Введение к работе
Актуальность проблемы
Хорошо известно, что в возбудимых клетках и, в частности, в кардиомиоцитах механические переменные, прежде всего, деформация миокарда оказывает влияние на внутриклеточный потенциал покоя (ПП), контролируя при этом условия возникновения потенциала действия (Камкин и др., 2003; Камкин, Каменский, 2004; Lab, 1996; Taggart, 1996; Franz, 2000; Taggart, Lab, 2008). Данный феномен получил название механоэлектрической обратной связи (МЭС) в миокарде. Выраженность МЭС существенно возрастает при увеличении нагрузки на сердце вне зависимости от того, связано ли это с интенсивными физическими нагрузками или же развитием патологических изменений в сердечной мышце. Это влечет за собой, прежде всего, глобальные изменения в структуре сердечного ритма, которые могут приводить к фибрилляции желудочков.
Согласно данным ВОЗ различные нарушения ритма сердца являются первостепенной причиной внезапной смерти человека. В этой связи актуальность затронутой проблемы приобретает необычайную важность, поскольку для успешного предупреждения и лечения нарушений ритма сердца необходимо ясно представлять молекулярные механизмы, лежащие в основе механоэлектрического преобразования в кардиомиоцитах.
Традиционно, описание МЭС связывают с идентификацией и исследованием свойств специфических механочувствительных (МЧ) каналов в мембране клетки. Экспериментально установлено существование как неселективных, так и селективных активируемых растяжением каналов для различных типов ионов (Камкин и др., 2000, 2001, 2002; Ravens, 2003; Kamkin et al., 2003; Isenberg et al., 2005; Baumgarten, 2007; Nishimura et al., 2008).
Вместе с тем, даже самые детальные подробности строения МЧ каналов не дают представления о том, как происходит трансформация механического стимула (растяжения) в электрофизиологический или биохимический ответ клетки. Существует несколько теорий для объяснения механоэлектрических преобразований в клетке. Одна из них, как полагают некоторые авторы, применима ко всем эукариотическим клеткам, подразумевает участие субмембранных структур цитоскелета (кортекса) в реализации МЭС (Hamill, Martinac, 2001; Baumgarten, 2007; Chalfie, 2009; Sachs, 2010). Доказательства необходимости присутствия
актинового кортикального цитоскелета для механопреобразования получены в многочисленных исследованиях с применением цитохалазина, ингибитора полимеризации фибриллярного актина (Казанский и др., 2000; Wang et al., 2002; Isenberg et al., 2003; Karpushev et al., 2010).
Цитоскелет, особенно в субмембранной области, представляет собой рыхлую сеть биополимеров, образованную F-актином и множеством сопутствующих актин-связывающих белков (Weihing, 1985; Pullarkat et al., 2007; Baumgarten, 2007). Установлено, что концы молекулы филамина могут взаимодействовать с нитями актина, образуя между ними сшивки, тем самым, детерминируя трехмерное расположение актиновых филаментов (Weihing, 1985; Matsudaira, 1991). Кроме того, в клетках, обеспечивающих подвижность, обнаружен регуляторный белок р53 (JMY), который определяет формирование ансамблей актина в рыхлые сети (Wrighton, 2009).
С физико-химической точки зрения, трехмерные белковые структуры цитоскелета, погруженные во внутриклеточный раствор самых различных ионов, могут рассматриваться как полиэлектролитные гидрогели – то есть трехмерные полимерные сетки, несущие электрические заряды, локализованные на макромолекулярных нитях, и содержащие большое количество жидкой среды с распределенными в ней подвижными ионами. Необычайное сходство особенностей структуры синтетических и биологических полиэлектролитных гелей было отмечено рядом исследователей (Ling, 1990, 2003; Pollack, 2001, 2006).
Изучение свойств интактного цитоскелета в значительной мере лимитировано наличием множества взаимосвязанных явлений и процессов в клетке. Поэтому в исследованиях роли цитоскелета в регулировании клеточных функций широко используются математические и физические модели, которые с долей допущений, воспроизводят основные черты и свойства выбранного объекта (Guilak et al., 2006; Mofrad, 2009).
В настоящей работе предлагается оригинальная экспериментальная модель цитоскелета на основе синтетических полиэлектролитных гидрогелей. Результаты изучения характеристик модельного цитоскелета позволили сформулировать новое теоретическое толкование совокупности экспериментальных фактов проявления механоэлектрических взаимоотношений в миокарде с позиции, согласно которой возможный молекулярный механизм МЭС тесно сопряжен с физико-химическими свойствами цитоскелета.
С точки зрения гелеподобной природы цитоскелета роль деформации в регулировании электрической активности миокарда может быть рассмотрена исходя из фундаментальных законов взаимодействия полимерных нитей цитоскелета со средой. Данный подход, опирающийся на универсальность законов для объяснения физических и биологических явлений, дает возможность по-новому взглянуть на природу ряда фактов, теоретическое обоснование которых открывает широкие возможности для диагностики и лечения заболеваний сердца.
Цель работы состояла в разработке теоретических основ молекулярного механизма механоэлектрического преобразования в миокарде путем использования методов экспериментального моделирования. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи исследования:
-
В экспериментах на изолированном миокарде лабораторных животных и препаратах сердечной мышцы человека, выделенных в ходе кардиохирургических операций, выявить влияние растяжения миокарда на электрическую активность кардиомиоцитов.
-
В экспериментах на изолированном миокарде животных установить механизмы регулирования величины растяжения мышцы в норме и патологии.
-
Теоретически обосновать и разработать экспериментальную модель цитоскелета на основе синтетических полиэлектролитных гидрогелей.
-
Количественно охарактеризовать механические и электрические свойства экспериментальной модели цитоскелета.
-
На экспериментальной модели цитоскелета определить факторы, регулирующие степень выраженности МЭС.
-
Сформулировать представления о механизме механоэлектрических преобразований в миокарде на основе сопоставления экспериментальных фактов, полученных на биологических и синтетических объектах.
Научная новизна работы
Установлено, что в условно нормальном изолированном миокарде желудочков животных и человека в физиологическом диапазоне растяжений сердечной мышцы механоэлектрическая обратная связь выражена слабо. Возникновение патологических отклонений в сердце различного генеза приводит к увеличению степени влияния
растяжения миокарда на внутриклеточный потенциал, что может провоцировать возникновение спонтанных ПД.
Разработана экспериментальная модель неоднородности миокарда, состоящая из препаратов миокарда механически соединенных в последовательный тандем, и взаимодействующих друг с другом за счет компьютерных средств управления экспериментом в составе стенки сферического желудочка в реальном масштабе времени.
Экспериментально обосновано, что в систолический период сердечного цикла регионы сердечной стенки растягиваются вследствие механической асинхронности в сердце, возникновение которой связано как с различием в структуре, так и функции участков сердечной стенки.
Выяснено, что в качестве экспериментальной модели трехмерной структуры цитоскелета могут быть использованы полиэлектролитные гидрогели на основе акриловой и полиметакриловой кислот. Разработаны критерии синтеза гелей с учетом подобия особенностей структуры цитоскелета, в частности, качественного сходства в степени сшивки и заряженности полимерных нитей, в использовании ключевых физиологически значимых противоионов.
Установлено, что электрический потенциал внутри геля и внутриклеточный потенциал имеют близкое по величине значение, которое зависит от степени набухания геля, его ионизации и плотности сшивки полимерной сети, а также от ионной силы раствора, в которую гель помещен.
Установлено, что механические свойства гидрогелей качественно и количественно схожи с характеристиками цитоскелета, и зависят от особенностей структуры, прежде всего, от плотности сшивки полимерной сети.
Обнаружено существование механоэлектрической связи в синтетических гидрогелях, выраженность которой зависит, в первую очередь, от упругих свойств полимерной сети.
Предложен механизм механоэлектрических преобразований в возбудимых клетках, в котором ключевая роль отводится универсальному физическому явлению конденсации зарядов на полимерной сети при ее растяжении.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
1. Существование механоэлектрической обратной связи в миокарде сопряжено с физико-химическими свойствами полимерной сети
цитоскелета, которые могут быть определены с высокой степенью адекватности на синтетических гидрогелях, выбранных в качестве экспериментальной модели цитоскелета.
-
Величина внутриклеточного потенциала в клетке зависит от ряда физико-химических характеристик цитоскелета, среди которых ключевую роль играет степень набухания и плотность сшивки полимерной сети.
-
Степень выраженности механоэлектрической обратной связи в клетке зависит от совокупности факторов, регулирующих ионный баланс между цитоскелетом и окружающей его средой, однако, при прочих равных условиях плотность сшивки полимерной сети выступает главным детерминантом механоэлектрического преобразования в миоците.
-
Механизм регулирования механоэлектрических взаимоотношений в клетке базируется на универсальном законе физики полимеров, и связан с конденсацией электрических зарядов на полимерной сети цитоскелета при ее осевой деформации.
Теоретическая значимость работы
Работа углубляет современные представления в области физиологии клетки и электрофизиологии о роли цитоскелета в регулировании электрической функции клетки за счет рассмотрения этого объекта с точки зрения трехмерной сети биополимеров, погруженной в цитозоль. В диссертационном исследовании оценен вклад цитоскелета в ионный баланс клетки в зависимости от степени ее растяжения с позиции фундаментальных физико-химических законов и явлений.
Практическая значимость работы
-
Разработанная экспериментальная модель цитоскелета может быть использована в фундаментальных исследованиях для выяснения роли цитоскелета в регулировании механической и электрической активности мышечных клеток.
-
Модель также может быть использована для тестирования механизмов антиаритмического действия фармакологических агентов при моделировании патологических ситуаций в миокарде.
-
Методические аспекты работы по направленному синтезу гидрогелей и научные основы о механизмах регулирования в гелях механической и электрической активности могут составить
теоретическую основу для создания искусственных биосовместимых протезов мышечной ткани.
Внедрение результатов работы
Материалы диссертационного исследования внедрены в педагогический процесс на кафедре медицинской физики УГМА в общем курсе лекций «Современная научная картина мира», а также на кафедре молекулярной физики ИЕН УрФУ в специальных курсах лекций «Молекулярная природа биологической подвижности» и «Общая биология для физиков (раздел «цитология»)».
Апробация работы
Основные положения исследования были представлены на ряде отечественных и зарубежных конференций, симпозиумов и съездов в форме стендовых докладов и устных сообщений. В частности, на Всемирном конгрессе «Клеточная и молекулярная биология», Франция, 2005; на 18 и 21 Российских конференциях «Проблемы теоретической и экспериментальной химии», Екатеринбург, 2008 и 2011; на Международных конференциях «Биологическая подвижность», Пущино, 2008 и 2010; на Международном конгрессе «Кардиология на перекрестке наук», Тюмень, 2010; на 17 Международной конференции «Механика в биологии и медицине», Польша, 2010; на 19 Международной конференции «Научного общества исследователей сердечнососудистой динамики», Япония, 2010. Работа была официально апробирована на межкафедральном заседании сотрудников ГБОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия с участием специалистов сторонних организаций.
Публикации
По материалам исследования опубликовано 60 печатных работ, из которых 17 в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем работы
Работа изложена по стандартной схеме и состоит из введения, обзора литературы, методического раздела, трех экспериментальных глав и обсуждения результатов. Манускрипт содержит 220 страниц текста и иллюстрирован 61 рисунком и 13 таблицами. Список литературы включает 323 цитируемых источника.
