Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1. Разновидности матриксов для тканевой инженерии 16
1.1. Имплантируемые матриксы 18
1.1.1. Иммуноизолирующие системы 19
1.1.2. Открытые системы 23
1.2. Экстракорпоральные системы 28
2. Биодеградируемые полимерные материалы для биоискусственных органов и тканей 31
2.1. Синтетические биодеградируемые материалы 32
2.2. Материалы природного происхождения 37
2.3. Полиоксибутират и его сополимеры 43
2.3.1. Физико-химические свойства 43
2.3.2. Биодеградация 46
2.3.3, Биосовместимые свойства 47
2.3.4, Изделия на основе полиоксибутирата и их применение в медицине 49
3. Модифицирование полимерных материалов для тканевой инженерии 52
Глава 2. Материалы и методы 56
1. Материалы 56
2. Методы оценки физико-химических и физико-механических свойств образцов матриксов 57
2.1. Метод сканирующей электронной микроскопии 57
2.2. Метод атомно-силовой микроскопии 57
2.3. Метод Фурье-ИК спектроскопии многократно нарушенного полного внутреннего отражения 58
2.4. Метод контактного угла смачивания для определения гидрофильности поверхности матриксов 59
2.5. Метод исследования физико-механических свойств матриксов 60
2.6. Спектрофотометрический метод регистрации высвобождения высокомолекулярного гидрофильного пластификатора 60
3. Методы оценки медико-биологических свойств матриксов 60
3.1. Санитарно-химические испытания 61
3.2. Медико-биологические исследования 62
3.2.1. Испытания в условиях in vitro 62
3.2.2. Испытания в условиях in vivo 67
3.2.3. Испытания на стерильность 72
3.3 Исследование гемосовместимых свойств 73
3.3.1ю Количество и морфология адгезырованных тромбоцитов 73
3.3.2. Спектрофотометрический метод определения степени активации системы комплемента 75
4. Методы исследования биологической функциональности матриксов in vitro и in vivo 76
4.1. Культивирование стволовых клеток костного мозга крыс на образце матрикса 76
4.2. Оценка роста и распластывания фибробластов мыши линии L929 на поверхности матрикса с использованием метода конфокальной микроскопии 77
4.3. Экспериментальные модели in vivo механических повреждений скелетной мышцы крыс и глубоких ожоговых ран 80
Глава 3. Результаты и их обсуждение 85
1. Состав и методика изготовления пленочного биодеградируемого матрикса 85
1.1. Приготовление эластичных пленок 85
1.2. Выбор оптимального состава 87
2. Морфология и физико-химические свойства ЭластоПОБ 89
3. Медико-биологические свойства ЭластоПОБ 94
3.1. Санитарно-химические испытания 94
3.2. Медико-биологические исследования 95
3.3. Исследования на гемосовместимость 100
4. Биологическая функциональность ЭластоПОБ in vitro и in vivo 103
4.1. Культивирование стволовых клеток костного мозга крыс и фибробластов мыши линии L929 на образце ЭластоПОБ in vitro 103
4.2 Функциональные свойства ЭластоПОБ in vivo 108
4.2.1. Восстановительная терапия механических повреждений скелетной мышцы крыс 108
4.2.2. Восстановительная терапия глубоких ожоговых ран 115
Заключение 122
Выводы 125
Практические рекомендации 127
Список литературы
- Иммуноизолирующие системы
- Физико-химические свойства
- Метод атомно-силовой микроскопии
- Морфология и физико-химические свойства ЭластоПОБ
Введение к работе
Актуальность работы
Анализ работ в области трансплантологии и искусственных органов, появившихся к концу XX - началу XXI столетия, дает основание говорить о том, что ученые пока не пришли к формированию искусственной биосовместимой поверхности, аналогичной по своим свойствам, например, интиме кровеносных сосудов. Исследователи также далеки от создания искусственных органов на основе только синтетических материалов с заданными и контролируемыми свойствами. В связи с этим, в последние годы основной акцент сделан на использование технологий генной и клеточной (в зарубежной литературе - тканевой) инженерии для разработки материалов и имплантатов, наделенных структурой и функцией биологических тканей. Такие имплантаты и системы стали называть биоискусственными или гибридными [37, 38, 125]. Биоискусственные системы представляют собой сочетание биостабильного или биодеградируемого матрикса (каркаса, носителя) на основе материалов различной природы и нативных биологических структур (например, биологически активных молекул, факторов роста клеток, белков плазмы крови, функционирующих клеток различных органов и тканей) [5, 28].
Одной из ключевых проблем в создании биоискусственных материалов и органов является разработка двухмерных (пленочных) и трехмерных (губки, гели) матриксов {синонимы: матрицы, каркасы, носители). Существенным недостатком известных по открытой печати зарубежных матриксов (DegraPol/btc - композит полиоксиалканоатов с полиуретанами [139], Vicril - сополимер молочной и гликолевой кислот [67], синтетический гетерогенный гидрогель Neurogel - полимер [>Ц2-гидроксипропил)-метакриламида] [165] и PuraMatrix на основе олигопептидных фрагментов) [180] является то, что они полностью или частично состоят из синтетических
полимерных материалов. Это, несомненно, отрицательно влияет на их биологическую безопасность, увеличивает вероятность образования рубцовых тканей и опухолей, что и сдерживает их внедрение в клиническую практику.
Трансплантация стволовых клеток, а также дифференцированных клеток органов и тканей является наиболее перспективным направлением в современной трансплантологии и обещает стать мощным инструментом в лечении разнообразных заболеваний. Актуальной остается разработка технологий, позволяющих прицельно доставлять жизнеспособные клетки в патологический очаг, удерживать их там и создавать им условия для нормального функционирования. Ряд протоколов предписывает введение суспензии клеток в кровяное русло или в очаг поражения [15, 16, 24, 29]. Данные методики имеют ряд ограничений и недостатков, наиболее существенными из которых являются сложность контроля локализации клеток в месте повреждения и их низкая жизнеспособность [96]. Трансплантация клеток на имплантатах-носителях может существенно повысить эффективность данного способа восстановления функций жизненно важных органов и тканей [28].
Наибольший интерес для разработки биоискусственных систем
представляют полимеры природного происхождения и их производные;
альгинаты, коллаген, желатин, хитозан, гиалуроновая кислота, полиэфиры
бактериального происхождения. Многие биополимеры, обладая высокой
биосовместимостью, являются также высокоэффективными
биостимуляторами. При имплантации они расщепляются на более простые соединения, которые выводятся из организма, либо принимают активное участие в метаболизме на клеточном уровне.
Одними из перспективных полимеров медицинского назначения являются полиэфиры бактериального происхождения: гомополимеры (3-оксимасляной кислоты (полиоксибутират) и оксиоктановой кислоты, а также двухкомпонентные сополимеры р-оксибутирата и р-оксивалерата,
обладающие термопластичностью и биодеградируемостью, а также широким набором физико-химических и физико-механических свойств. [5]. Область применения бактериальных полимерных материалов для медико-биологических целей включает изготовление шовных и перевязочных материалов, биосовместимых покрытий для имплантатов, контролируемых систем доставки лекарственных веществ и др.
Известны единичные попытки использования бактериальных полимеров в качестве носителей для культивирования и трансплантации клеток органов и тканей [5, 49, 155]. Однако полиоксибутират и его сополимеры относятся к гидрофобным полимерам, что отрицательно влияет на прикрепление и пролиферацию клеток. Кроме того, общеизвестными недостатками образцов гомополимера и сополимеров являются хрупкость и недостаточная эластичность, существенно ограничивающие их применение.
Нами было высказано предположение, что введение в состав бактериального полимера высокомолекулярного гидрофильного агента улучшит механические свойства и повысит гидрофильность материала без ухудшения биосовместимых свойств биополимера.
Цель работы
Целью работы является разработка и исследование физико-химических и биологических свойств биодеградируемого матрикса на основе бактериального полимера для трансплантации клеток.
Основные задачи работы
Исходя из поставленной цели, задачи работы сводились к следующему:
Разработка технологии получения пленочного биодеградируемого матрикса;
Исследование физико-химических свойств матрикса;
Доказательство биосовместимости матрикса в соответствии с межгосударственными стандартами ГОСТ Р ИСО 10 993;
Исследование в условиях in vitro влияния матрикса на процессы прикрепления и пролиферации культур фибробластов и стволовых клеток животных;
Доказательство возможности применения матрикса для восстановительной клеточной терапии в экспериментальных моделях на животных.
Научная новизна разработки
Разработан биополимерный пленочный матрикс, состоящий из бактериального сополимера и высокомолекулярного гидрофильного пластификатора. Матрикс получил название ЭластоПОБ.
Установлено наличие водородных связей между молекулами сополимера и пластификатора, что приводит к увеличению эластичности матрикса.
В экспериментах in vitro и in vivo доказана высокая биосовместимость лабораторных образцов ЭластоПОБ.
В экспериментальных моделях на животных продемонстрирована эффективность применения матрикса для восстановительной клеточной терапии.
Практическая значимость
Назначение матрикса
Субстрат, выполняющий функции подложки и питательной среды, для культивирования клеток тканей человека и животных в условиях in vitro;
Имплантируемый биодеградируемый матрикс для биоискусственных органов и тканей, временно выполняющий функции каркаса и питательной среды для клеток тканей различной природы (стволовые
клетки, кардиомиоциты, нервные клетки, гепатоциты, хондроциты, р-клетки, фибробласты и др.).
Возможная область применения
Приоритетной областью применения пленочного биодеградируемого матрикса на основе полимера бактериального происхождения является использование его для культивирования стволовых и предиференцированных клеток с последующей трансплантацией.
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на межинститутских семинарах Центра по исследованию биоматериалов НИИ трансплантологии и искусственных органов (2003, 2004, 2005 гг.); Российском научно-техническом семинаре по биоматериалам IX научно-технической конференции «Вакуумная наука и техника» 18-24 сентября 2004, Судак, Украина; 1-м Всероссийском научном форуме «Инновационные технологии медицины XXI века», 12-15 апреля 2005 г., Москва; ХІІ-м Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», 18-22 апреля 2005, Москва.
Публикации
Результаты проведенных исследований отражены в 7 печатных работах, опубликованных в России и за рубежом.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, 3 глав основного содержания, включая обзор литературы, методическую главу, результаты и их обсуждение, а также заключение и выводы.
Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, содержит 27 рисунков, 16 таблиц, список литературы из 181 наименования, из них 30 российских и 151 иностранное.
Место выполнения работы
Работа была выполнена в ФГУ Научно-исследовательском институте трансплантологаи и искусственных органов Росздрава (директор - академик РАН и РАМН В.И. Шумаков) в Центре по исследованию биоматериалов (руководитель Центра - д.б.н., профессор В.И. Севастьянов).
Иммуноизолирующие системы
Иммуноизолирующие матриксы предназначены для трансплантации аллогенных (полученных от доноров), ксеногенных (полученных от животных) или генетически измененных клеток, которые в обратном случае были бы отторгнуты организмом «хозяина» [38, 130, 132]. Чаще всего их используют для компенсации утраченных биохимических функций, например, при сахарном диабете и при длительной терапии хронических и аутоимунных заболеваний [44, 139, 158]. Основным элементом в иммуноизолирующей системе является микропористая полупроницаемая мембрана с размером пор обычно не превышающим 10 нм, отделяющая трансплантированные клетки от внутренней среды организма реципиента. Мембрана пропускает кислород, низкомолекулярные белки, глюкозу, клеточные метаболиты и блокирует молекулы иммунной системы, такие как лейкоциты, IgG, цитокины, антигены, защищая имплантированные клетки от разрушения, а также препятствует миграции клеток в окружающие ткани. В то же врекмя мембрана предотвращает выделение из имплантата иммуногенных молекул, что делает возможным трансплантацию без последующего применения иммунодепрессантов [97, 158].
Существует три основных формы закрытых имплантируемых матриксов: микрокапсулы, экстраваскулярные диффузионные камеры (включая макрокапсулы) и интраваскулярные диффузионные камеры [25, 36-38,43]. Микрокапсул ы Микрокапсулы представляют собой везикулы, состоящие из «ядра» или «активной зоны», содержащей отдельные клетки или небольшие кластеры клеток и оболочки, представляющей собой полупроницаемую микропористую мембрану.
Для инкапсуляции клеток используют микрокапсулы размером 50-300 мкм. Микрокапсулы имеют относительно высокое соотношение площади поверхности к объему для минимизации диффузионных ограничений. Толщина мембраны может быть менее чем 1 мкм, обеспечивая высокую скорость массопереноса и жизнеспособность иммобилизованных клеток. Для наиболее надежной иммуноизоляции мембрана не должна пропускать компоненты, масса которых превышает 50-80 кДа.
Основным элементом экстра- и интраваскулярных диффузионных камер - также разновидностей иммуноизолирующих матриксов являются полые волокна или макрокапсулы (см. Рис. 2) [36, 84, 88, 127]. Входящие в состав таких матриксов волокна имеют диаметр 200-1500 мкм и толщину стенок 10-300 мкм, что значительно превышает толщину мембраны в микрокапсулах, предел пропускания - 50-100 кДа [37, 38, 130, 132].
Экстра- и интраваскулярные матриксы на основе полых волокон имеют большую механическую целостность и прочность, чем микроинкапсуляционные матрицы. Это особенно важно в случае использования клеток с ограниченным временем жизни. Тем не менее, макроинкапсуляционные матриксы имеют свойственные им недостатки, которые вытекают из диффузионных свойств. Клетки в макрокапсулах не могут существовать при высоких плотностях вследствие ограничений доставки газов и веществ в капсулу, что ведет к гибели клеток [130]. Кроме того, любые клеточные реакции, которые зависят от изменений окружающей среды (например, уровня глюкозы в крови) будут происходить с задержкой во времени равной времени диффузии газов и веществ как внутрь, так и из капсулы, таким образом, создавая задержку между стимулом и необходимым клеточным откликом.
Иммуноизолирующие матриксы и ситемы используют для иммобилизации различных типов клеток, включающих клетки поджелудочной железы (гибридная поджелудочная железа), клетки, выделяющие фактор роста нервов, фибробласты, дофамин-выделяющие адреналовые хромафинные клетки для лечения болезни Паркинсона, паратериоидные клетки для лечения гипокальцемии и тд. [72, 153, 172]. Известно использование микрокапсул на основе полиэлектролитных комплексов альгината с поли-Ь-лизином для клонального роста гематопоэтических клеток костного мозга [105]. Инкапсулированные гепатоциты, вводимые интраперитонеально, в течение небольшого срока (7-10 дней) способны заменять функцию печени. По истечении 4-6 недель инкапсулированные гепатоциты теряют функциональную активность, вероятно, вследствие разрушения капсулы [49].
Физико-химические свойства
В настоящее время идентифицировано свыше 100 различных бактериальных полиоксиалканоатов [149]. Однако реально получаемые и исследуемые ПОА - это гомогенный полиоксибутират (ПОБ) и сополимеры оксибутирата и оксивалерата (ПОБ-со-ПОВ), а также оксибутирата и оксиоктаноата (ПОБ-со-ПОО). ПОБ является внутриклеточным резервным соединением. Накопление ПОБ в бактериях происходит при высоких значениях соотношения углерод/азот в среде, а его распад наблюдается при отсутствии экзогенных источников энергии и углерода [111]. ПОА различного химического состава обладают различной структурой и базовыми физико-химическими свойствами. ПОБ и его сополимеры синтезируются с различными выходами многими прокариотическими микроорганизмами (к настоящему времени их насчитывается свыше 300). Тем не менее, для промышленного применения выделено всего несколько высокопродуктивных микроорганизмов: Ralstonia eutropha, Alcaligenes latus Azoiobacter vinelandii и др. [5].
ПОБ и его сополимеры в ряду физико-химических свойств сходны с широко применяемыми и выпускаемыми, не разрушающимися в природной среде синтетическими полимерами, такими как полиэтилен, полипропилен. Помимо термопластичности, бактериальные ПОА обладают оптической активностью, антиоксидантными свойствами, пьезоэлекетрическим эффектом и, что самое главное, биодеградируемостью и биосовместимостью.
В зависимости от таксонометрического положения и физиолого-биохимических свойств микроорганизмов-продуцентов, условий биосинтеза и типа углеродного субстрата данные полимеры чрезвычайно различаются между собой по структуре и свойствам: гибкости, кристалличности, температуре плавления и др. (Таблица 4) [5].
ПОБ по механическим свойствам сходен с полипропиленом, однако обладает лучшими газобарьерными свойствами и большей устойчивостью к ультрафиолету, характеризуется хорошей водостойкостью и теплоустойчивостью.
ПОБ представляет собой бесцветный гидрофобный полукристаллический полимер. Кристаллическая фаза ПОБ доминирует над аморфной. Степень кристалличности различных образцов ПОБ мало зависит от условий получения и лежит в диапазоне 62 - 76% [112]. Молекулярная масса ПОБ может составлять от нескольких сотен до миллионов Да. Этот параметр зависит от типа используемого продуцента, условий его выращивания, а также метода экстракции полимера из биомассы и применяемых растворителей [50]. Известно, что механическая прочность ПОБ существенно уменьшается, если его молекулярная масса менее, чем 400 000 Да. При низких значениях молекулярной массы (200 000 Да) полимер очень хрупок [46]. Температура размягчения ПОБ (Тр.) лежит в диапазоне 110 - 115 С, плавления (Тпл.) 170 — 185 С, разложения (Тразл.) 270 - 305 С. Второй после ПОБ наиболее изучаемый бактериальный полиоксиалканоат — сополимер оксибутирата с оксивалератом (ПОБ-со-ПОВ). Кристалличность ПОБ-со-ПОВ ниже, чем у ПОБ и в зависимости от соотношения мономеров может лежать в диапазоне 39 — 69% [133]. Механические свойства сополимеров ПОБ-со-ПОВ также в зависимости от состава могут существенно меняться. С увеличением доли оксивалерата полимер становится менее кристалличным и более эластичным и гидрофильным. Для сополимерных образцов характерны более низкие значения температурных параметров по сравнению с гомогенным ПОБ [5].
Применение мономерных полимерных пластификаторов позволяет улучшить свойства бактериальных ПО А. Установлено, что для ПОБ и ПОБ со-ПОВ в качестве пластификаторов могут быть использованы: 1) высококипящие эфиры ряда основных кислот (фталаты, изофталаты, цитраты, фумараты, глютамат, фосфаты); 2) высококипящие эфиры полиоксиспиртов, особенно гликоля, полигликоля и глицерина; 3) ароматические сульфонамиды. Для получения достаточно прочных, не слишком хрупких частиц полимеров, например, ПОБ, достаточно применение данных пластификаторов в количестве 6-12 вес.% [5]. Например, основным недостатком таких пластификаторов как глицеролтриацетат и глицеролтрибутират является их высокая летучесть. Поэтому мономеры пластификатора со временем элюируют, что сопровождается ухудшением свойств изделий. 2.3.2. Биодеградация ПОБ и его сополимеры обладают свойством биодеградируемости. Конечными продуктами биодеградации являются углекислый газ и вода [31, 90].
Бактериальные ПОА могут разрушаться не только под воздействием температуры, но и в результате кислотного и щелочного гидролиза, а также биологическим путем под воздействием ферментов — деполимераз. При термальном разложении происходит случайное разделение полимера [68]. Под влиянием кислот и щелочей эти полимеры разлагаются как обычные полиэфиры [179]. В разбавленных растворах гидролиз протекает крайне медленно, но скорость его увеличивается при высоких температурах [118]. Скорость биодеградации бактериальных ПОА помимо температуры среды, в существенной степени зависит от химического состава полимера. Сополимеры ПОБ-со-ПОВ разрушаются быстрее ПОБ [5]. Биологическая деградация происходит гидролитически под воздействием специфических ферментов-деполимераз, продуцируемых микроорганизмами, а также ферментами крови и тканей высших животных [55, 65].
Вопрос о механизмах и кинетике биодеградации бактериальных ПОА в биологических средах является очень важным для применения данного полимерного материала в медицине. Биодеградируемые материалы медицинского назначения должны быть не только абсолютно безвредными для организма, но и иметь необходимые физико-механические характеристики. При этом скорость биодеструкции должна соответствовать скорости регенеративных процессов в тканях.
Метод атомно-силовой микроскопии
Для исследования морфологии поверхности образцов матриксов использовали сканирующий электронный микроскоп JSM Т-330 (JEOL, Япония) и установку для получения оцифрованных изображений AN-10000 (Link Analytical, Великобритания). Необходимое для электронномикроскопических исследований токопроводящее покрытие получали методом ионного напыления в течение 8-10 минут при постоянном токе 5-7 мА на установке JFC-H00 (JEOL, Япония). В качестве напыляемого материала применяли медь. Визуализацию поверхности проводили при ускоряющем напряжении 5 кВ и токах пучка около 10"ПА. Изображения регистрировали в формате 512 х 512 пикселов, 256 градаций серого. Дальнейшее хранение и обработка изображений в электронном виде осуществляли в графическом формате TIFF.
Шероховатость поверхности образцов исследовали совместно с лабораторией ксенотрансплантации ФГУ НИИТиИО (зав. лаб., д.б.н., профессор А.Г. Тоневицкий) с применением метода атомно-силовой микроскопии. Этот метод позволяет с высоким разрешением (1-Ю А) наблюдать профиль поверхности субстрата.
Измерения производили на зондовом микроскопе Solver Р47Н (NT-MDT, Москва). Использовали неконтактные кремниевые зондовые датчики серии NSG10S (NT-MDT) с резонансной частотой 200-300 кГц и жесткостью около 10 Н/м, типичный радиус кривизны острия которых был менее 10 нм. Измерения производили «полуконтактным» методом, с начальной амплитудой колебаний зонда 10-20 нм. Величину рабочей амплитуды колебаний зонда подбирали экспериментально. Сканирование проводили с частотой строк 2 Гц с разрешением 512 х 512 точек [14].
В основе метода инфракрасной спектроскопии многократно нарушенного полного внутреннего отражения (ИК МНПВО) лежит принцип полного внутреннего отражения падающего луча (из ИК диапазона) на границе раздела сред с различными показателями преломления. Оптически плотной средой является рабочий кристалл из KRS-5 с углом отражения 45 и числом отражений светового пучка, равным 25, а менее плотной средой -исследуемый образец, прижимаемый к призме до оптического контакта (Рис. 5) [12].
Метод ИК МНПВО позволяет регистрировать спектры тонких (порядка длины волны) приповерхностных слоев материала в диапазоне от 4000 до 400 см"1. Наиболее важной является часть спектра от 1800 до 500 см \ в которой практически все химические связи имеют характеристические полосы поглощения - так называемые «отпечатки пальцев» ("fingerprints"). ИК спектры получали с применением Фурье—ИК спектрометра "Perkin-Elmer 1720 X" (США) в диапазоне от 4000 до 400 см"1.
Для определения степени гидрофильности поверхности образцов использовали метод краевого угла смачивания. Соответствующая установка состоит из телекамеры, предметного столика, микрошприца для жидкостей и персонального компьютера с необходимым программным обеспечением. Телекамера формирует изображение капли жидкости, помещенной микрошприцем на поверхность исследуемого образца. Объём капли составляет 2 мкл. Полученное изображение вводится в компьютер, который аппроксимирует форму капли дугой окружности и вычисляет краевой угол. Все измерения производили при комнатной температуре.
Схема установки для измерения краевых углов: I— компьютер, 2- микрошприц с дистиллированной водой, 3- телекамера, 4- кювета, 5- образец, 6- капля. Исследуемый образец (5) располагается на дне оптической кюветы (4). С помощью микрошприца (2) на поверхность образца выдавливается капля дистиллированной воды (6). Изображение капли с телекамеры (3) передается на компьютер (1).
Физико-механические свойства исследуемых образцов матриксов изучали в Институте биофизики Сибирского отделения РАН на приборе Instron 1122. Для выбора оптимального состава матрикса исследовали динамику высвобождения ВГП из полученных образцов пленочных матриксов в плазму крови человека с использованием спектрофотометра "Сесії СЕ 5502м (Великобритания). В качестве маркера высвобождения использовали шиконин (Calbiochem, Merck, Германия) (0.01% от веса полимера).
Инкубацию образцов проводили при 37 С. Соотношение площади поверхности образца к объему плазмы составляло 1 см 7мл. В качестве контрольного раствора использовали исходную плазму крови. Измерения оптической плотности плазмы проводили ежедневно в течение 9 дней, на длине волны 528 нм. Количество высвободившегося в плазму ВГП определяли по калибровочной прямой.
Морфология и физико-химические свойства ЭластоПОБ
АСМ-анализ поверхности ПОБ-со-ПОВ и ЭластоПОБ показал, что данные образцы отличаются по значениям шероховатости поверхности. Шероховатость поверхности ЭластоПОБ составляет 53.76 ± 2.68 нм, это ниже, чем у исходного сополимера (82.37 ± 4.11 нм). Шероховатость поверхности на уровне нанометров, как известно, влияет на адгезию и распластывание клеток различных типов на субстрате, определяет их двигательную активность и степень поляризации, а также влияет на синтез специфических белков [148].
Даже небольшие изменения профиля поверхности субстрата могут приводить к изменению клеточного ответа в большом диапазоне от слабого усиления клеточной активности до значительного ее угнетения. Различные типы клеток отличаются по своей чувствительности к вариациям профиля поверхности субстратов. Так, например, макрофагоподобные клетки P388D1 чувствительны к шероховатости порядка 30 нм [176], эндотелиальные клетки и нейроны реагируют на шероховатость не ниже 70 - 100 нм [45]. Было показано, что при культивировании на поверхности с шероховатостью порядка 13 нм фибробласты человека показывают высокую адгезионную и пролиферативную активность, повышение уровня экспрессии белков и активности цитоскелета. При шероховатости субстрата порядка 95 нм существенно снижается даже первоначальная адгезия фибробластов [47]. Оптимальным для культивирования клеток многих типов является поверхность полистирола, широко применяемого для культивирования с шероховатостью порядка 15 нм.
Структура поверхности ПОБ-со-ПОВ и ЭластоПОБ на воздухе (А, Г), после инкубации в течение 1 часа: (Б, Д) в дистиллированной воде, (В, Е) в культуральной среде. Площадь сканирования 12x12 мкм. Зондовый микроскоп Solver Р47Н (NT-MDT, Москва). Известно, что на поверхность гомогенного ПОБ и его сополимеров клетки адгезируют плохо [5]. Это объясняют гидрофобностью поверхности полимеров. Однако перед посевом рекомендуется проинкубировать образцы в дистиллированной воде или культуральнои среде, что влияет на прикрепление клеточных культур.
По данным таблицы видно, что после инкубации образцов ЭластоПОБ в дистиллированной воде шероховатость поверхности становится равной 13.50 ± 0.67 нм, что сопоставимо с шероховатостью культурального полистирола - 15 нм. Шероховатость же исходного ПОБ-со-ПОВ остается достаточно высокой и равной 50.67 ± 2.53 нм. Инкубация образцов ЭластоПОБ в культуральной среде уменьшает шероховатость с 53.76 + 2.68 нм до 9.30 ± 0.46 нм. Инкубация матрикса в дистиллированной воде или культуральной среде приводит, таким образом, к снижению шероховатости субстрата.
Видно, что в обоих спектрах присутствуют интенсивная линия поглощения с максимумом вблизи 1720 см"1, отвечающая карбоксильным группам (-С=0-) в сополимере ПОБ-со-ПОВ. В исходном сополимере также присутствуют слабая линия поглощения с максимумом вблизи 1680 см"1, отвечающая карбоксильным группам, образующим водородные связи. При добавлении ПЭГ (20% от веса полимера) интесивность линии поглощения 1680 см" возрастает, что свидетельствует о дополнительном образовании водородных связей между сополимером и высосомолекулярным гидрофильным пластификатором - ПЭГ.
Проведенные ранее исследования отечественных ПОБ и ПОБ-со-ПОВ с включением оксивалерата от 4 до 30 мол. % в условиях in vitro и in vivo выявили значительный разброс данных в ходе санитарно-химических тестов водных вытяжек полимеров, а также наличие активации ферментных систем крови (in vitro) и воспалительных реакций при имплантации материала в переднюю камеру глаза (in vivo\ что предполагает присутствие в образцах примесей биологически активных веществ. Фактором, активирующим системы гемостаза, как оказалось, являются длинноцепочечные жирные кислоты, входящие в состав липидной фракции липополисахаридов мембран клеток продуцента [5, 21, 142]. Проведенный экспресс-анализ гемосовместимых свойств очищенных по специальной схеме полимеров подтвердил, что после дополнительной очистки образцы из гомополимера ПОБ и сополимера ПОБ-со-ПОВ обладают не только биосовместимым, но и гемосовместимыми свойствами. В данном исследовании использовали высокоочищенный сополимер ПОБ-со-ПОВ.
Исследования проводили в трех параллельных экспериментах. В исследуемых образцах, как и в контроле, подвижность клеток сохранялась в течение 2 и более часов. Индекс токсичности экстракта на суспензионной кратковременной культуре подвижных клеток составил 100% при допустимых значениях 70 - 120%. На основании полученных данных можно сделать вывод об отсутствии токсического воздействия экстрактов ЭластоПОБ в условиях in vitro на культуры подвижных клеток. Положительной считается реакция при размере пятна выше б мм, не более 3 мм в контроле. Размер пятна не превысил порогового значения, кожные реакции либо отсутствовали, либо проявлялись в чрезвычайно слабой форме. Реакция дегрануляции тучных клеток Характерная картина адгезированных тромбоцитов на поверхности ПОБ-со-ПОВ и ЭластоПОБ представлена на рисунке 14. Качественно мы не обнаружили существенных различий в количестве адгезированных тромбоцитов.
На основании проведенных исследований медико-биологических свойств ЭластоПОБ, можно сделать вывод о том, что биополимерный пленочный матрикс не обладает местнораздражающим, сенсибилизирующим и токсическим действием, гемосовместим, стерилен, апирогенен, соответствует требованиям, предъявляемым к изделиям для длительного контакта с внутренней средой организма, включая контакт с кровью.
