Содержание к диссертации
і
Сокращения ВВЕДЕНИЕ
5 S
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1; 1.2
Субклеточные и молекулярные механизмы обучения
Роль цитоскелета в организации физического
взаимодействия между участниками процессов восприятия
внешних воздействий, проведения сигналов и формирования
ответов клетки.
1.3.
Роль структурообразующих белков в организации
взаимодействий ионных каналов и рецепторов
плазматической мембраны с цитоскелетом и
внугриклеточньтми протеинами
1.4
Современная концепция структурной организации передачи
сигналов на клеточном уровне.
ГЛАВА 2 ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
ГЛАВА 3
3.1
3.1.1 3.1.2
3.1.3
Объект исследования 66
Методика получения и культивирования изолированных 68
нейронов
Методы исследования электрической актинности 71
изолированных нейронов
Алгоритмы применения воздействий, вызывавших 76
кратковременные пластические перестройки ответов.
Алгоритмы применения воздействий, вызывавших 79
долговременные пластические реакции сомы изолированных
нейронов
Приготовление растворов используемых веществ и способы 80
их аппликации.
Статистический анализ данных.
ИССЛЕДОВАНИЯ
ИХ 83
РЕЗУЛЬТАТЫ ОБСУЖДЕНИЕ
реакции сомы 83
Кратковременные пластические изолированных нейронов.
Пластические реакции нейронов, сформированные 83 локальными, одиночными электрическими воздействиями. Свойства пластических изменений ответов сомы 86 изолированных нейронов, вызванные локальными, одиночными электрическими воздействиями Пластические реакции, сформированные сочетанными 92 локальными и генерализованными электрическими воздействиями.
Свойства пластических изменений. ответов сомы 93 изолированных нейронов вызванные сочетанными локальными и генерализованными электрическими воздействиями.
Реакции нейронов и функциональные изменения 98 электрогенных структур плазматической мембраны,. вызванные локальной электрической стимуляцией: но алгоритмам выработки привыкания и ассоциативного обучения;
Заключение 101
3.2; Гетерогенность пластических; свойств; сомы нейронов, 103
вызванная локальной экспериментальной
модификацией ионной проницаемости мембраны.
3.2.1 Изменение пластических свойств сомы нейронов, вызванное. 103
локальной модифнкашіей ионной проницаемости мембраны
для ионов кальция.,
3:2.2! Изменение пластических свойств сомы нейронов, вызванное 104
блокадой ; потен циалуправляемых кальций-зависимых:
калиевых каналов на участке мембраны.
3.2.3 Влияние на формирование пластических изменений ответов^ 107
сомы изолированных нейронов фармакологической
модификации ионной проводимости участков мембраны.
3.2.3 Заключение 108
3.3. Анализ: интегральных ионных; токов, соматической 109
мембраны, ц: процессе формирования; локальных пластических изменений возбудимости нейронов
33.1 Ионные токи, участков соматической мембраны на этапе ПО
чередования двух типов ответов.
3:3.2 Ионные токи участков1 соматической, мембраны; на: этапе. 114:
сохранения локальных^ пластических изменении-возбудимости нейронов.
Ионные; токи- участков. сомы* w их изменения В: процессе 115 формирования пластических изменений ответов нейронов.
Заключение 1 IS
314 Долговременные- пластические реакции; сомы 119
изолированных нейронов.
3:4.1 Влияние одновременного воздействия неспецифических 119
повреждающих. факторов и низких концентрацией кофеина. на: нейрональные. реакции вызванные аппликацией физиологических концентраций кофеина;.
3.4.2 Влияние одновременного воздействия неспецифических 126
повреждающих факторов и низких^ концентрацией
циклоспорина-А на нейрональные реакции вызванные
аппликацией физиологических концентраций циклоспорина
А.
3.4.3 Экстремальные воздействия- и;' чувствительность, к низким: 128;
концентрациям лигандов
3.4.4 Заключение 131
Влияние одновременного воздействия гиноксического 131 стресса и низких концентрацией кофеина на нейрональные реакции вызванные аппликацией физиологических концентраций кофеина.
Мобилизация эволюциошю приобретенных механизмов 134 адекватного функционирования нейронов в меняющихся условиях среды как экспериментальный прием формирования новых приспособительных реакций.
Заключение. 138
3.6 Влияние нарушений динамических перестроек 139
цитоскелета на пластические свойства нейронов.
Влияние нарушений динамических перестроек 139 микрофиламентов цитоскелета на пластические свойства нейронов.
Влияние нарушений динамических перестроек тубулинового 144 цитоскелета на пластические свойства нейронов.
Роль цитоскелета в организации процессов нейроналыюй 147 пластичности.
Заключение 152
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 155
ВЫВОДЫ 166
СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ 169 ДИССЕРТАЦИИ
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Сокращения
ВПСП - возбуждающий постсинантический потенциал
К-каналы - потенциалоуправляемые калиевые каналы
К-ток - калиевые токи
МП - мембранный потенциал
МТ - микротрубочки
МФ - микрофиламенты
НК - низкая концентрация
НПкл - не привыкающие клетки
НФ - нейрофиломенты
Пкл - привыкающие клетки
ПК-А - протеинкиназа А,
ГЖ-С - протеинкиназа С
ПД - потенциал действия;
ФК - физиологическая концентрация
цАМФ - циклический аденозинмонофосфат
нАХР - никотиновые рецепторами ацетилхолина
АХ - ацетилхолин (acetylcholine)
АКАР - протеины прикрепляющие киназу A (A kinase anchoring protein)
АМПК — амино-З-гидрокси-5 метил-изоксазол-пропиоповая кислота
АМПКР - (amino-3-hydroxy-5 methyl-isoxazoIe-4-propionic acid) подтип рецепторов
глютамата
арСАМ - молекулы адгезии
АТФ - аденозинтрнфосфат
АДФ - аденозивдифосфат
С А - ноля гиппокамна
Са-каналы - потенциалоуправляемые кальциевые каналы
СаМКН кальций/кальмодулин-зависимая киназа II
DAG - диацшшшцером (diacylglycerol)
DARPP-32 - ингибитор фосфатази
Гефирин - gephyrin
ГАМК'.- гамма амино-масдяная кислота
ГАМКР- рецепторы гамма амин о масляной кислоты
Gaq, Gan,Gqn - типы G-белков
ГлтоРІ - субъединица рецепторов глютамата (GluRl)
ГлиР - рецепторы глицина
1-А - калиевый ток блокируемый 4-аминопиридшюм
I-B - задержанный калиевый ток
I Са - кальциевый ток
I-K, Са - медленно активирующийся калиевый ток, зависимый от концентрации ионов
кальция
INAC - глазные специфические С киназы
InaD (inactivation-noafterpotential D) структурообразующий протеин.
bis - (inositol) инозитол
KCNQ/M - тип калиевых каналов
KCNQ2-5 - субъедипицы калиевых каналов KCNQ/M-типа
IS- серотонинзависимый калиевый ток
ДПТД - длительная посттетаническая депрессия
ДПТП - длительная посттетаническая потенциация.
М АП-К - митоген ативируемые протеин киназы (mitogen-activated protein kinase)
NINAC - (the unconventional myosin Ш) нетрадиционный миозин III
НМДА- Н-метил-Д-аспартат (N-methyl-D-aspartate)
НМДАР — (N-methyl-D-aspartate) подтип рецепторов глютамата
HP - субъединицы НМДА рецепторов
РИДЗ - домены протеинов, которые связываются с внутриклеточными С-концами
рецепторов и каналов
PLP2 фосфатидилинозитол-4,-5-дифосфат (phosphattdylinositol 4,5-bisphosphate [Ptdlns (4
Р2])
РТРЗ - инозитол 1,4;5-трифосфат (inositol 1,4,5-trisphosphate [Ins (1,4,5) РЗ]) ФП-2А - фосфатаза протеина подтип 2А ФП-2В - фосфатаза протеина подтип 2В (calcineurin) TRP - (transient receptor potential) - кратковременный рецепторный потенциал ТТХ - тетродотоксин WASP/SCAR и Ena/VASP семейства пролин богатых протеинов GTPases из семейства Rho (Cdc42, Rac, и Rho) * Введение к работе Одной из актуальных проблем современной нейробиологииявляются исследования структурно-функциональной организации пластичности нейрональиых реакций на; молекулярно-клеточном- уровне. Сложные функции нервнойt системы, обеспечиваются; способностью- нейронов к пластическим изменениям^ реактивности. Эта способность проявляется:под7действием-;последовательных раздражений и"выражается;в изменении; реакции- на воздействия: Выявлены- общие: закономерности организации, базисных механизмов приспособительных реакций нервных клеток мозга, вызванных адекватными и экстремальными воздействиями [Самойлов -. М.О., 1999]. В работах, направленных на исследование молекулярных механизмов > пластических реакций основное внимание, как правило,, уделяется? обнаружению, конкретных молекул, которые осуществляют метаболическое обеспечение этих реакций і [Гриикевич Л.Н. и др., 1996; Максимова Oj А., Балабан П.М;, 1983; Никитин В.П., Козырев С.А., 2002; Никитшг В.Щ Козырев С.А, Шевелкин А.В;,. 2002; Степанов. ИИ; и: др., 1987;: Balaban P.M.,. Korshunova Т.А., Bravarenko N.I., 2004; Zakharov I.S. et al. 1998]. Хотя в* некоторых: случаях идентифицированы; участники метаболического: обеспечения передачи сигнала; остаются, недостаточно исследованными процессы, обеспечивающие доставку необходимых; молекул от мест, синтеза к: комнартментам: использования, физическое взаимодействие между ними; И' образование надмолекулярных, комплексов, которые: позволяют клетке, быстро, оптимально и адекватно реагировать на внешние воздействия. В: первоначальной; концепции передачи сигналов [Ody J., Schramm5 М., 1976] предполагалось, что все главные компоненты рецепции воздействий и генерации ионных токов и/или метаболического ответа нейронов- рецепторы, G протеины, протеинкиназы, протеазы, ионные каналы могут быть свободно: распределены в клетке. Процессы: передачи информации в клетке: происходят во время случайных столкновений п- взаимодействий отдельных партнеров процесса. Однако очень большое количество рецепторов различных медиаторов, гормонов и сенсорных стимулов взаимодействуют с системами вторичных посредников — кальциевой, фосфоинозитидпой, циклических нуклеотидов. Тем не менее, несмотря на явную диспропорцию типов рецепторов плазматической мембраны и систем вторичных посредников, нейроны способны отличить один стимул от другого в пределах миллисекунд. Благодаря исследованиям последних лет, в основном синантической пластичности, происходит формирование новой концепции передачи сигналов. Она заключается в том, что специфика восприятия внешних воздействий и пластических изменений ответов клетки определена структурой организации и механизмами реорганизации взаимодействий между молекулами участниками этих процессов, цитоскелетом и моторными протеинами. Обнаружены белки, благодаря которым происходит сборка функциональных комплексов. Аминокислотная последовательность и третичная структура этих протеинов и домены белок-белкового распознавания (последовательности аминокислот) рецепторных, сигнальных, цитоскелетных и эффекторных протеинов позволяют осуществлять физическое взаимодействие и позиционирование молекул партнеров определенного процесса в надмолекулярные комплексы, получивптие название микродомены [Tsunoda S. et al., 1997]. В некоторых случаях образование связей между протеинами-партнерами могут происходить на рашшх стадиях биосинтеза еще в эндоплазматической сети и cis-Golgi сети [Komau Н.С. et al., 1995; Niethammer М. et al., 1996; Passafaro M. et al, 2001]. Микродомены подвергаются транспортировке с помощью специфических моторных протеинов, которые используют тубулиновый цитоскелет как направляющие для перемещения микродоменов от компартментов синтеза к местам их встраивания в плазматическую мембрану. По актиновым филаментам моторные протеины могут экспрессировать синаптические везикулы > и рецеиторные микродомены в плазматическую мембрану, а также осуществлять рециркуляцию микродоменов (регулируемую активностью нейронов) между этой мембраной и внутриклеточными компартментами. Благодарят исследованиям последних лет становятся; доминирующими представления, что пластичность нейрональных реакций- на.; клеточио-молекулярном уровне наряду с другими событиями обеспечивается- процессами: экспрессии и субклеточного динамического' позиционирования: функциональных; микродоменов. ЭтИ: процессы инициируются внешними: воздействиями; и акти вностью нейронов (ген ерацией ионных токов, метаболическими, реакциями), а контролируются и осуществляются структурой взаимодействий (прямых или опосредованных) с цитоскелетом, Структурные изменения, обеспечивающие пластические реакции, могут затрагивать количество молекул, - которые: не всегда обнаруживаются аналитическими методами в частности конфокальной микроскопией [Kim С.Н., Lisman J.E., 1999]. Однако лиганды, модулирующие динамические перестройки цитоскелета, могут оказывать влияние на формирование пластических реакций, что позволяет исследовать механизмы организации микроструктуриых перестроек В; процессе формирования и сохранения нейрональной пластичности электрофизиологическими методами. Исследования условий и механизмов формирования приспособительных реакций и: роли цитоскелета в организации нейрональной пластичности могут привести к более глубокому пониманию: процессов обработки; информации на клеточном и субклеточном уровнях. Конкретные сведения о структурно-функциональных связях микродоменов соматической мембраны с цитоскелетом и временной и микроструктурной организации нейрональной пластичности ограничены. Этому направлению исследований и посвящена представленная работа. Цель и основные задачи исследования Цель исследования;: Определить закономерности формирования пластических реакций изолированных нейронов и роль цитоскелета в организации локальных пластических изменений плазматической мембраны клетки. Основные задачи исследования: Найти приемьь и создать экспериментальные условия, которые позволяют: формировать- кратковременные ил долговременные пластические: изменения-: ответов; изолированной сомы нейронов. Экспериментально1 проверить предположения;- что соматическая мембрана1 нейрона может реагировать на воздействия как функционально гетерогенная структура. 3; Экспериментально проверить. предположение,. что: на клеточном уровне новые приспособительные реакции развиваются в ответ на экстремальные воздействия на фоне мобилизации эволюционно сформированных клеточных механизмов адаптации. 4. Исследовать влияние экспериментальной модификации реорганизации актинового и тубулинового цитоскелета па динамику формирования и сохранения пластических нейрональных реакций. Научная новизна Впервые описаны- условия,, позволяющие: с- помощью адекватных воздействий формировать локальную перестройки возбудимости на участке мембраны меньшем, чем 1/300 часть площади соматической мембраны клетки. Процесс формирования пластических реакций па этане появления нового типа ответов сопровождается максимальным изменением ионных токов на участке клетки, однако когда пластические изменения реакции нейронов уже сформированы, параметры ионных токов возвращаются к исходному уровню Впервые получены данные о том, что сочетанное применение экстремальных воздействий направленных на, активацию защитных механизмов клетки и низких концентраций исследуемых веществ индуцируют формирование долговременных адаптивных реакций, которые проявляются в снижении шветов нейронов на физиологические концентрации этих веществ. Впервые показано, что экспериментально вызванная модификация: процессов^ реорганизации структуры актинового или тубулинового цитоскеяета сомьь нейронов оказывает влияние на развитие и сохранение нейрональной пластичности.. Теоретическая и практическая значимость результатов Обнаружение локальных пластических изменений: возбудимости соматической. мембраны нейронов имеет теоретическое значение для оценки информационной емкости нервной системы. Полученные результаты о влиянии экспериментальной модификации реорганизации цитоскелета па динамику формирования и сохранения изменений нейрональных реакций позволяют составить более полное; представление: о функциональной гетерогенности соматической мембраны и; о роли цитоскелета в структурной организации процессов; нейрональной пластичности. Представления и концепции- о структурной организации рецепции и передачи сигналов на: клеточно-молекулярном уровне сформироваїшсь, в-, основном, в исследованиях синаптической пластичности возбуждающих синапсов млекопитающих. Данные,, полученные на эвошоционно более древнем объекте, чем, млекопитающие, на соматическом компартменте нейронов моллюсков, имеют самостоятельную научную ценность. Эти. данные придают универсальность представлениям о структурной организации передачи сигналов и роли цитоскелета в интеграции и организации физического взаимодействия молекул участников,процессов, которые формируют пластические изменения ответов нейронов. Экспериментальный прием сочеташюго применения экстремальных стимулов и низких концентраций веществ позволил обнаружить, что экстремальные стимулы l могут индуцировать клеточные процессы, направленные на усиление биологической значимости слабых: воздействий' (низких концентраций веществ); и снижать<реакции нейронов на физиологические-концентрации: этих веществ. Этот экспериментальный прием- может найти: клиническое- применение к служить основой: для. исследований молекулярных, механизмов действия- низких: концентраіши веществ в- норме и при различных патологических состояниях. Основные положения, выносимые на защиту: 1; Сома нейрона - может реагировать на локальные воздействия как функционально гетерогенная структура. 2. Воздействия \\ъ. небольшие: участки соматической мембраны по алгоритмам: 3. Экстремальные, воздействия могут индуцировать клеточные процессы,, 4. Изменения: ионной проницаемости мембраны сопровождают пластические 5. Структурная реорганизация цитоскелета нейронов является одним из механизмов пластических изменений реакций нейронов. Апробация работы Результаты работы докладывались на всесоюзных и международных симпозиумах, Congress of Physiological Sciences 1UPS, St.-Petersburg, Russia, 1997; 5th East European Conference of the international society for invertebrate neurobiology. Moscow, 1997; II International symposia Modem problems of laser physics (MPLP-97), Novosibirsk, 1997; III Съезд физиологов Сибири и Дальнего Востока. Новосибирск, 1997; XV11 съезда физиологов России, Ростов-на-Дону 1998; Международная конференция "Рецепция и * 14 внутриклеточная сигнализация", Пущино, 1998; П Съезд Биофизиков России, Москва, 1999; Int. Symp. dedicated to academician. L Pavlov's 150-anniversary, St.-Petersburg, 1999; International conference "Conceptual advances in the studies of associative learning and memory" Moscow, 1999; III Международный симпозиум "Механизмы- действия сверхмалых доз". Москва, 2002; VII East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology "Simpler Nervous Systems" Kaliningrad, 2003; Ш Съезд Биофизиков, России, Воронеж, 2004; XIX Съезд Физиологического Общества.им. И.П. Павлова, Екатеринбург, Россия, 2004. Публикации. По теме диссертации опубликовано 47 научных работ в отечественной и зарубежной печати. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора-литературы, описания материалов и методов, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 197 страницах, содержит 28 рисунков. Список литературы включает 404 источника, из них 34 отечественных.
PLC - фосфоляпаза С
ассоциативной' и не ассоциативной стимуляции, могут вызывать кратковременные
изменения ответов нейронов, которые имеют ряд типичных характеристик, обнаруженных
на: более высоком организмешюм уровне: дифференцировка; воздействий
(пространственная и по интенсивности), сокращение при повторных сессиях количества
воздействий, необходимых для выработки пластических реакций.1
направленные на формирование новых приспособительных реакций и усиление
биологической значимости слабых воздействий..
перестройки ответов нейронов. Для поддержания процессов формирования и сохранения
пластических изменений ответов нейронов необходима активация структурных
перестроек молекулярной морфологии с участием актинового и тубулинового цитоскелета
нейронов.
конференциях, съездах. В том числе на: Vllth international Neurobiologjcal Symposium,
Magdeburg, 1985; VI Пражский междунар. сими. Соц. стран, ЧССР, Прага. 1988; Second
Intern. Conf. "Molecular electronics and biocomputers", Moscow. 19S9; Всес. симп.
"Одиночные ионные каналы в биологических мембранах"", Пущине 1989; Ш Всесоюз.
конф. по нейронаукам. Киев, 1990; Всесоюз. симп. "Ионные каналы в биологических
мембранах", Кара-дат, 1990; Второе совещ. "Физические основы построения устройств
обработки информации на молекулярном уровне", Москва, 1990; Fourth conference on the
neurobiology of learning and memory. Irvine, USA, 1990; International workshop
"Gangliosides: the pharmacology of neuronal plasticity", Italy, 1991; Всесоюз. школа-семенар
по биомолекулярному компьютингу. Москва, 1991; Конф. "Простые нервные системы",
Минск, 1991; Symposium Russian Neural Net-works Society and the Institute of Electrical and
Electronics Engineers, "Neuroinformatics and Neurocomputers", Rostov-on-Don, 1992;
Междунар. конф. Проблемы нейрокибернетики. Ростов-на-Дону, 1992; International
Symposium Simple nervous systems. IS1N Pushchino, 1994; International Symposium
Physiological and biochemical basis of brain activity. St.-Petersburg, 1994; Всероссийский
* семинар "Нейроинформатика и ее приложения", Красноярск, 1995; II XXXIII InternationalПохожие диссертации на Пластические реакции нейронов in vitro. Структурно-функциональные взаимодействия молекулярных комплексов в процессе формирования адаптивных реакций
