для проведения лейкоцитафереза
Проблематика необходимого количества ГСК для восстановления кроветворения после ВДХТ широко обсуждается. Так, например, мониторинг клеточного состава периферической крови в раннем посттрансплантационном периоде у пациентов с онкогематологическими заболеваниями, показал, что сроки восстановления у них гемопоэза прямо коррелируют с дозой трансплантированных ГСК [34; 50; 76; 83; 91]. При этом доза ГСК, необходимая для восстановления кроветворения, по различным данным составляет 2–3106 ГСК/кг массы тела [31].
Пациентам с множественной миеломой часто показано выполнение повторных курсов ВДХТ с применением АутоТГСК после каждого [28; 84]. При этом рекомендуется заранее заготовить количество ГСК достаточное для двукратной трансплантации, так как повторная заготовка клеток между двумя курсами ВДХТ не всегда возможна [33]. Данные обстоятельства обуславливают особые требования к величине трансплантационной дозы ГСК, которую необходимо заготовить для последующей двукратной аутотрансплантации. Таким образом, пациентам с множественной миеломой необходимо заготовить 4 - 6 х 106 ГСК/кг массы тела, что необходимо сделать в течение однократного курса медикаментозной мобилизации.
Сбор ГСК в ходе их мобилизации осуществляют автоматическим клеточным сепаратором при помощи операции лейкоцитафереза периферической крови. Однако, несмотря на развитие аппаратного лейкоцитафереза и протоколов медикаментозной мобилизации в современной клинической практике, получить достаточную для аутотрансплантации дозу ГСК из периферической крови пациентов удается не всегда [3]. По разным данным у 5 – 45% онкогематологических больных не удается получить даже минимального количества ГСК, достаточного для одиночной АутоТГСК. Учитывая, что при множественной миеломе необходимо заготовить количество ГСК достаточное для двукратной трансплантации, доля неудачных попыток заготовки достигает 40 – 66% [61; 74].
Эти трудности связаны с кинетикой мобилизации ГСК в периферическую кровь, весьма индивидуальной вследствие специфических изменений костного мозга в результате заболевания, проводившегося лечения и возраста пациента [25; 31; 67; 85; 93].
В том числе по этим причинам клиницисты предпочитают назначать данный вид лечения молодым пациентам, не получавшим до этого терапию алкилирующими противоопухолевыми препаратами, вызывающими склерозирование костного мозга. Однако даже такой строгий отбор пациентов для аутотрансплантации не гарантирует отсутствие трудностей при получении ГСК.
Последнее десятилетие основная ставка была сделана на разработку и исследование эффективности различных протоколов медикаментозной мобилизации. Основной любого современного протокола является гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ), который применяется либо в монорежиме, либо в сочетании с цитостатическими препаратами. Применение цитостатических препаратов перед курсом Г-КСФ не только увеличивает выход ГСК, но в том числе позволяет собрать материал с низким риском контаминации опухолевыми клетками и обедненный зрелыми лейкоцитами. Данные преимущества комбинированных схем мобилизации ГСК в сравнении с монорежимом сделали их наиболее распространенными в клинической практике [9; 72]. На сегодняшний день разработан принципиально новый препарат -антагонист CXCR4 (Плериксафор, Plerixafor). Препарат способен конкурентно блокировать молекулы адгезии на ГСК, что вызывает выход клеток из костного мозга с током крови. Применение Плериксафора, в сочетании с препаратами Г-КСФ, по некоторым данным [44; 45; 46; 48] позволяет решить проблему резистентности к медикаментозной мобилизации и тем самым повысить эффективность лейкоцитаферезов. Однако в некоторых исследованиях было показано, что не всегда с помощью данного препарата удается добиться ответа на мобилизацию [37; 76]. В фазе III клинических многоцентровых исследованиях было показано, что у больных с множественной миеломой, в группе с использованием Плериксафора, доза 6106 ГСК/кг массы тела была получена в результате однократного лейкоцитафераза в 72% случаев. Следовательно, у оставшихся 28% пациентов проблема резистентности к мобилизации ГСК не была решена.
Таким образом, на сегодняшний день, трудности, возникающие в ходе медикаментозной мобилизации, приходится разрешать уже в ходе выполнения лейкоцитафереза.
В то время как прогностические факторы, влияющие на успех мобилизации, хорошо изучены, и разработаны многочисленные протоколы медикаментозной мобилизации, последующий лейкоцитаферез по-прежнему воспринимается как стандартная процедура не связанная с индивидуальной кинетикой ГСК в периферической крови в процессе операции. Наиболее спорными вопросами при получении трансплантационного материала является определение момента для проведения лейкоцитафереза, выбор оптимальной скорости обработки крови и кратности данной операции. Использование четкого методического алгоритма проведения лейкоцитафереза, обоснованного индивидуальной кинетикой ГСК в кровотоке, позволит правильно решать эти вопросы в конкретной клинической ситуации.
Холодовая цепь при транспортировке ГСК
Стандартным методом определения количества ГСК является проточная цитометрия, однако точность и воспроизводимость результатов значительно зависит от протокола исследования [29]. В литературе описано несколько протоколов предполагающих различные стратегии гейтирования [52; 82; 90]. Наиболее распространенным протоколом является ISHAGE (International Society for Hematotherapy and Graft Engineering), который позволяет исследовать материал, полученный из любого источника и рассчитывать абсолютное количество ГСК с помощью калибровочных частиц. Для вычитания из результатов поврежденных клеток применяется маркер некроза и апоптоза 7AAD. Фенотип ГСК подлежащих учету согласно данному протоколу: CD45+(dim)/CD34+/7AAD–.
Для выполнения метода проточной цитометрии использовался цитофлуориметр Cytomics FC500 с программным обеспечением «StemCXP», разработанным с учетом стратегии гейтирования ISHAGE и заводской набор реагентов «Stem-Kit», укомплектованный калибровочными частицами «Flow-Count». Контроль качества выполнялся еженедельно с помощью «Stemrol Control Cells». Всё оборудование и расходные материалы производства Beckman Coulter (USA).
Порядок пробоподготовки: 1. Полученные пробы развести изотоническим раствором для получения клеточной взвеси, содержащей лейкоцитов 30 109/л. 2. В пробирки для проточного цитометра внести моноклональные антитела CD45, CD34 и краситель 7AAD по 20 мкл. 3. Добавить клеточную взвесь, полученную в результате разведения в количестве 100 мкл. Перемешать и инкубировать 20 минут. 4. Внести лизирующий раствор (NH2Cl2). Перемешать и инкубировать 10 минут. 5. Добавить 100 мкл калибровочных частиц «Flow-Count», перемешать и выполнить цитометрию. 6. Исследования выполняются в дублях. После подсчета, средняя величина записывается в первичную документацию в единицах ГСК/мкл. Определение колониеобразующей активности. Методы культивирования ГСК применяются уже более 60 лет. Первые десятилетия для этих целей использовались среды, полученные из абортивного материала животных. Данные среды невозможно было стандартизировать, что затрудняло применение культуральных методов с целью количественной оценки колониеобразующей активности ГСК. В настоящее время производятся среды с точным содержанием рекомбинантных цитокинов, что необходимо для достоверной оценки in vitro способности ГСК к кроветворению.
Для определения колониеобразующей активности ГСК были использованы среды заводского производства Methocult H4435 Enriched (STEMCELL Technologies, Canada). Данные среды содержат стандартизованную смесь компонентов: комплекс SCF, ГМ-КСФ, Г-КСФ, интерлейкин-3, интерлейкин-6, эритропоэтин. Лаборатория участвует в программе внешнего контроля качества Proficiency Testing-Frozen CB (STEMCELL Technologies, Canada). Порядок пробоподготовки и выполнения анализа: 1. Полученные пробы разводили в RPMI (STEMCELL Technologies, Canada) для получения конечной концентрации ЯСК 100 000 кл/мл. 2. Полученная клеточная взвесь добавляется к среде Methocult, затем выполняется инкубация в атмосфере СО2 5% в течение 14 суток при влажности 95% и температуре +37С. 3. Полученные колонии подсчитывались с помощью инвертированного микроскопа МИБ-Р (ЛОМО, Россия). 4. Исследования выполняются в дублях. После подсчета, средняя величина записывается в первичную документацию в виде: КОЕ/чашка.
Определение количества лейкоцитов и эритроцитов
Современные лаборатории, как правило, оснащены гематологическими анализаторами, которые быстро и с высокой точностью определяют количество форменных элементов в образце периферической крови. Однако в процессе получения, длительной транспортировки и обработки центрифугированием лейкоконцентрат претерпевает значительные изменения, что часто делает его не пригодным для исследования автоматизированными методами. Например, гематологический анализатор будет занижать показатели лейкоцитов, если у клеток повреждена мембрана, а высокий лейкоцитоз лейкоконцентрата часто вызывает сообщения аппарата об ошибке.
В отличие от анализатора, световая микроскопия в камере Горяева позволяет достоверно определить лейкоциты даже при значительном гемолизе. При микроскопии лейкоконцентрата, подсчету подвергаются ядра клеток, устойчивые к действию технологических факторов
Лабораторные методы исследования
Таким образом, пролиферативный потенциал ГСК после редукции снизился на 47±21,6%. Следовательно, способность материала к восстановлению кроветворения после обработки по Rubinstein оказалась снижена почти вдвое. При этом часть потери пролиферативного потенциала – 22,8%, обусловлена удалением из материала при фракционировании самих ГСК, а часть – 24,2%, снижением пролиферативного потенциала тех ГСК, которые сохранились в материале после обработки по Rubinstein.
В данном исследовании не стояла задача выяснения механизма снижения пролиферативного потенциала ГСК. Однако следует полагать, что такие манипуляции как изъятие из организма ГСК, воздействие на них сильной гравитации при фракционировании, а так же хранение в виде клеточных концентратов не могут не оказывать негативного влияния на функции ГСК. Такое воздействие на ГСК существенно отличается от естественных условий в костномозговых нишах организма, и может являться причиной снижения пролиферативного потенциала ГСК.
Оценивая метод редукции объема трансплантационного материала по Rubinstein на экспериментальной модели пуповинной крови необходимо отметить эффективную управляемую редукцию объема трансплантационного материала и удаление существенной части не значимых для трансплантации клеточных примесей – эритроцитов и гранулоцитов. Установлено, что при этом происходит потеря пролиферативного потенциала ГСК на 47±21,6%, и потеря самих ГСК на 22,8±4,8%.
Принятым критерием достаточности трансплантационной дозы для тандемной трансплантации пациентам с множественной миеломой является количество реинфузированных ГСК из расчета более 6 x 106/кг массы тела пациента. Следовательно, при проведении операции лейкоцитафереза необходимо увеличить заготовку трансплантационного материала с учетом возможной потери 47±22% пролиферативного потенциала ГСК при обработке по Rubinstein. Однако большая величина стандартного отклонения не позволяет точно прогнозировать изменение данного параметра. Кроме того, далеко не во всех случаях возможно увеличить заготовку трансплантационного материала в 1,5–2 раза. Таким образом, учитывая перечисленные выше преимущества и недостатки, выполнение редукции объема трансплантационного материала допустимо, если заготовленная доза ГСК кратно превышает необходимую дозу. Кроме того целесообразно применение автоматизированных устройств, исключающих человеческий фактор и позволяющих прогнозировать результаты редукции с высокой точностью. Однако аппаратов позволяющих автоматизировать процесс редукции трансплантационного материала, полученного из периферической крови, в продаже пока нет. 3.3.3 Клиническая апробация результатов редукции объема материала
В ходе исследования обнаружено, что редукция объема трансплантационного материала увеличивает концентрацию лейкоцитов более чем в 2 раза. Данные результаты получены на модели пуповинной крови, в которой исходное количество лейкоцитов примерно равно таковому в периферической крови. Однако лейкоконцентрат – продукт лейкоцитафереза периферической крови – уже может иметь значительную концентрацию лейкоцитов. Дальнейшее увеличение данного показателя, по мнению ряда авторов, может негативно сказаться на сохранности ГСК в процессе криохранения [14; 64; 78]. Поэтому в рамках решения задачи по оптимизации процесса редукции объема трансплантационного материала необходимо было оценить сохранность ГСК в процессе их криоконсервации при различной концентрации лейкоцитов в лейкоконцентрате.
Корреляционный анализ показал (рис. 8), что сохранность ГСК после введения криопротектора ДМСО прямо зависит от концентрации ЯСК в лейкоконцентрате (r = 0,6; p0,05, N=94). Рисунок 8. График зависимости сохранности ГСК после добавления ДМСО от концентрации лейкоцитов в трансплантационном материале.
Установленная статистическая зависимость данных параметров позволяет провести линию тренда на графике (рис. 8). Линия тренда наглядно показывает – чем выше концентрация лейкоцитов в трансплантационном материале, тем хуже сохраняются ГСК после введения криопротектора.
Таким образом, сохранность ГСК после введения криопротектора ДМСО прямо зависит от концентрации лейкоцитов в лейкоконцентрате. Это соответствует данным полученным в аналогичных исследованиях, но только в плане зависимости данных параметров [14; 64; 78]. В нашем исследовании дополнительно установлено, что снижение сохранности ГСК происходит уже после введения ДМСО в материал, а не в процессе замораживания, как указывают авторы. Криопротектор ДМСО вводится в материал с целью увеличения сохранности ГСК в процессе замораживания-оттаивания. С другой стороны, хорошо известно негативное влияние ДМСО на клетки. Моделирование взаимодействия биологических мембран с различными концентрациями ДМСО [53] показало, что молекулы криопротектора легко проникают внутрь фосфолипидного бислоя, при этом эффект, производимый ДМСО на мембрану, зависит от конечной концентрации криопротектора в растворе. При небольших концентрациях – до концентрации 7,5 % включительно, наблюдается уменьшение толщины бислоя. При концентрациях ДМСО от 10 до 20%, помимо прогрессирующего истончения мембран, наблюдается формирование гидрофильных пор, которое начинается с того, что проникающие в бислой молекулы ДМСО нарушают взаимодействия между головными группами липидов и создают в мембране дефекты. Эти дефекты заполняются молекулами воды, при этом, если количество молекул воды в гидрофобной области мембраны превышает определенное пороговое значение, происходит переориентация головных групп липидов внутрь мембраны с образованием поры. Концентрации ДМСО, превышающие 20%, ведут к разрушению липидного бислоя. Таким образом, было показано, что ДМСО способно негативно влиять на мембраны клеток.
В случаях, описанных в данной диссертации, ДМСО вводился в конечной концентрации 7,5%, т.е. в концентрациях не способных дезинтегрировать фосфолипиды мембран. Однако известно, что процесс проникновения ДМСО внутрь клеток происходит путем пассивной диффузии и растянут во времени. Скорость диффузии ДМСО через клеточную мембрану снижается при пониженных температурах [57]. Учитывая, что перед введением криопротектора материал предварительно охлаждается, скорость диффузии ДМСО еще более замедляется.
Результаты клинической апробации метода расчета
Следовательно, при проведении операции лейкоцитафереза необходимо увеличить заготовку трансплантационного материала с учетом возможной потери 47% пролиферативного потенциала ГСК при обработке по Rubinstein. Однако большая величина дисперсии полученных результатов, обусловленная отсутствием автоматизации метода Rubinstein, не позволяет точно прогнозировать изменение свойств ГСК. Кроме того, далеко не всегда возможно значительно увеличить дозу заготовленного трансплантационного материала. Следовательно, учитывая выше перечисленное, редукция объема трансплантационного материала допустима, если заготовленная доза ГСК кратно превышает необходимую. Кроме того, целесообразно применение автоматизированных устройств, позволяющих управлять редукцией с высокой точностью. Однако аппараты, позволяющие автоматизировать процесс редукции трансплантационного материала, полученного из периферической крови, пока не представлены на рынке медицинской техники.
Кроме того, неизбежным результатом редукции объема трансплантата является увеличение концентрации ЯСК, что ведет к снижению сохранности ГСК при низкотемпературном хранении [24; 42; 60; 65; 71]. Поэтому в исследовании проводилась оценка сохранности ГСК в процессе криоконсервации при высокой концентрации лейкоцитов в трансплантационном материале.
Было установлено, что сохранность ГСК при криоконсервации после введения криопротектора ДМСО прямо зависит от концентрации лейкоцитов в лейкоконцентрате. Это соответствует ранее полученным данным, но только в аспекте зависимости данных параметров [14; 64; 78]. В нашем исследовании дополнительно показано, что снижение сохранности ГСК происходит на этапе введения ДМСО в материал, а не в процессе замораживания, как считалось раньше.
Таким образом, обработка трансплантационного материала по Rubinstein эффективно редуцирует его объем и удаляет клеточные примеси, но приводит к потере пятой части ГСК и достоверно вдвое снижает колониеобразующую активность ГСК. Также необходимо учитывать, что редукция трансплантационного материала ведет к увеличению концентрации ядросодержащих клеток, что также негативно влияет на сохранность ГСК при криоконсервации. Следовательно, принимать решение о выполнении редукции трансплантационного материала необходимо с учетом установленного снижения способности ГСК к восстановлению кроветворения. Если величина трансплантационной дозы полученной к обработке не допускает ее снижения, целесообразно отказаться от редукции объема полученного материала. Часто продукт лейкоцитафереза исходно содержит высокие концентрации ядросодержащих клеток. Такие ситуации возможны, если схема мобилизации не предполагала проведение предварительной цитостатической химиотерапии, и лейкоцитаферез выполнялся на фоне высоких концентраций ядросодержащих клеток. Кроме того, это возможно в тех случаях, когда рост концентрации ГСК достигает приемлемых значений на поздних сроках проведения медикаментозной мобилизации и концентрация ядросодержащих клеток достигает высокого уровня. В любом случае необходимо особое внимание к клеточному сгущению при подготовке материала к хранению. Если лейкоцитаферез выполнялся при высокой концентрации ядросодержащих клеток в периферической крови, целесообразно заготовить аутоплазму. При концентрации ядросодержащих клеток в лейкопродукте выше 150109/л, необходимо разведение лейкоконцентрата аутоплазмой.
Для расчета объема аутоплазмы, которую необходимо добавить в продукт лейкоцитафереза для снижения концентрации лейкоцитов ниже 150109/л, нами разработана следующая формула: где V(аутоплазмы) - объем добавляемой аутоплазмы, мл; V(исход. мат-ла)- объем исходного материала, мл; С(лейкоцитов) - концентрация лейкоцитов в исходном трансплантационном материале, ЯСК109 /л; рекомендуемая концентрация ЯСК в трансплантационном материале, ЯСК109 /л. Разработанный нами метод расчета позволяет определить объем аутоплазмы для разведения лейкоконцентрата в случае необходимости, и предотвратить снижение трансплантационной дозы ГСК при криоконсервации.
Таким образом, решение задач диссертации позволило обосновать и разработать четкий методический подход к получению, транспортировке и подготовке к хранению ГСК, предназначенных для аутотрансплантации при множественной миеломе. Разработанные методы и практические рекомендации просты для применения и не требуют дополнительного оснащения оборудованием. Напротив, предложенный подход позволяет сократить расходы на медикаментозную мобилизацию и увеличить эффективность получения трансплантационного материала. При выполнении транспортировки и подготовке к хранению лейкоконцентрата, содержащего ГСК, предложены способы оценки риска снижения трансплантационной дозы и мероприятия по снижению этого риска. Кроме того, полученные результаты могут служить основой для дальнейшего усовершенствования и автоматизации трансфузиологических технологий, направленных на обеспечение качественным трансплантационным материалом АутоТГСК. Полученные нами результаты апробированы и внедрены в клиническую практику учреждений, выполняющих ВДХТ с поддержкой АутоТГСК – окружного гематологического центра Сургутской окружной клинической больницы, где совместно с Югорском НИИ клеточных технологий проведено более 50 АутоТГСК.
