Содержание к диссертации
Список сокращений 6-7
1. Введение 8-11
2. Обзор литературы 12-87
2.1. Роль липидов в структуре и функциях биологических мембран 12-31
2.1.1. Структурная роль 12-15
2.1.2. Функциональная роль 16-22
2.1.3. Роль в мембранах хлоропластов 23-27
2.1.4. Биологическое значение неламеллярной фазы липидов 28-31
2.2. Особенности фосфолипидного и жирнокислотного состава морских беспозвоночных 31-37
2.2.1. Сезонные изменения фосфолипидного и жирнокислотного состава морских беспозвоночных 34-37
2.3. Особенности состава полярных липидов и жирных кислот морских макрофитов 37-48
2.3.1. Влияние температуры на липидный состав растений 44-48
2.4. Мезогенность и термотропное поведение полярных липидов в модельных системах и биологических мембранах 49-85
2.4.1. Мезогенность и фазовые переходы фосфолипидов 49-51
2.4.2. Зависимость термотропных фазовых переходов кристалл (гель) - жидкий кристалл полярных липидов от структуры жирнокислотных радикалов 52-59
2.4.3. Влияние головных групп на вязкость и термотропные фазовые переходы полярных липидов
2.4.4. Фазовое разделение и структурная асимметрия липидов в биологических мембранах 62-67
2.4.5. Сфингомиелин в биологических мембранах 67-71
2.4.6. Влияние холестерина на фазовые переходы фосфолипидов 71-76
2.4.7. Влияние гидратации на параметры фазовых переходов фосфолипидов 76-77
2.4.8. Влияние температуры окружающей среды на вязкость и температуру фазового перехода липидов биологических мембран 77-85
2.5. Заключение 86-87
3. Материалы и методы 87-99
3.1. Биологические объекты 87-88
3.1.1. Морские беспозвоночные 87-88
3.1.2. Морские макрофиты 88
3.2. Приборы и оборудование 88-89
3.3. Экстракция липидов 89
3.4. Макро-и микротонкослойная хроматография липидов 89-91
3.4.1. Приготовление пластин 89
3.4.2. Системы растворителей для разделения липидов 89-90
3.4.3. Обнаружение липидов 90-91
3.5. Количественное определение липидов 91-93
3.5.1. Определение общих липидов 91
3.5.2. Определение фосфолипидов 92
3.5.3. Определение гликолипидов и бетаиновых липидов 92
3.5.4. Определение свободных стеролов 93
3.5.5. Анализ количественных результатов 93
3.6. Колоночная хроматография липидов 93-94
3.6.1. Разделение фосфолипидов морских беспозвоночных 93
3.6.2. Разделение липидов морских макрофитов 94
3.7. Очистка липидов с помощью препаративной ТСХ 94
3.8. Разделение ФХ из голотурии на фракции 95
3.9. Подготовка гидратированных фосфолипидов морских беспозвоночных 95
3.10. Подготовка смесей холестерина с фосфатидилхолином из асцидии 95
3.11. Калориметрический анализ липидов 96
3.12. Определение температуры изотропного плавления липидов методом поляризационной микроскопии 96
3.13. Анализ состава жирных радикалов полярных липидов 96-97
3.14. Рентгеноструктурный анализ 98
3.15. Анализ ИСКОМ-образующей способности гликоглицеролипидов 98
3.16. Анализ криопротекторных свойств липидных экстрактов 98-99
4. Результаты и обсуждение 100-245
4.1. Термотропное поведение фосфолипидов морских беспозвоночных 101-185
4.1.1.Фазовые переходы кристалл - жидкий кристалл фосфатидилхолина из мышечной ткани морских беспозвоночных 101-113
4.1.2. Фазовые переходы кристалл - жидкий кристалл фосфатидилэтаноламина из мышечной ткани морских беспозвоночных 113-121
4.1.3. Сезонные изменения термотропного поведения фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина из разных органов пурпурной асцидии Halocynthia aurantium 122-135
4.1.4. Термотропное поведение фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина морских беспозвоночных при тепловой акклимации и сезонной акклиматизации 135-148
4.1.4.1. Калориметрические исследования 135-141
4.1.4.2. Исследования с помощью поляризационной микроскопии 141-143
4.1.4.3. Состав жирных радикалов 143-148
4.1.5. Влияние состава жирных кислот на структуру термограммы фазового перехода фосфатидилхолина из голотурии Cucumaria fraudatrix 148-156
4.1.6. Фазовые переходы жидкий кристалл - изотропный расплав фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина морских беспозвоночных 156-161
4.1.7. Влияние гидратации на фазовые переходы фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина морских беспозвоночных 161-171
4.1.8. Влияние холестерина на фазовые переходы фосфатидилхолина из асцидии Halocynthia aurantium 171-175
4.1.9. Термотропное поведение сфингофосфосфолипидов морских беспозвоночных 175-185
4.2. Термотропное поведение и состав полярных липидов морских макрофитов 185-237
4.2.1. Состав липидов в летний и зимний сезоны 185-189
4.2.2. Термотропное поведение полярных липидов при смене сезонов 189-205
4.2.2.1. ДСК исследования 190-196
4.2.2.2. Сезонные изменения 196-198
4.2.2.3. Поляризационная микроскопия 198-205
4.2.3. Состав жирных кислот полярных липидов морских макрофитов 205-223
4.2.3.1. Фосфолипиды 207-214
4.2.3.2. Гликоглицеролипиды 214-220
4.2.3.3. Бетаиновые липиды 221-223
4.2.4. Сезонные изменения состава жирных кислот полярных Липидов 223-236
4.2.5. Суперструктуры гидратированных гликолипидов Laminariajaponica 236-237
.3. Перспективные направления для использования физико-химических свойств полярных липидов морских гидробионтов 237-242
4.3.1. ИСКОМ-образующая способность гликоглицеролипидов из Laminaria japonica 237-240
4.3.2. Криопротекторные свойства липидов из морских гидробионтов 240-242
Заключение 243-245
Выводы 246-248
Литература 249-285
Приложение 286
Введение к работе
Одной из важнейших проблем современной биологии является расшифровка механизмов реагирования различных организмов на изменение условий их существования. В процессе эволюции у клеток выработались приспособления, позволяющие воспринимать, преобразовывать и усиливать сигналы физической и химической природы, поступающие из окружающей среды, и с помощью генетического аппарата реагировать на них, адаптируясь к изменившимся условиям, перестраивая свой обмен веществ (Тарчевский, 2002). Ключевое место во взаимосвязи между окружающей средой и клеточным ответом занимают биологические мембраны, являющиеся одной из универсальных систем передачи информации. В осуществлении этих и других фундаментальных функций мембран активное участие принимает липидный матрикс, который является первичной мишенью для многих факторов окружающей среды и, прежде всего, наиболее мощного из них - температуры. Основой всех биологических мембран являются полярные липиды, которые благодаря своей уникальной химической структуре самоорганизуются в надмолекулярный ансамбль - жидкокристаллический бислой. Как ни парадоксально, но понимание роли жидкокристаллических свойств липидного бислоя в процессах взаимодействия клетки с окружающей средой происходит с большим трудом, несмотря на то, что многие фундаментальные свойства живого, в том числе чувствительность, раздражимость, а, следовательно, и адаптационные механизмы невозможно понять только исходя из биохимических превращений веществ в клетке, игнорируя надмолекулярный уровень их организации. Наиболее важными для решения многих биологических проблем являются такие свойства жидких кристаллов как кооперативность и векторность, которые обеспечивают способность жидкокристаллических структур реагировать на различные внешние воздействия (температура, электромагнитные излучения, химические вещества и другие), направленно изменяя свои физическо-химические свойства. Благодаря кооперативным свойствам жидкокристаллического бислоя взаимодействие мембраны с окружающей средой реализуется по принципу «все или ничего», что позволяет сразу вовлекать в процесс восприятия и последующего преобразования сигнала множество молекул как липидов, так и белков. В результате мембрана и вся клетка в целом оказывается на новом структурно-функциональном уровне (Конев, 1987).
Наиболее ярким примером таких процессов являются термоидуцированные фазовые переходы мембранных липидов кристалл (гель) - ламеллярный жидкий кристалл - неламеллярная фаза, которые лежат в основе термоадаптации эктотермных организмов (Hazel, 1995; 1997). Им отводится роль наиболее вероятных ключевых процессов, определивших эволюцию терморегуляции животных (Харакоз, 2001).
Липидный бислой исполняет роль термосенсора, непосредственно взаимодействующего и реагирующего на изменения температурных условий существования, запуская жизненно важный для эктотермных организмов механизм гомеовязкостной адаптации (Sinensky, 1974). Согласно общепринятой концепции гомеовязкостной адаптации для осуществления многочисленных мембраносвязанных функций эктотермным организмам необходимо поддерживать жидкокристаллическое состояние липидов мембран, что осуществляется, прежде всего, за счет регулирования липидного состава в ответ на изменение температуры окружающей среды (Logue et al, 2000). Этот феномен наблюдается в разных группах эктотермных организмов: животных (Behan-Martin et al, 1993), растениях (Garab et al, 2000) и бактериях (Morein et al, 1996). Процесс поддержания оптимальной вязкости мембран эктотермных организмов включает различные изменения липидов мембран, но главное место отводится компенсаторным изменениям в структуре ацильных цепей полярных липидов (Hazel, 1995). Особенно сильным инструментом, воздействующим на фазовое состояние липидов, является ненасыщенность их жирных кислот, которая регулируется мембраносвязанными ферментами - десатуразами. В свою очередь активность десатураз зависит от физического состояния липидного окружения (Лось, 2001). Изменение активности других мембраносвязанных ферментов -фосфолипаз, аденилатциклазы и других также определяется вязкостью их липидного окружения, критический уровень которой приводит к запуску сигнального каскадного механизма трансдукции сигнала (Hindenes et al, 2000; McKinley, Hazel, 2000). Последние данные свидетельствуют о том, что именно термоиндуцированные изменения в фазовом поведении фосфолипидов играют инициирующую роль в запуске ответа теплового шока в эктотермных организмах (Samples et al, 1999; Torek et al., 2003), а не денатурированные белки, как это предполагалось ранее.
Хотя концепция механизма регуляции вязкости липидов мембран, получившая название гомеовязкостной адаптации, была предложена более 30 лет назад, до сих пор исследования фазовых переходов природных липидов мембран эктотермных организмов занимают скромное положение в общем массиве исследований физико-химических свойств липидов. Основное внимание уделяется фазовым переходам синтетических и полусинтетических индивидуальных липидов (Koynova, Caffrey, 1994а, b, 1998) или наоборот очень сложных систем, таких как биологические мембраны или общие липиды. Промежуточный этап исследований - термотропное поведение индивидуальных классов природных липидов мембран, крайне ограничен. Особенно мало информации о физико-химических свойствах главных растительных липидов - гликоглицеролипидов (Koynova, Caffrey, 1994а). Термоиндуцированные переходы жидкий кристалл-»изотропная фаза полярных липидов биологических мембран практически не изучены, хотя они имеют прямое отношение к адаптации эктотермных организмов к супраоптимальным температурам окружающей среды.
С другой стороны, главными объектами изучения процессов гомеовязкостной адаптации традиционно являются бактерии и рыбы, тогда как термотропное поведение липидов таких филогенетически разнообразных, экологически и коммерчески важных эктотермных организмов как морские беспозвоночные и макрофиты до сих пор остается не изученным. Морские беспозвоночные и макрофиты представляют разные царства живых организмов, образующих многочисленные биоценозы. Липидный состав обеих групп организмов используется для исследования пищевых взаимоотношений в морских экосистемах, хотя при этом часто игнорируется его генетическая детерменированность, установленная как для морских беспозвоночных (Костецкий, 1985), так и морских макроводорослей и трав (Хотимченко, 2003). Исследования механизмов их термоадаптации на молекулярном и надмолекулярном уровнях организации липидного бислоя биологических мембран имеет теоретическое и прикладное значение, поскольку позволяют не только понять таксономические особенности поддержания оптимального фазового состояния липидного матрикса мембран, но и оценить способность организмов выживать при различных температурах морской воды. Это особенно актуально в современных условиях заметного изменения климата, а также для рационального разведения марикультуры. Экологические и экономические последствия изменения климата в полном объеме оценить в настоящее время не представляется возможным, хотя уже сейчас имеются факты, свидетельствующие о глобальном характере таких воздействий. Общеизвестными являются факты массовой гибели морских организмов под воздействием теплого экваториального течения Эль-Ниньо, а также при небольшом повышении температуры морской воды в Северном и Баренцевом морях. Особенно уязвимыми в условиях изменения климата оказываются эктотермные организмы, рост, развитие и функционирование которых, в основном, определяются температурным фактором среды обитания.
Цель нашего исследования состояла в сравнительной оценке изменений как в термоиндуцированных фазовых переходах кристалл - жидкий кристалл -изотропный расплав, так и в составе жирных радикалов основных липидов мембран филогенетически различных видов морских беспозвоночных и макрофитов при температурной акклиматизации и акклимации и выяснении возможной роли этих липидов, их структурных и композиционных особенностей в термоадаптации этих организмов как к низким, так и высоким температурам для того, чтобы понять молекулярно-биохимические особенности ключевого механизма термоадаптации этих двух обширных групп морских экосистем, оценить их способность к выживанию в условиях происходящих на земле глобальных изменений климата, а также наметить перспективные направления для практического использования полученных результатов.
