Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Литературный обзор 14
1. Глутамат и аспартат - естественные возбуждающие медиаторы мозга 14
2. Проведение возбуждения по дендритам 25
3. Особенности холинергического возбуждения 35
4. Холинергическая система мозга 42
Глава II. Методы исследования 50
1. Переживающие срезы мозга: 50
Приготовление срезов 50
Экстраклеточная регистрация и микроионофоретическое подведение медиаторов 51
Температурный режим 53
Маркировка области регистрации 54
2. Кора мозга бодрствующих животных: 55
Экстраклеточная регистрация и способы стимуляции 55
Экспериментальные процедуры 56
Регистрирующая и стимулирующая аппаратура 56
Анализ и статистическая обработка результатов 57
Глава III. Результаты 59
1. Импульсные реакции нейронов коры на подведение возбуждающих аминокислот к соме и дендритам 59
2. Импульсные реакции нейронов коры на подведение ацетил холина к соме и дендритам 71
3. Влияние ацетилхолина на параметры импульсных реакций, вызванных дендритным и соматическим подведением возбуждающих аминокислот 82
4. Температурная чувствительность холинергического процесса 94
5. Сравнительный эффект температуры на спонтанную и вызванную глутаматом активность корковых нейронов 104
6. Реактивность нейронов коры к сенсорным раздражителям и структура активационных импульсных ответов у молодых взрослых кроликов 116
7. Сравнительные характеристики спонтанной и вызванной активности у нейронов коры молодых и старых кроликов 123
8. Влияние ацетилхолина на формирование импульсных реакций корковых нейронов при адаптивном поведении 135
ГЛАВА IV. Обсуждение результатов 143
1. Сравнительная характеристика импульсных реакций соматического и дендритного происхождения 143
2. Эффект ацетилхолина при его ионофоретическом подведении в область сомы и отдельных дендритных локусов 149
3. Температурная чувствительность холинергического процесса и связанных с ним явлений в импульсной активности нейронов 155
4. Формирование спайковых реакций у нейронов коры при разных функциональных состояниях 161
Заключение 169
Выводы 170
Литература 172
Список работ по теме диссертации 205
- Глутамат и аспартат - естественные возбуждающие медиаторы мозга
- Экстраклеточная регистрация и микроионофоретическое подведение медиаторов
- Импульсные реакции нейронов коры на подведение возбуждающих аминокислот к соме и дендритам
- Сравнительная характеристика импульсных реакций соматического и дендритного происхождения
Введение к работе
Исследование механизмов формирования импульсных реакций нейронов является актуальной проблемой нейрофизиологии, так как позволяет определить, какие параметры клеточной активности ответственны за активное восприятие [Скребицкий,1977; Костандов,1983; Сторожук,1990; Полянский и др.,2005], смену функциональных состояний мозга [Cepeda et al.,1989; Сторожук,1990; Pigarev, Nothdurft, Kastner,1997] и его приспособительные возможности [Рабинович, 1975; Кругликов, Коштоянц, Вальцев, 1977; Тимофсева,Котляр,Попович,1982; Кругликов, 1983; Майоров, 1998, 2002; Хохлова, Мержанова, Долбакян,2001]. Трансформация возбуждения , вызванного сенсорной стимуляцией, в импульсный ответ зависит не только от параметров действующего стимула, но в значительной степени определяется внутримозговыми процессами, сопровождающими то или иное явление внешней среды, но непосредственно с ним не связанными [Рабинович,1975; Buzaki,2004]. Следовательно, формирование импульсного ответа является комплексным процессом, расшифровка которого важна как для понимания принципов работы мозга, так и для практического использования с целью разработки мер защиты нервной системы от таких неблагоприятных факторов, как старение, ишемическос воздействие или влияние наркотиков.
В коре мозга, так же как и в большинстве отделов центральной нервной системы, возбуждение осуществляется с помощью глутаматергических синапсов [Segal,1981; Tsumoto, Masui, Sato, 1986; Cotman et al.,1987; Harblitz, Sutor, 1990; Gigg, Tan, Finch, 1992; Kharazia, Weinberg, 1994; Kaczmarec, Kossut, Skangiel-Kramska, 1997; Johansen, Fields, 2004]. Все афферентные системы коры, к которым относятся первичные сенсорные пути, внутрикорковые и транскаллозальные связи, осуществляют влияние на корковые нейроны посредством глутаматергической передачи [Cotman et al., 1987; Gigg, Tan, Finch, 1992; Kobayashi et al., 1993; Kharazia, Weinberg, 1994; Kaczmarec, Kossut, Skangiel-Kramska, 1997]. При аппликации к мембране нейрона глутамат вызывает быструю деполяризацию в результате резкого увеличения проницаемости мембраны в основном для ионов Na+, К+ и Са"1"1-, ток которых осуществляется по концентрационным градиентам [Zieglgansberger, Puil, 1973; Krnjevic, 1974; MacDermott, Dale, 1987]. Поэтому деполяризация глутаматергического происхождения достигает максимума всего за несколько миллисекунд [Curtis,Phillis,Watkins,1960; MacDermott, Dale, 1987] и не зависит от уровня метаболизма в период ее развития [Godfraindetal.,1971].
Возбуждающие глутаматергические контакты в коре локализованы почти исключительно на дендритной поверхности нейронов [Segal,1981; Ichikawa,Arissian,Asanuma,1985; Бабминдра и др.,1988]. Дендриты, таким образом, выполняют функцию рецепции возбуждения, тогда как сома, формирующая спайковый ответ, является коллектором поступающих из дендритов влияний [Шульговский,1977]. Роль дендритов, однако, не ограничивается простым сбором и транспортировкой возбуждений, поступающих от разных источников. Процессы, происходящие в дендритах, разные авторы связывают с возможностью выполнения ими простых логических операций [Аршавский и др., 1966; Mel,1993; Williams, Stuart, 2002], с трансформацией электрических сигналов в биохимический процесс, распространяемый в дальнейшем по структурам дендритного цитоскелста [Косицын, 1976], с обратным влиянием спайковлой активности на механизмы формирования дендритных ВПСП [Larcum,Zhu, Sakmann,1999; Frick,Magee,Johnston,2004; Williams,2004].
Детально разработанной и экспериментально подтвержденной является кабельная теория проведения возбуждения по дендритам [Rail, 1964,1967,1970; Rail et al.,1992], в соответствии с которой эффективность доставки в сому возбуждения из дендритов является важной индивидуальной характеристикой нейрона, определяющей его реактивность на приходящий сигнал. Кабельная теория устанавливает зависимость эффективности дендритного проведения от сложности строения дендритного дерева, удельного сопротивления дендритных мембран и коэффициента дендро-соматической проницаемости, определяемого как отношение входной проводимости дендритов и сомы [Шульговский,1977; CIements,Redman,1988; Rail et al.,1992]. Таким образом, нейрон рассматривается как единая функциональная система со специфическими свойствами. Плодотворность кабельной теории подтверждается наличием у нейронов значительной неоднородности по всем трем составляющим, которые определяют эффективность доставки возбуждения из дендритов в сому. Так, в эволюционном ряду позвоночных отмечено постоянное усложнение структуры дендритов клеток, составляющих высшие интегративные центры, и у человека пирамидные нейроны коры имеют 85 различных типов дендритных ветвлений [Леонтович,в печати]. Корковые пирамиды различаются также размерами клеточных тел [Бабминдра и др., 1988; McCormic et al., 1985] и плотностью К+ каналов на их мембранах. Последнее обстоятельство надежно идентифицируется по разной выраженности постактиваци- онной гиперполяризации, связанной с К+ проницаемостью [McCormick et al., 1985; Карпук,Воробьев,2003; Franceschetti et al.,2003].].
Наибольшим разнообразием по параметру эффективности дендро-сома-тического проведения отличаются пирамидные нейроны коры в связи со значительной неоднородностью их мембранных свойств и многообразием геометрического строения. Среди корковых пирамидных нейронов встречаются клетки с огромной электротонической протяженностью дендритов [Шульговский,Москвитин,Котляр,1975; Шульговский,1977], что исключает возможность для большинства дендритных синапсов эффективно влиять на процесс формирования спайковой активности [Williams,Stuart,2002; London et al.,2002]. Это относится прежде всего к внутрикорковым контактам, которые оказывают очень слабые воздействия на постсинаптическую мембрану со средним деполяризационным сдвигом 0,5 мВ как в ответ на одиночные спайки [Kang, Endo, Araki,1988;Mason, Nicoll, Stratford, 1991;
Гусев, 1994], так и при высокочастотной активации, возникающей в одном из моносинаптически связанных корковых нейронов [Kang, Endo, Araki, 1988; Komatsu et al., 1988; Porter, Sacamoto, Asanuma, 1990]. Такие влияния, создавая непрерывный поток миниатюрных ВПСП на дендритной мембране корковых нейронов, могут стать основой для неспецифических клеточных реакций при условии, что эффективность их воздействия на сому постоянно контролируется неспецифическими структурами мозга.
В нервной системе существует целый ряд химических агентов, основной механизм действия которых состоит в увеличении мембранного сопротивления нейронов в результате блокады трансмембранного К+тока [Krnjevic, Pumain, Renaud, 1971b; McCormick, Prince, 1986; Зеймаль, Щелковников, 1989; Brown et al., 1995, 1997], постоянно текущего через частично открытые
К+ каналы в связи с несовпадением равновесного потенциала для К+ и уровня потенциала покоя [Экклз, 1959]. Важнейшим и наиболее распространенным среди мембранных регуляторов, повышающих удельное сопротивление нейронных мембран, является ацетилхолин [Krnjevic, Pumain, Renaud, 1971b; Krnjevic,1974; McCormick, Prince,1986]. Особенность его эффекта состоит в том, что взаимодействуя с мускариновыми рецепторами он запускает сложный каскад внутриклеточных биохимических процессов [Зеймаль, Шелковников,1989; Brown et al., 1995, 1997], приводящих к повсеместной блокаде К+ проницаемости [Weight et al., 1979; ffrench-Mullen et al., 1983; Brown et al., 1995], равномерно распределенной на обширной мембранной поверхности [Misonou et al., 2004]. Поскольку рост удельного сопротивления дендритных мембран влечет за собой увеличение эффективности дендро-соматического проведения [Rall,1964,1969,1970; Rail et al.,1992], регулирование стационарного К+ тока ацетилхолином может оказаться очень тонким механизмом, влияющим на реактивность корковых нейронов. Это и определило основную цель настоящего исследования.
Цель исследования: Выявление особенностей дендро-соматического проведения возбуждения, вызванного локальной аппликацией глутамата к дендритной поверхности корковых нейронов и изучение возможности регулирования эффективности дендритного проведения ацетилхолином при его подведении к разным пунктам на мембране нейрона. Установление функционального значения фактора дендро-соматического проведения для формирования импульсных реакций нервных клеток.
Задачи исследования:
1. Сопоставить реактивность нейронов коры к локальному ионофоретическому подведению возбуждающих аминокислот (глутамата и аспартата) раздельно к дендритам и соме для установления эффективности дендро-соматического проведения.
Сравнить реактивность нейронов коры к локальной дендритной и соматической аппликации ацетилхолина для выявления его дистанционного внутриклеточного эффекта.
Установить влияние ацетилхолина на импульсные ответы, вызванные локальным подведением возбуждающих аминокислот к соме и дендритам, с целью определения его сравнительного эффекта на возбудимость нейронов и эффективность дендро-соматического проведения.
4. Исследовать реактивность нейронов коры к ацетилхолину при гипотермии для определения температурной зависимости скорости холинергического процесса и связанных с ним параметров импульсной активности нейронов.
5. Установить структуру активационных импульсных реакций нейронов коры в ответ на глутамат, ацетилхолин и сенсорную стимуляцию с целью выявить возможную многокомпонентность при формировании ответов на раздражители и участие в этом процессе изучаемых медиаторов.'
6. Исследовать реактивность нейронов коры к сенсорным раздра жителям у старых животных, при естественном ослаблении холинер- пічєского обеспечения коры, для определения наиболее чувствительных к возрастному фактору параметров импульсных реакций.
7. Определить участие ацетилхолина при формировании условных оборонительных реакций нейронов и выявить условнорефлекторные изменения импульсной активности, осуществляемые естественными холинергическими влияниями.
Научная новизна работы:
Впервые экспериментально показано, что ацетилхолин, независимо от локуса его воздействия на мембране нейрона (соматического или дендритного), вызывает импульсный ответ сомы с одинаковыми параметрами — медленно нарастающую активацию с одним и тем же латентным периодом и одинаковой частотой импульсации. В этом состоит принципиальное отличие холинергического возбуждения от возбуждения, вызванного глутаматом, которое распростаняется от дендритов к соме с существенным декрементом.
Выраженность реакции на ацетилхолин зависит от индивидуальных свойств нейронов (в частности от уровня спонтанной активности) и от температуры мозга. Температурная зависимость определяется двумя зонами изменения скорости холинергической реакции: 1) при температуре 27-29С реакция на микроионофорстическое подведение ацетилхолина появляется у спонтанно активных нервных клеток; 2) при температуре 34-36С возникают импульсные ответы на ацетилхолин у спонтанно неактивных нейронов. Вторая зона температурного перехода характеризуется высокой скоростью нарастания холинергического процесса, составляющей в ряде случаев более 10 раз на 1 градус.
3. Ацетилхолин изменяет функциональные свойства нейронов, что обнаруживается по достоверному улучшению параметров дендро- соматического проведения возбуждения, вызванного глутаматом или аспартатом при' их дендритной аппликации. В естественных условиях функционирования это приводит к росту эффективности постоянно действующих синаптических контактов и кратко временному увеличению спонтанной активности, регистрируемому как реакция на ацетилхолин у части нейронов коры. Тот же процесс, по-видимому, лежит в основе формирования позднего активационного компонента реакций на сенсорную стимуляцию.Параметры ответов на возбуждающие аминокислоты, подводимые к соме, существенно не меняются под влиянием ацетилхолина.
4. Факторы, ограничивающие скорость холинергического процесса: гипотермия и физиологическое старение,— снижают частоту спонтанной активности корковых нейронов и приводят к искажению структуры импульсных реакций на сенсорные раздражители (увеличению латентных периодов ответа и исчезновению позднего неспецифического компонента), что свидетельствует об ухудшении эффективности дендро-соматического проведения.
5. Формирование адаптивного поведения сопровождается ростом уровня спонтанной активности (иногда значительным) у ряда нейронов в зоне коркового представительства безусловного стимула. У нейрона, активность которого связана с движением, увеличение спонтанной импульсации до определенных величин происходило синхронно с формированием условной двигательной реакции. Следовательно, неспецифический компонент клеточной активности выполняет важную роль в формировании условнорефлекторных реакций.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Основная функция ацетилхолина в коре головного мозга состоит в повышении эффективности проведения в сому возбуждения, возникающего в дендритах при аппликации к их мембранной поверхности глутамата или при срабатывании на них глутаматергических синапсов. Последнее обстоятельство приводит прежде всего к увеличению частоты спонтанной активности корковых нейронов. Необходимо отметить, что ацетилхолин достоверно не влияет на параметры импульсных реакций, вызванных аппликацией глутамата к соме, что свидетельствует о малой изменчивости входных параметров клеточных тел под влиянием ацетилхолина.
2. Холинергическая реакция существенно зависит от температуры: в коре мозга морских свинок она отличается высокой скоростью и при температурах, приближающихся к нормальным (от 34 до 36С), ее скорость стремительно растет, достигая градиента более чем в 10 раз на 1 градус. Это с одной стороны обеспечивает значительные возможности для ацетилхолина регулировать процесс дендро-соматического проведения, а с другой стороны, создает условия для существования большого разнообразия дендритных свойств среди корковых нейронов млекопитающих. Оба процесса, по- видимому, лежат в основе многообразия поведенческих стратегий, харак терных для теплокровных.
Показателем снижения функции ацетилхолина в коре является уменьшение частоты фоновой активности нейронов, как при гипотермии, так и при физиологическом старении. Параллельно происходит искажение импульсного ответа на сенсорные раздражители, в частности увеличение латентного периода реакций и выпадение позднего тонического компонента, что свидетельствует об ослаблении проводящей функции дендритов.
Увеличение фоновой активности клеток коры при формировании адаптивного поведения свидетельствует о том, что регулирование электрических свойств дендритов является достаточно динамичным процессом, существенно влияющим как на функциональные свойства нейронов, так и на их участие в обеспечении тонких приспособительных реакций организма.
Научно-теоретическое и практическое значение работы.
С помощью локального ионофоретического подведения возбуждающих аминокислот к дендритам и соме было установлено, что клеточные тела отвечают возбуждающей реакцией на непосредственную аппликацию к ним глутамата и аспартата почти в 100% случаев, причем развиваемые импульсные ответы возникают у разных нейронов с небольшим разбросом величин латентных периодов; вместе с тем, импульсные реакции дендритного происхождения отличаются существенной неоднородностью по выраженности ответов, что свидетельствует о значительной вариабельности параметра дендро-соматического проведения у разных пирамидных нейронов V слоя коры.
Судя по тому, что эффективность распространения возбуждения из дендритов в сому возрастает под влиянием ацетилхолина, этот процесс зависит от удельного сопротивления клеточных мембран, причем в значительно большей степени, чем деполяризационное смещение в первичном пункте возникновения возбуждения, так как ацетилхолин не влияет на параметры импульсных ответов клеточных тел на непосредственную аппликацию к ним глутамата или аспартата. Это означает, что эффективность дендро-соматического проведения может существенно изменяться при незначительном изменении мембранного сопротивления, что определяет высокую пластичность этого процесса.
Принципиальным является тот факт, что эффект ацетилхолина не зависит от места его аппликации на мембране нейрона (дендритного или соматического): в любом случае ацетилхолин способствует более эффективной доставке в сому возбуждения из дендритов. Это свидетельствует о пространственной организации холинергического процесса, связь которого с метаболическими внутриклеточными реакциями идентифицируется по высокой температурной чувствительности. Наибольшая скорость холинергичес-кой реакции достигается при температурах, приближающихся к нормальным: выше 36С регулирование дендритных свойств ацетилхолином осуществляется в широком диапазоне.
Скорость холинергической реакции тесно связана с изменением уровня спонтанной активности. Это означает, что ацетилхолин существенно влияет на неспецифические реакции нервных клеток, связанные со случайным, но стационарным поступлением на дендритную поверхность многочисленных, но слабых синаптических воздействий. Регулирование неспецифической составляющей реакций корковых нейронов в естественных условиях может проявиться при формировании адаптивного поведения, а при недостаточности холинергического обеспечения коры (в процессе старения организма) или при температурном ограничении скорости холинергической реакции модулирование неспецифического компонента активности корковых нейронов нарушается в первую очередь.
Полученные данные могут быть использованы для моделирования нервных процессов, лежащих в основе формирования импульсных реакций. В перспективе результаты работы могут быть полезными при трактовке исследований в смежных дисциплинах: в геронтологии или палеонтологии. Не исключено их использование для прогнозирования последствий пограничных состояний мозга (патологических форм старения и ишемических состояний).
Глутамат и аспартат - естественные возбуждающие медиаторы мозга
Среди обширного множества дикарбоновых аминокислот только L-глутамат и L-аспартат имеют широкое распространение в различных отделах мозга. Обе аминокислоты вызывают на клеточной мембране однотипный и почти равный по интенсивности эффект [61,179,253,282]. По результатам микроионофоретического подведения глутамата к клеткам спинного мозга D.R.Curtis et al. впервые предположили, что эта аминокислота может выполнять функцию возбуждающего медиатора в центральной нервной системе [124]. При аппликации к мембране нейронов глутамат вызывает быструю деполяризацию, достигающую максимума за несколько миллисекунд. Возбуждающий эффект не обнаруживает признаков десенситизации на протяжении 30-секундного воздействия и прекращается практически одновременно с выключением тока фореза [124,202]. Деполяризация, вызываемая глутаматом, всегда сопровождается снижением амплитуды одновременно возникающих ВПСП и ТПСП и, следовательно, развивается за счет резкого снижения сопротивления мембраны [124,179,196,298].
Величина деполяризации в ответ на подведение глутамата к мембране нейронов зависела от концентрации медиатора в подводимом растворе и от силы тока фореза [179]. Ее максимальное значение для нейронов спинного мозга составляло 20 - 30 мВ, что при оптимальных условиях аппликации приводило к генерации спайковой активности [125]. Потенциал реверсии глутаматергического эффекта был определен разными исследователями в диапазоне от 0 до -30 мВ, поэтому все были единодушны во мнении, что деполяризация, вызываемая глутаматом, обеспечивается в основном за счет увеличения проницаемости мембраны для ионов Na+ с последующим ростом оттока К+ из нервной клетки в результате потенциал -зависимого увеличения Gk [179,202,298].
Сходные эффекты были получены при изучении аппликации глутама-та и асиартата на нейроны коры, мозжечка [179,181,202] и нервные клетки практически во всех отделах центральной нервной системы [125,179,196, 202]. Таким образом, основной деполяризующий эффект возбуждающих аминокислот осуществляется за счет взаимодействия медиаторов с ионо-тропными глутаматными рецепторами, которые представляют собой лиганд -управляемые ионные каналы, время активации которых составляет несколько миллисекунд [11,67]. Участки полипептидных цепей рецепторных субъединиц, выступающие над поверхностью клетки, служат для узнавания и взаимодействия с медиатором. Участки субъединиц, проходящие сквозь толщу мембраны, образуют собственно каналы - гидрофильные поры, через которые ионы диффундируют в направлении их электрохимических градиентов. Следовательно, управляемые глутаматом ионные каналы всегда осуществляют пассивный транспорт и не сопряжены с источниками энергии.
При этом они переносят около 10" ионов в секунду, что более чем в 100 раз превышает скорость транспорта любым из известных белков -переносчиков [11]. Механизм работы ионотропных рецепторов объясняет, с одной стороны, возникновение быстрых де поляризационных токов при аппликации глутамата, а с другой стороны, - нечувствительность вызываемой глутаматом активационной реакции к действию блокаторов энергетического метаболизма и длительной аноксии [146].
Поскольку абсолютное большинство нейронов во всех мозговых структурах чувствительны к аппликации глутамата, было даже высказано предположение, что эффект медиатора неспецифичен [125]. Более того, глутамат, при его подведении к соме нервных клеток, активирует по-видимому, внесинаптические рецепторы, т.к. известно, что возбуждающие контакты на клеточных телах нейронов коры и гиппокамгта практически отсутствуют [7,120].Эта точка зрения, однако, в настоящее время не имеет поддержки. Сходство ионных механизмов, вызываемой глутаматом деполяризации и деполяризации синаптического происхождения, а также то обстоятельство, что блокада рецепторов глутамата специфическими антагонистами блокирует вызванные ответы в корковых нейронах [166,274,275], в нейронах подкорковых ядер [173] и в клетках задних рогов спинного мозга [282] свидетельствуют об исключительной роли глутамата для передачи возбуждающих влияний в центральной нервной системе.
Глутамат обнаруживается в нервной системе повсеместно и в более высокой концентрации по сравнению с другими медиаторами [61,179]. Он является преимущественным возбуждающим медиатором внутри корковых, транскаллозальных связей, а также медиатором восходящих и нисходящих корковых путей [121,166,172,175,162,145]. С помощью метки пероксидазой хрена, вводимой в заднее вентральное латеральное и медиальное ядра ( VPL и VPM) таламуса, а также латеральное коленчатое тело, в коре были обнаружены профили аксонных окончаний нейронов таламических релейных ядер [172]. Иммуноцитохимическим методом при введении антител к глутамату удалось определить высокое содержание медиатора в идентифицированных таламо-корковых терминалях, причем его количество было тем больше, чем выше плотность синаптических пузырьков в окончании [172].
В работе T.Tsumoto et al. [275] для идентификации медиатора в аксонных окончаниях, поступающих в кору из латерального коленчатого тела, регистрировали импульсные реакции нейронов зрительной коры в ответ на специфическую зрительную стимуляцию у кошек до и во время микроионофоретической аппликации кинуреновой кислоты - блокатора глутаматных рецепторов широкого действия. Кинуреновая кислота подводилась к нейронам в течение нескольких минут не только в облась сомы, но также из специально отставленной микропипетки в область дендритов регистрируемого нейрона для обеспечения наиболее полного взаимодействия блокатора с глутаматергическими синапсами на поверхности нейрона.
Экстраклеточная регистрация и микроионофоретическое подведение медиаторов
Для решения поставленных задач одна часть экспериментов проведена на переживающих срезах коры мозга, тогда как вторая - на коре мозга бодрствующих животных.
Использование методики переживающих срезов позволило провести сравнительный анализ реактивности отдельных нервных клеток на локальное возбуждающее воздействие, приложенное к соматической мембране и разным пунктам на дендритной поверхности. Возможность быстрой смены условий инкубирования способствовала изучению факторов, влияющих на реактивность нейронов и выявлению наиболее изменчивых параметров импульсной активности.
В экспериментах на бодрствующих животных выявленные особенности реагирования были прослежены в клеточных ответах на сенсорные раздражители. Анализ структуры импульсных реакций в разных условиях функционирования позволил обнаружить много компонента ость клеточных импульсных ответов и их изменчивость в зависимости от функционального состояния животных.
1. ПЕРЕЖИВАЮЩИЕ СРЕЗЫ МОЗГА Приготовление срезов. В экспериментах использовали срезы париетальной коры морских свинок. Животных (масса 200-300 г) декапитировали с помощью гильотины. Кости черепа быстро удаляли и поверхность мозга охлаждали холодным физиологическим раствором (t=2-8C). Продольный блок париетальной коры отсекали от остальной части мозга и располагали на агар-агаровом (5%) желобке, смоченном аэрированным физиологическим раствором, или закрепляли в агаровом колодце, погруженном в физиологический раствор, в зависимости от дальнейшей процедуры. Фронтальные срезы коры нарезали толщиной 500 мкм с помощью механического резака или вибротома VSL (World Precision Instruments, США). Приготовленные срезы помещали в резервный отсек инкубационной камеры (НПО "Биоприбор", Россия), один из срезов переносили в экспериментальный отсек. В обоих отделениях камеры создавался независимый проток раствора Рингера-Кребса, насыщенного газовой смесью (95% ( + 5% СО2) и состоящего из (мМ): 124 - NaCl; 2,4 - СаСІ2; 1,3 - MgSC 4; 5 - КС1; 1,25 -KH2PO4; 26 -NaHCC 2 и 10 - глюкозы (pH = 7,4±0,2). Скорость протока составляла 1,5 - 3 мл/мин. На протяжении 1,5-2 часов срезы инкубировали при комнатной температуре, затем температуру повышали до 32 -34С. Этот уровень в качестве стандартного поддерживали в течение всего эксперимента. Экстраклеточная регистрация и микуоионофоретическое подведение медиаторов. Для экстраклеточной регистрации и ионофоретической аппликации возбуждающих аминокислот и ацетилхолина обычно использовали 3-канальные стеклянные микропипстки, вытянутые из стеклянных трубочек марки "Пирекс". Общий диаметр кончика микроэлектродов составлял 7-8 мкм. Отводящий канал заполняли ЗМ раствором NaCl, каналы для фореза -1М раствором глутамата натрия (рН 7,5, "Sigma", США) или 1М раствором аспартата калия (рН 7,5, "Serva", Германия) а также 2М раствором ацетил-холин-хлорида (рН 4, "Мосмедпрепараты", Россия). В ряде случаев для контроля токового эффекта при подведении медиаторов к соме, а также для окрашивания регистрируемого нейрона с помощью пероксидазы хрена использовали 4-канальныс микроэлектроды: четвертый канал заполняли соответственно раствором NaCl или 0,75% раствором пероксидазы хрена (тип IV, "Sigma", США).
Трехствольный микроэлектрод, имевший отводящий канал, перемещали на уровне V слоя коры (1,5 - 1,7 мм от пиальной поверхности) с целью поиска импульсной активности отдельных нейронов. После обнаружения стабильной импульсации, свидетельствовавшей о нахождении микроэлектрода в непосредственной близости от тела нервной клетки, независимый микроэлектрод, имевший только каналы для фореза
Во время перемещения дендритного микроэлектрода производили кратковременные (1 - 1,5 с ) микроинъекции возбуждающих аминокислот до обнаружения импульсного ответа, регистрируемого соматическим микроэлектродом. Это служило индикатором нахождения микроэлектрода возле дендритной мембраны, так как аппликация глутамата к дендритам токами короткой длительности (1 с; 50 - 100 нА), вызывает достаточно локальный возбуждающий эффект, ограниченный 5-20 мкм [264]. Расстояние между кончиками дендритного и соматического микроэлектродов определяли с помощью окуляр-микрометра. После обнаружения дендритного локуса создавалась возможность тестировать мембрану нейрона в двух точках: в области сомы и в области дендрита.
Форез возбуждающих аминокислот производили током от 40 до 90 нА ; вещества выводились как анион (отрицательный полюс внутри электрода). Форез ацетилхолина осуществляли как катион - током от 60 до 80 нА (положительный полюс внутри электрода). Длительность аппликации глутамата и аспартата составляла обычно 1,0 - 1,5 с, реже - 4,5 с (для дендритной аппликации, вызывавшей ответ сомы с продолжительными латентными периодами). Длительность аппликации ацетилхолина в связи со значительным (до нескольких секунд) латентным периодом вызываемого им активацион-ного импульсного ответа [179,181,210] всегда составляла 4,5 с. В интервалах между аппликациями во всех форезных каналах устанавливали ток удерживания, противоположный по направлению форезному силой 3-5 нА. Температурный режим. Эксперименты проводили при стандартной температуре инкубационной среды 32-34 С ("Результаты", раздел 4) или 35 С ("Результаты", разделы 1-3)
Импульсные реакции нейронов коры на подведение возбуждающих аминокислот к соме и дендритам
Реакции на микроионофоретическое подведение глутамата и аспартата к различным пунктам мембраны отдельных нейронов были изучены на 135 нейронах в срезах париетальной коры. Около половины нервных клеток, зарегистрированных в переживающих срезах, не имели спонтанной активности. Такие нейроны удавалось обнаружить по возникновению короткой серии импульсов, возникавшей при приближении регистрирующего электрода к соме. Независимо от уровня спонтанной импульсации нейроны в 97% случаев отвечали на подведение аспартата и глутамата к соматической поверхности быстрым увеличением частоты спайков, которое прекращалось почти одновременно с выключением тока фореза. Активационные реакции на микроаппликацию обеих аминокислот имели одни и те же характеристики, поэтому в дальнейшем будут рассматриваться совместно.
Как показал морфоконтроль, все эксперименты были выполнены на клетках, локализованных в V и на нижней границе IV слоя. Микромаркировка пероксидазой хрена только в 2 срезах из 7 дала положительную реакцию в пункте аппликации. Окрашенные нейроны в обоих случаях имели пирамидальную форму и размеры, характерные для больших пирамид V слоя.
Представление о том, какие клетки в большинстве случаев были объектом тестирования, можно составить, исходя из геометрического расположения точек на разном удалении от сомы, стимуляция которых глутаматом или аспартатом вызывала спайковый ответ нейронов. Появление импульсной реакции при такой стимуляции свидетельствовало о том, что второй микроэлсктрод (имеющий только форезные каналы) располагается в непосредственной близости от дендритной поверхности, так как возможность микроионофоретической активации других нейронов, имеющих возбуждающие контакты с регистрируемым, очень невысока [159], а постсинаптическии ответ при активации моносинапти чески связанных нейронов в коре как правило значительно ниже (в среднем 0.5 мВ) критического уровня деполяризации [9,168,207,237]. Следовательно, появление импульсного ответа при аппликации возбуждающих аминокислот на разном расстоянии от сомы дает основание для реконструкции формы дендритного дерева регистрируемых нейронов.
Реакции на подведение возбуждающих аминокислот к базальным дендритам удавалось обнаружить на расстоянии 50-350 мкм от сомы; воздействие на апикальные дендриты вызывало ответ при удалении электрода до 800 мкм. Максимальную протяженность базальных дендритов клеток V слоя коры у мелких млекопитающих разные авторы оценивают в пределах от 200 до 400 мкм [115,263]. Рис.2 показывает, как часто возникают импульсные реакции при локальной аппликации глутамата или аспартата на разном расстоянии от клеточных тел. Суммированы все случаи появления ответов при подведении возбуждающих аминокислот к дендритным точкам током 70-80 нА. Частота встречаемости импульсных соматических ответов при активации апикальных дендритов достаточно равномерно распределена в области 150-600 мкм с небольшим увеличением на расстоянии от 250 до 350 мкм. При аппликации к базальным дендритам возбуждающие аминокислоты наиболее часто вызывают спайковый ответ сомы с дендритных пунктов на расстоянии в 100-150 мкм. Именно на этом расстоянии по результатам морф о метрического анализа, проведенного при внутриклеточном окрашивании пирамид V слоя у крыс, обнаружено наиболее интенсивное ветвление дендритного дерева [115].
Таким образом, данные морфоконтроля и физиологическое тестирование свидетельствуют о том, что проведенные эксперименты выполнены в основном на пирамидных нейронах V слоя коры.
Аппликация возбуждающих аминокислот к удаленным дендритным ло-кусам всегда вызывала менее интенсивный активационный ответ нейронов, чем при непосредственно соматическом подведении медиаторов (рис.3 - 5). На рис.3 этот факт продемонстрирован на примере спонтанно активного нейрона. Хорошо заметно, что стимуляция базального дендрита на расстоянии 350 мкм от сомы вызывает импульсный ответ с меньшей частотой по сравнению с ответом на аппликацию глутамата к соматической поверхности. На рис.4 ослабление ответа при подведении глутамата к апикальному дендриту (300 мкм от сомы) продемонстрировано для спонтанно неактивного нейрона. Рис.5 демонстрирует, что уменьшение интенсивности ответа при дендритной стимуляции тем больше, чем дальше от сомы нейрона расположен дендритный пункт тестирования.
На рис.6 для 8 нейронов, имевших фоновую активность и отвечавших на подведение глутамата к соме и хотя бы к одному локусу на дендритах, представлена величина ответа при аппликации медиатора к соме (левый график) и к дендритам (правый график) по отношению к уровню спонтанной импульсации. Аппликация глутамата током одной и той же величины всегда вызывала более интенсивный ответ при воздействии на сому по сравнению с реакциями при воздействии на дендритные локусы (на графике этому соответствует большая крутизна линии регрессии). Отношение тангенсов углов наклона линии регрессии на левом и правом графиках рис.6 составляет 1,5, что и определяет степень ослабления интенсивности импульсного ответа при дендритном возбуждении по сравнению с соматическим. Отметим, что реакции на аппликацию глутамата к дендритам, несмотря на разную удаленность от сомы пунктов тестирования у разных нейронов (150 - 350 мкм), характеризуются очень близкими величинами, о чем свидетельствует
Сравнительная характеристика импульсных реакций соматического и дендритного происхождения
Возбуждающее действие ацетилхолина на мембрану нейронов париетальной коры имеет целый ряд особенностей, которые отличают его от эффекта глутамата. Так, было установлено, что ацетилхолин действует со значительно более продолжительным латентным периодом, чем глутамат и аспартат (рис.16). Влияние ацетилхолина можно было выявить лишь у 56-66% нейронов (при разной локализации воздействия-табл.1), причем эффект зависел от уровня спонтанной активности (рис.10,11); тогда как к глутамату и аспартату были чувствительны практически все тестированные нейроны независимо от наличия у них спонтанной импульсации (рис.30). И, наконец, повышение частоты импульсной активности, вызываемое ацетилхолином, имело сходные параметры как при аппликации медиатора к соме, так и при воздействии на разноудаленные дендритные локусы (рис.12-16). Следовательно, эффект ацетилхолина обеспечивается принципиально иными механизмами, чем эффект возбуждающих аминокислот, несмотря на то, что в обоих случаях происходит повышение частоты импульсации тестируемых нейронов (рис. 10,30).
Главным отличием является то, что глутамат и аспартат вызывают быстрый и значительный деполяризационный сдвиг мембранного потенциала за счет резкого увеличения проницаемости мембраны в основном для ионов Na+ [124,179,202,298], тогда как действие ацетилхолина связано с блокадой разных типов К+ каналов, что приводит к повышению удельного сопротивления мембраны [110,118,183,210]. Этот эффект в результате уменьшения потока положительных ионов из клетки создает деполяризацию, которая, однако, выражена довольно слабо и у некоторых нейронов практически не обнаруживается [210]. Вместе с тем, па фоне возросшего сопротивления удается зарегистрировать увеличение амплитуды и частоты следования спонтанных ВПСП при внутриклеточной регистрации [210], что можно расценить как возрастание эффективности синаптических влияний, дающих вклад в формирование спонтанной импульсации. Таким образом, реакция на подведение ацетилхолина является не следствием изменения мембранного потенциала, а возникает в виде увеличения уровня спонтанной импульсации. Так как сома практически лишена возбуждающих контактов [7,120,159], активационная реакция на ацетилхолин возникает в результате более эффективной доставки к соме возбуждения дендритного происхождения, которое формируется за счет срабатывания многочисленных возбуждающих синапсов на поверхности дендритов. Следовательно, реакция на ацетилхолин подчиняется закономерностям, определяющим эффективность дендро-соматического проведения.
Как было показано в предыдущей главе, пирамидные нейроны коры существенно отличаются друг от друга по этому показателю. По-видимому, одной из причин такой неоднородности является разная плотность К" " каналов на мембране разных нейронов, о чем можно судить по разной выраженности постактивационной гиперполяризации [31,209,205,139] и разной степени адаптации к деполяризующему току [100]. Естественно предположить, что ацетилхолин, действуя в коре посредством М холинорецепторов, закрывает К+ каналы пропорционально их наличию на мембране нейронов. Отсюда разная степень выраженности холинергического эффекта у разных нервных клеток коры и его зависимость от уровня фоновой импульсации, на что обращалось внимание еще в ранних работах по изучению закономерностей влияния ацетилхолина на активность корковых нейронов [179,180].
М-холинергическая реакция по блокаде К"1" проницаемости является следствием внутриклеточных биохимических преобразований, начало которым дает взаимодействие ацетилхолина с рецепторами в любом пункте на мембране нейрона. Активированный рецептор через G-белки запускает каскад внутриклеточных биохимических процессов, включающих усиление обмена фосфоинозитидов, освобождение Са из внутриклеточных депо и активацию протеинкиназы С [26,110,112,137,231,233]. Результатом является фосфорилирование специфических мембранных белков, входящих в состав ионных каналов и ответственных за клеточную реакцию [26,62]. Этот механизм приводит к подавлению К+ проницаемости на обширной мембранной поверхности [26,108,]. Таким образом, рост мембранного сопротивления, обусловленный блокадой К"1" каналов, осуществляется посредством внутриклеточной сигнализации с необходимой временной задержкой одновременно и равномерно на значительном расстоянии от места аппликации медиатора [112,135,286]. Этот сложный метаболический процесс, с одной стороны, объясняет значительные величины латентных периодов реакций на ионофоретическое подведение ацетилхолина (рис.12-14, 16), а с другой стороны, будучи однотипным как для сомы, так и для дендритов, обусловливает одинаковость параметров реагирования на ацетилхолин при его подведении к разным пунктам мембраны нервных клеток (рис.12-16).
Вызываемый в результате действия ацетилхолина рост сопротивления клеточных мембран имеет два следствия: повышение возбудимости нейрона и улучшение параметров дендро-соматического проведения. Локальное подведение возбуждающих аминокислот к соме и дендритам до и после воздействия ацетилхолина на мембранные свойства нервных клеток позволило выявить какой из этих двух процессов в наибольшей степени регулируется ацетилхолином. Было обнаружено, что ацетилхолин достоверно не влияет на параметры ответов, вызванных соматической аппликацией глутамата и аспартата (рис.22,23, табл.2). Это означает, что ацетилхолин повышает возбудимость нейронов на относительно небольшую величину. Действительно, внутриклеточные исследования позволили установить, что входное сопротивление в результате воздействия ацстилхолина меняется в диапазоне от 4 до 26% у разных нейронов коры [135,210,292]. Следовательно, в том же диапазоне следует ожидать увеличения выраженности импульсного ответа на возбуждающие аминокислоты при их подведении к соме, что при суммировании по всей популяции нейронов не приводит к достоверным изменениям (табл.2).
Вместе с тем, параметры импульсных реакций, вызванных локальной деполяризацией дендритов, в значительно большей степени зависят от роста мембранного сопротивления, связанного с действием ацетилхолина. Обусловлено это процессом электротонического проведения возбуждения по дендритам, на эффективность которого удельное сопротивление дендритной мембраны оказывает влияние на всем пути следования. Электротоническая длина от пункта дендритного возбуждения измеряется числом констант длины X, зависимых от величины удельного сопротивления мембраны [242]. Следовательно, с ростом мембранного сопротивления дендриты становятся электротонически более компактными — проведение по ним улучшается. Наиболее благоприятным условием для улучшения кабельных свойств дендритов является равномерное повышение сопротивления дендритных мембран. Этому условию полностью удовлетворяет эффект ацетилхолина, который приводит к повышению сопротивления одновременно практически на всей мембранной поверхности независимо от пункта воздействия [112,135,292].
