Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Многообразие современных способов биоконверсии органического сырья и отходов. Преимущества твердофазной ферментации 9
1.2. Процесс аэробной твердофазной ферментации 14
1.2.1. Общая характеристика процесса 14
1.2.2. Аппаратурное оформление процесса 15
1.2.3. Характеристика ферментируемых субстратов 16
1.2.3.1. Сырье животноводства 16
1.2.3.2. Углеродсодержащие материалы растительного происхождения
1.2.4. Физико-химические и биохимические факторы, влияющие на ход ферментации 20
1.2.4.1. Углеродно-азотное соотношение 21
1.2.4.2. Содержание целлюлозо-лигниновых компонентов 23
1.2.4.3. Влажность 26
1.2.4.4. Кислотность 28
1.2.4.5. Размер частиц и скорость аэрации 30
1.2.4.6. Температура 31
1.2.4.7. Использование биостимуляторов 32
1.3. Физико-химические подходы к моделированию аэробной твердофазной ферментации 34
1.3.1. Общие положения 34
1.3.2. Термодинамическое моделирование 35
1.3.3. Кинетическое моделирование 37
2. Объекты и методы исследований 41
2.1. Устройство лабораторной установки 41
2.2. Устройство полупроизводственной установки 42
2.3. Схема экспериментов на полупроизводственной установке 43
2.4. Физико-химическое тестирование процесса 45
2.4.1. Наблюдение за режимом влажности 45
2.4.2. Наблюдение за температурным режимом 45
2.4.3. Наблюдение за уровнем кислородообеспечения 46
2.4.4. Кислотный режим процесса 48
2.5. Биохимическое тестирование процесса 48
2.5.1. Определение каталазной активности 48
2.5.2. Определение дегидрогеназной активности 50
2.5.3. Определение пероксидазной активности 51
2.5.4. Определение полифенолоксидазной активности 52
2.5.5. Определение содержания триптофана 54
2.5.6. Определение сырого протеина 54
2.5.7. Определение сырого жира 55
2.5.8. Определение сырой клетчатки 56
2.5.9. Определение органического углерода гуминовых и фульвовых кислот
2.6. Химическое тестирование процесса 59
2.6.1. Определение азота 59
2.6.2. Определение фосфора 61
2.6.3. Определение калия 63
2.6.4. Определение зольности 64
2.7. Микробиологическое тестирование процесса 65
2.7.1. Общие требования к проведению микробиологических анализов
2.7.2. Определение общей микробной обсемененности 67
2.8. Статистическая обработка данных 67
3. Комплексное исследование процессов аэробной твердофазной ферментации
3.1. Исследование базового процесса ферментации 68
3.1.1. Варьирование режимов аэрации и выбор оптимума 68
3.1.2. Оценка физико-химических показателей 71
3.1.3. Оценка биохимических показателей 72
3.1.4. Оценка микробиологических показателей 76
3.2. Исследование влияния различных органических субстратов на ход процесса ферментации
3.2.1. Оценка физико-химических показателей 80
3.2.2. Оценка биохимических показателей 83
3.3. Многокритериальная оценка удобрительного «рейтинга» продуктов ферментации
4. Моделирование аэробной твердофазной ферментации ... 99
4.1. Кинетика развития целлюлозолитических аэробов при использовании различных лигноцеллюлозных субстратов . 99
Ингибирующая способность лигнина
4.2. Кинетическая модель биодеградации органической фракции 105
Заключение : 116
Список литературы 118
Приложение 1 129
Приложение 2 134
- Многообразие современных способов биоконверсии органического сырья и отходов. Преимущества твердофазной ферментации
- Схема экспериментов на полупроизводственной установке
- Варьирование режимов аэрации и выбор оптимума
- Кинетика развития целлюлозолитических аэробов при использовании различных лигноцеллюлозных субстратов
Введение к работе
Актуальность проблемы и общая характеристика работы. Процессы, протекающие в биосфере в рамках малого (биологического) круговорота веществ, в значительной степени основываются на жизнедеятельности микроорганизмов в определенных физико-химических условиях. Существующие в природе физико-химические закономерности и механизмы переносятся человеком на уровень технологических решений, направленных на утилизацию отходов и сырьевых ресурсов, поэтому их изучение является одной из приоритетных задач, обладающих высокой научно-практической значимостью.
Среди многообразия современных подходов, имеющихся в этой области, выделяются способы утилизации отходов «нового поколения», относящиеся к биоконверсионным. Процессы, осуществляемые микроорганизмами при биоконверсии, выгодны не только тем, что в них используются самые разнообразные сырьевые ресурсы (возобновляемые материалы животного и растительного происхождения, а также отходы различных производств), но и тем, что получаемые продукты зарекомендовали себя возможным применением в самых различных областях человеческой деятельности.
Большая часть способов биоконверсии представлена различного рода ферментационными процессами, осуществляемыми микрофлорой, изначально присутствующей в перерабатываемых субстратах или привнесенной в них в качестве биокатализатора. Одним из наиболее перспективных способов биоконверсии является аэробная твердофазная ферментация навоза и помета с углеродсодержащими материалами растительного происхождения (торф, опилки, солома и др.), в основу которой положено воздействие на ферментируемую массу воздуха, подаваемого извне компрессором. Регулирование процесса ферментации осуществляется варьированием физико-химических и биохимических параметров, что приводит к активации микрофлоры, присущей исходным субстратам, и ее ферментного аппарата.
Для прогнозирования свойств целевого продукта ферментации необходимо знание механизма процесса, вида описывающих его уравнений и их кинетических параметров. Решать задачи такого рода позволяет математическое моделирование.
Использование корректной математической модели делает возможным проведение оценки хода процесса ферментации на любом этапе.
Цель работы - комплексный мониторинг процесса аэробной твердофазной ферментации в зависимости от природы и количеств углеродсодержащих субстратов в составе исходных смесей, направленный на разработку прогнозной кинетической модели биодеградации органической фракции.
Для достижения поставленной цели решались следующие основные задачи: комплексное (физико-химическое и биохимическое) исследование базового процесса аэробной твердофазной ферментации с использованием «классической» тор-фо-навозно-пометной смеси; комплексное (физико-химическое и биохимическое) исследование процессов аэробной твердофазной ферментации при использовании различных количеств углеродсодержащих субстратов, частично замещающих торф, - ранее наиболее активно применявшихся в аналогичных процессах (опилки) и впервые предлагаемых к использованию в таком качестве (пивная дробина, льняная костра); выявление связей между физико-химическими и биохимическими величинами, характеризующими течение исследуемых процессов; разработка кинетической модели процесса ферментации, позволяющей оценить скорость и степень биодеградации органической фракции ферментируемых смесей с целью его дальнейшей оптимизации для получения удобрений с заданными свойствами.
Научная новизна работы и практическая значимость. Проведен экспресс-анализ базового процесса ферментации и выявлен оптимальный режим аэрации ферментируемых смесей. Выполнен комплексный мониторинг процессов ферментации при использовании различных концентраций углеродсодержащих субстратов.
Установлено, что использование одного из традиционных субстратов (древесных опилок) допустимо лишь в количестве, не превышающем 5% от общей массы ферментируемой смеси, что подтверждается благоприятным течением процесса, способствующим формированию качественных продуктов.
Впервые в процессе аэробной твердофазной ферментации использованы 2 вида нетрадиционных углеродсодержащих субстратов - крупнотоннажные отходы сельского хозяйства (льняная костра) и пивоваренной промышленности (пивная дробина). Выявлены благоприятные уровни концентраций пивной дробины (5 15%) и льняной костры (5-10%) на течение процессов ферментации, их интенсивность и направленность, что подтверждено многокритериальной оценкой удобрительного «рейтинга» получаемых продуктов.
Построена кинетическая модель, характеризующая развитие целлюлозораз-рушающих аэробов на начальной стадии процесса ферментации в зависимости от состава лигноцеллюлозного комплекса ферментируемых субстратов, позволившая выявить пределы их концентраций, оказывающие позитивное влияние на развитие указанной группы микроорганизмов и их деградабельную способность.
Построена кинетическая модель биодеградации органической фракции ферментируемых смесей с учетом комплекса физико-химических показателей: температуры, влажности, зольности, кислородообеспечения, пористости, порозности, изменения массово-объемных соотношений, позволяющая осуществлять прогнозирование течения процесса ферментации с оценкой готовности и качества получаемой продукции (биокомпоста).
Результаты работы применяются при реализации процессов аэробной твердофазной ферментации на лабораторном, полупроизводственном и производственном уровнях в Тверском государственном техническом университете (ТГТУ) и Всероссийском НИИ сельскохозяйственного использования мелиорированных земель (ВНИИМЗ).
Полученные данные и сделанные выводы использованы при выполнении следующих проектов в рамках научных отраслевых программ Министерства образования и науки Российской Федерации: проект «Разработка технологии получения витаминизированных кормовых добавок методом биоконверсии сельскохозяйственных и пищевых отходов с добавлением биологически активных соединений» (программа «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники», подпрограмма «Химия и химические продукты»), проект «Создание научных основ биосорбции и биодеструкции органических отходов» (программа «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники», подпрограмма «Химия и химические продукты»), проект «Разработка технологии получения и использования биологически активных веществ - регуляторов биотехнологических процессов переработки сельскохозяйст венного сырья» (программа «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники», подпрограмма «Технологии живых систем»).
Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на Международной конференции молодых ученых «От фундаментальной науки к новым технологиям» (Тверь, 2001), Международной научно-практической конференции «Использование органических удобрений и биоресурсов в современном земледелии» (Владимир, 2002), Всероссийской заочной конференции «Перспективы развития Волжского региона» (Тверь, 2003), Международной научно-практической конференции «Высокие технологии добычи, глубокой переработки и использования озерно-болотных отложений» (Томск, 2003), 11-ом Международном Конгрессе «Молекулярные взаимодействия между растениями и микроорганизмами: новые мосты между прошлым и будущим» (С.-Петербург, 2003), 6-ой Межрегиональной конференции по использованию и управлению земельными и водными ресурсами (Альбасете, Испания, 2003), 2-ой научно-практической конференции «Научные проблемы устойчивого развития Тверской области: экономика, экология, социология» (Тверь, 2003), Межрегиональной конференции «Производство продовольствия и вода» (Москва, 2004).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, получены патенты РФ на полезные модели №39599, № 38396 и решение о выдаче патента РФ (Заявка № 2003138196/12 от 31.12.2003).
Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, 4 глав, заключения, содержит 137 страниц печатного текста, 28 рисунков, 21 таблицу в основном тексте и 6 в приложениях. В списке литературы 136 наименований.
Многообразие современных способов биоконверсии органического сырья и отходов. Преимущества твердофазной ферментации
В основе большинства процессов биоконверсии лежит деятельность микроорганизмов, определяющая скорость и глубину биотрансформации. Известно, что микроорганизмы способны участвовать в синтезе различных органических соединений. Исследования [1] показали, что направленная и регулируемая микробная конверсия способствует накоплению сложных циклических соединений.
Достоинства биоконверсионных процессов заключаются в отсутствии необходимости применять высокие температуры и давление при реализации ферментативных реакций, что свидетельствует о их большей эффективности по сравнению с традиционными методами переработки сырья, а также о сравнительной простоте технического обеспечения производственных процессов.
Биоконверсия позволяет достичь большей экологической чистоты произведенной продукции по сравнению с химическими технологиями, поскольку сырьем для ее осуществления служат возобновляемые материалы растительного и животного происхождения, а сама продукция полностью расходуется в процессах потребления [2, 3]. Поэтому процессы такого рода способны не только ускорить и удешевить получение конечной продукции, но и снизить затраты по защите воздушного и водного бассейнов, а также почвы от загрязнений.
Известны способы биоконверсии, в которых жидкие отходы сельскохозяйственных животных подвергаются прессованию и высушиванию [4]. Подобные подходы экономически нецелесообразны ввиду большой энергоемкости процесса сушки и неудовлетворительного качества получаемого корма. Поэтому жидкие фракции навоза рекомендуется подвергать биоочистке в аэротенках с возможностью доочистки в рыбоводно-биологических прудах [5].
Достаточное распространение в сельскохозяйственной практике получили различные методы силосования отходов животноводства с растительными остатками, а также гидролитические способы получения биоконверсионных продуктов путем воздействия на органическое сырье разбавленными кислотами. Их использование позволяет существенно увеличить выход глюкозы в конечных продуктах [6].
В качестве сырья для приготовления удобрений особой популярностью пользуется торф. Доказана целесообразность его использования при переработке сточных вод предприятий пищевой промышленности и животноводческих комплексов на удобрения. Существуют неферментационные технологии, позволяющие использовать торф для производства кормовых добавок [7]. При этом через слой сфагнового торфа со степенью разложения 5-20% и влажностью 50-60%, служащий своего рода фильтром, пропускают сточные воды, что способствует насыщению конечного продукта белково-жировыми веществами. Полученный продукт подвергают сушке, пока его влажность не достигнет 5-10%.
Гидролизаты древесины и торфа можно использовать в качестве питательной среды для кормовых дрожжей, что позволяет получать разнообразные белковые, каротиноидные и жировые препараты [8,9].
В последние десятилетия достаточной популярностью пользуется метод переработки органических отходов вермикультивированием. Характерной чертой этого способа биопереработки является возможность использования широкого спектра органического сырья и отходов красным калифорнийским червем: навоза всех видов животных, помета птицы, осадков очистных сооружений, отходов сельскохозяйственного и перерабатывающих производств [10, 11].
Методами анаэробного разложения органических отходов получают биогаз. В состав биогаза, который относится к возобновляемым источникам энергии, входит 50-60% метана [12]. Производство биогаза из возобновляемых источников - отходов биомассы промышленного, сельскохозяйственного и бытового происхождения - осуществляется во многих странах. Пионером в этой области являются США [13].
В достаточной степени эффективным признан процесс культивирования дрожжей на отходах животноводческих комплексов [14], заключающийся в разделении жидкой и твердой фракций с помощью центрифугирования исходного сырья с последующим гидролизом жидкой фракции серной кислотой и нейтрализации известковым молоком. Твердая фракция складируется и используется для получения компоста, жидкая используется для выращивания дрожжей. Разработаны способы выращивания дрожжей из отходов животноводства без их предварительного гид ролиза. Для лучшей биотрансформации исходное сырье подвергается предобработ .! ке: пастеризации, аэробной или анаэробной ферментации. Одновременно с ростом и размножением дрожжевых клеток гибнут патогенные микроорганизмы. Эти процессы не только позволяют получать дешевые кормовые добавки, но и способствуют облагораживанию 90% животноводческих стоков [15]. Наряду с этим, постоянно разрабатываются и совершенствуются способы очистки отходов животноводства с использованием микроводорослей Spirulina и аэрирования субстрата. В ходе таких процессов биопереработки в большом коли честве синтезируются аминокислоты и витамины, в том числе пантотеновая и ни I котиновая кислоты, рибофлавин и пиридоксин. Значительная часть современных процессов биоконверсии может быть отнесена к так называемым способам твердофазной ферментации [16], для которых характерен кометаболизм, то есть участие, как минимум, двух субстратов, один из которых используется для роста микроорганизмов, а другой превращается в ценный целевой продукт [17]. При этом осуществляется культивирование микроорганизмов на увлажненных твердых субстратах. В отличие от способов ферментации жидких субстратов, для твердофазной ферментации характерны больший выход полезного продукта с улучшением его свойств, меньшие затраты и относительная простота. Для осуществления твердоті фазной ферментации используются природные гетерогенные материалы [18], содержащие сложные полимеры: лигнин [19], пектин [20, 21], лигноцеллюлозу [22] и т.д. Твердофазная ферментация направлена на получение продукции широкого спектра использования. Ниже представлены процессы твердофазной ферментации, нашедшие применение в разных отраслях промышленности и сельскохозяйственного производства. В пищевой промышленности применение твердофазной ферментации обусловлено необходимостью производства ферментов, органических кислот, арома-тизаторов и др. Так, культивированием Aspergillus oryzae на смесях из пшеничных отрубей и соевых хлопьев производят протеиназы для получения соевых соусов [23]. Под действием протеиназ нерастворимый протеин соевых хлопьев преобразу 12 ется в небольшие растворимые пептиды и аминокислоты, которые составляют соевый соус.
Схема экспериментов на полупроизводственной установке
Каталаза способна разлагать ядовитые для клеток перекисные соединения, в том числе перекись водорода, в значительных количествах присутствующие в органическом сырье (торфе, навозе, помете и др.), подвергающемся ферментации. Перекисные соединения образуются в процессе дыхания и в результате различных биохимических реакций окисления, свойственных живым организмам (растениям и животным) при жизни, в связи с чем и обнаруживаются в отходах их жизнедеятельности. Повышенный уровень каталитической активности в процессах ферментации свидетельствует об активно идущих реакциях распада, сопровождаясь удалением из конвертируемой органической смеси ядовитых соединений перекиснои природы. Конец процесса ферментации обычно характеризуется низкой активностью этого фермента, что является, безусловно, одним из показательных тестов завершенности биопереработки.
Метод определения каталазы в образце исследуемого материала основан на измерении количества молекулярного кислорода, выделяющегося при распаде перекиси водорода под воздействием этого фермента в соответствии с реакцией: 2Н202 -» 2Н20 + 02 Для определения каталазы чаще всего используют газометрический метод, используя специально собираемый в лаборатории прибор (рис. 2.4). Ход анализа. Навеску органического субстрата массой не менее 1 г вносят в толстостенную колбу (2), прибавляют 0.5 г СаСОз и смачивают навеску 4 мл дистиллированной воды. Затем на дно осторожно ставят с помощью пинцета маленький пенициллиновыи стаканчик (1) с 1.7 мл 10 %-го раствора перекиси водорода. Колбу с перечисленными ингредиентами плотно закрывают каучуковой пробкой, имеющей трубку, соединенную с градуированной бюреткой (3), закрепленной на штативе (5). Градуированная бюретка через тройник сообщается с неградуирован-ной бюреткой (7), которая в свою очередь сообщается через шланг с грушей (6). Обе бюретки и груша заполнены водой. Уровень воды в обеих бюретках и груше уравновешивают и последнюю закрепляют на определенной высоте. Затем закрывают кран (4), прекращая тем самым сообщение прибора с внешней средой. Начало опыта отмечают по секундомеру в тот момент, когда пенициллино-вый стаканчик с перекисью водорода опрокидывают и энергично встряхивают содержимое колбы. При этом не разрешается держаться за колбу, а лишь за каучуковую пробку во избежание дополнительного разогрева содержимого колбы. Взбалтывание смеси следует продолжать все время опыта. Выделяющийся во время реакции кислород вытесняет из бюретки (3) воду, уровень которой начинает падать и его отмечают. Контролем служит органический субстрат, стерилизованный сухим жаром. Количество выделившегося молекулярного кислорода учитывают в течение 1 мин при комнатной температуре. Периодические отсчеты через 1, 2, 3 мин позволяют вести наблюдение за кинетикой процесса. Активность каталазы выражают в мл кислорода, выделившегося на 1 г субстрата. Ошибка определения до 5 %.
Установление концентрации пергидроля. На аналитических весах в мерной колбе емкостью 100 мл взвешивают 1 г перекиси водорода, объем доводят до метки и взбалтывают. Берут 20 мл полученного раствора в конические колбы на 250 мл (3-кратная повторность), добавляют 50 мл дистиллированной воды и 2 мл 20% H2S04. Затем титруют 0,1 н КМп04. 1 мл 0,1 н Кмп04 соответствует 0,0017008 г перекиси водорода. После установления концентрации, нужный раствор перекиси водорода готовят разбавлением дистиллированной водой.
Чаще всего в процессе твердофазной ферментации дегидрогеназная активность антибатна каталазной [51]. Сравнение их активностей позволяет оценить уровень общих биосинтетических реакций и достаточность субстратов для дегидрирования микроорганизмами.
Метод определения дегидрогеназы основан на определении количества окрашенного в розовато-красный цвет трифенилформазана (ТФФ), образующегося под воздействием этого фермента на бесцветную соль трифенилтетразолия хлористого (ТТХ).
Ход анализа. В пробирки на 10 мл помещают 1 г органического субстрата, прибавляют 10 мг СаС03, 5 мл 1%-ного раствора глюкозы и 1 мл 0,5 % раствора ТТХ и перемешивают. Пробирки закрывают резиновыми пробками, устанавливают их в мини-анаэростат и откачивают воздух, создавая анаэробные условия для деятельности дегидрогеназ. Мини-анаэростат помещают в термостат при температуре 37 С на 24 часа. После инкубации в пробирки приливают 5 мл этилового спирта, перемешивают и фильтруют через воронку Бюхнера. Колориметрируют на ФЭКе с синим светофильтром (А,=490 нм).
Контролем служит реактив, включающий все вышеперечисленные компоненты, кроме органического субстрата, и прошедший все этапы обработки.
Содержание ТФФ определяют по калибровочному графику, который строят, откладывая на оси абсцисс содержание ТФФ, а на оси ординат - оптическую плотность D. Активность дегидрогеназы выражают в мг ТФФ в 1 г субстрата за 24 часа.
Этот вид ферментов участвует в реакциях конденсации, формируя гумино-вые кислоты, в связи с чем целесообразно выявление активности этого фермента в процессах твердофазной ферментации органического сырья, используемого впоследствии в качестве удобрения.
Пероксидаза катализирует окисление полифенолов в присутствии перекиси водорода или органических перекисей, фактически активируя последние, так как сами перекиси обладают сравнительно слабым окисляющим действием на фенолы. Пероксидаза - один из ферментов активного окисления, действующих на различные фенолы и ароматические амины: пирогаллол, гидрохинон, пирокатехин, ор-токрезол.
Варьирование режимов аэрации и выбор оптимума
Принимая во внимание значительность изменений фракционного состава гумусоподобных соединений в период максимального увеличения температуры (3-5-е сутки ферментации), когда содержание гуминовых кислот снижалось с 3,14 до 2,51%, а содержание фульвокислот увеличивалось с выходом на плато и начинало несколько расти, отметим, что основополагающую роль в реакциях биотрансформации гумусоподобных соединений играют термофильные группы микроорганизмов, причем значительная часть образующихся вторичных метаболитов представлена непосредственно фульвокислотами.
Отмечено, что процесс ферментации характеризовался первичным (в течение 4-х суток) накоплением аминокислоты триптофана - предшественника ИУК [118, 119], причем в период достижения максимальной температуры скорость накопле 76 ния триптофана несколько снижалась, что, вероятно, связано с известным фактом преобразования этой аминокислоты в циклический пептид - дикетопиперазин при высокой температуре.
К концу ферментации происходило плавное снижение концентрации этой аминокислоты в ферментируемой смеси. Таким образом, в продукте ферментации содержание триптофана оказывалось ниже исходного уровня в 1,4 раза, что вполне могло свидетельствовать о его окислительном декарбоксилировании пероксидазой в присутствии пиридоксальфосфата и марганца с образованием индолилацетамида, превращающегося в индолилуксусную кислоту [120].
Предположительно такая динамика триптофана связана с динамикой фермента протеазы (табл. 3.5) участвующей в процессах распада соединений с пептидной связью [121], что сопровождается накоплением различных азотсодержащих соединений, в том числе свободных аминокислот, среди которых присутствует и триптофан [122]. Как видно из таблицы, суммарная численность мезофильных микроорганизмов менялась в соответствии с изменениями температуры в ходе процесса. Еще до начала ферментации - в исходных смесях - было найдено значительное количество мезофильных групп микроорганизмов, которое с ростом температуры неуклонно снижалось. На 7-е сутки ферментации их численность относительно исходного уровня сократилась в 8,7 раза.
Наряду с изменением общей численности мезофилов анализировалась численность тех групп микроорганизмов, которые доминируют в ферментируемой смеси. Известно [51], что для большинства аэробных процессов переработки доминирующими являются микроорганизмы, использующие азот органических соединений (на МПА) и минеральные формы азота (на КАА).
Так, микроорганизмы, растущие на КАА, обнаруживали 4-кратный рост в течение первых 2-х суток ферментации, однако уже на 4-е сутки их численность по сравнению с максимумом сократилась в 6,7 раза. Примечательно, что к концу 5-х суток ферментации, когда температура смеси начинала снижаться, содержание этой группы микроорганизмов вновь возрастало, превысив к концу процесса уровень их содержания в исходной смеси в 2,4 раза.
В свою очередь, изменение численности микроорганизмов, растущих на МПА и относящихся к аммонификаторам, обнаруживало другую динамику. В течение всего процесса их количество снижалось, оказываясь к концу ферментации меньше исходной величины в 33 раза. Сходное с МПА изменение численности было зафиксировано и для грибов. Уже на 4-е сутки ферментации их количество сократилось в 5,9 раза по сравнению с исходным.
Иная закономерность была найдена для актиномицетов. Известно, что большинство микроорганизмов этой группы питаются белковыми или небелковыми органическими веществами [123]. В течение первых 4-х суток ферментации содержание актиномицетов несколько снижалось по сравнению с исходным, сменяясь на 5-е сутки активным ростом. В конечном продукте содержание актиномицетов превышало исходную величину в 2,1 раза.
Кроме того, в ферментируемой смеси были выявлены значительные количества аминокислотосинтезирующих микроорганизмов - максимум их численности совпадал по времени со временем достижения температурного максимума (4-е су 78 тки ферментации). Однако к концу процесса численность аминокислотосинтети-ков снижалась. Основная особенность этого вида микроорганизмов заключается в способности к интенсивному синтезу аминокислот и выделению их в окружающую среду [122]. Очевидно поэтому, что деятельность именно этой микробной группы имеет первостепенное значение для накопления в конечном продукте ферментации свободных аминокислот.
Достижение основной цели настоящей работы было бы крайне затруднительно на производственном биореакторе из-за большого объема и в связи с невозможностью выполнить цикл запланированных экспериментов. Поэтому была поставлена и решена вспомогательная задача, связанная с разработкой и запуском полупроизводственной установки, позволившей провести ряд экспериментов, необходимых для получения статистического материала.
Установлено, что в ходе ферментации динамика изменения содержания кислорода в смеси антибатна температурной. Отмечена монотонность снижения уровня влагосодержания, ускоряемого периодической аэрацией и поверхностным испарением, а также первичное снижение рН смеси (в «кислотную» фазу) с последующим увеличением до нейтральных значений, что свидетельствует о сходстве исследуемого типа процесса с многочисленными типами процессов твердофазной ферментации, описанными в литературе и, как следствие, о возможности экстраполяции на него известных физико-химических закономерностей.
Комплексное исследование процесса показало, что в ходе ферментации наблюдается активная биотрансформация трудногидролизуемых высокомолекулярных веществ - клетчатки и жиров, а образующиеся при этом вторичные метаболиты вовлекаются в многочисленные процессы преобразований, в том числе, биосинтетические, о доминировании которых над деструкционными в термофильный период свидетельствовало снижение каталазно-дегидрогеназного коэффициента (КДК). Кроме того, общая направленность окислительно-восстановительных реакций в процессе ферментации свидетельствовала об образовании веществ с новым энергосодержанием, в том числе физиологически активных - фульвокислот и триптофана, что сопровождалось снижением полифенолоксидазно-пероксидазного коэффициента (ППК).
Кинетика развития целлюлозолитических аэробов при использовании различных лигноцеллюлозных субстратов
Кроме того, удовлетворительного прогнозирования биодеградации удается достичь посредством использования величины средней температуры (40-50С), характерной для процесса аэробной твердофазной ферментации (рис. 4.7). При этом константа скорости считается неизменной.
Таким образом, на основании комплекса физико-химических параметров процесса ферментации (температуры, влажности, зольности, кислородообеспече-ния, пористости, порозности, изменения массово-объемных соотношений) построена кинетическая модель биодеградации органической фракции. В модели ис- пользованы допущения о неизменности скорости биодеградации в течение заданного временного интервала, о постоянстве энергетического эквивалента для смеси заданного состава в течение всего срока ферментации, а также о равном количестве кислорода, расходуемом на биодеградацию 1 кг органической массы (коэффициент ХПК).
Показана возможность использования уравнений реакций нулевого и первого порядков, удовлетворительно описывающих течение процесса аэробной твердофазной ферментации. Кроме того, высокой степени точности прогнозирования содержания органической фракции в составе ферментируемой смеси удается достичь посредством использования средней температуры (-40-50 С), характерной для процессов такого рода. Фактически, предложенная модель позволит автоматизировать контроль течения процесса, основываясь на следующих входных параметрах: - химическое поглощение кислорода (кг/кг); - исходная влажность, %; - исходная зольность, %; - исходная масса смеси, %; - рабочий объем ферментера, м3; - средняя температура, С. В ходе моделирования установлено, что использование пивной дробины (5-20%) способствует снижению энергетического эквивалента органической фракции. В то же время в опытах с использованием льняной костры и опилок (5-10%) аналогичный показатель по сравнению с базовым опытом увеличивался, что свидетельствует о меньшей доступности этих субстратов для микрофлоры, связанным с повышенным содержанием лигнина в их составе. Казалось бы, для смесей с еще большим количеством льняной костры и опилок (15-20%) энергетический эквивалент должен быть выше, однако этого не наблюдали. Указанное противоречие может быть объяснено тем, что в действительности в условиях этих опытов лигно-целлюлозные субстраты практически не подвергались деградации, что приводило к занижению значений этого показателя. В настоящее время существует ряд нерешенных проблем в области усовершенствования процессов биоконверсии, среди которых выделяется необходимость поиска математических зависимостей параметров ферментации от состава и свойств исходных смесей, позволяющих осуществлять автоматизированный контроль процессов. В связи с этим настоящая работа была посвящена созданию кинетической модели биодеградации органической фракции ферментируемых смесей различного состава, основанной на физико-химических данных, полученных путем комплексного мониторинга процесса аэробной твердофазной ферментации «классической» торфо-навозно-пометной смеси (50%:35%:15%) и при использовании 5-20% углеродсодержащих субстратов различной природы (пивная дробина, льняная костра, древесные опилки), частично замещающих торф. По результатам выполненной работы можно сделать следующие выводы: 1. Установлены основные физико-химические закономерности, характерные для процесса аэробной твердофазной ферментации. Построена кинетическая модель развития популяции аэробных целлюлозолитических микроорганизмов на начальной стадии процесса ферментации, позволившая определить пределы концентраций исследуемых субстратов, при которых наблюдается наилучшее развитие микроорганизмов этой группы: для опыта с пивной дробиной - 5-15%; для опыта с льняной кострой - 5-10%; для опыта с древесными опилками - 5-10%. 2. Разработана многопараметрическая кинетическая модель биодеградации органической фракции при использовании комплекса физико-химических параметров ферментации (температуры, влажности, зольности, кислородообеспечения, пористости, порозности, изменения массово-объемных соотношений), позволившая выдвинуть предположение о механизме гетерогенного окисления субстратов различной природы. Внедрение модели обеспечивает автоматизированный контроль процесса. 3. Выявлены антибатность динамики содержания кислорода и температуры (Rep -0,84); активная биотрансформация трудногидролизуемых высокомолекулярных веществ - клетчатки и жиров; накопление физиологически активных веществ - фульвокислот и триптофана, придающих продуктам ферментации удобрительную ценность. 4. Установлено, что наилучшими разогревом смесей и поглощением кислорода микрофлорой, наибольшей длительностью термофильного периода и минимальными коэффициентами остывания, наивысшей степенью озоления ферментируемых смесей по сравнению с базовым опытом отличались опыты с внесением в состав исходных смесей 10-20% пивной дробины, свидетельствуя о благоприятном воздействии указанного субстрата в отношении микроорганизмов. 5. Выявлено сокращение длительности термофильного периода, снижение поглощения кислорода и степени озоления ферментируемых смесей для опытов с 15-20% льняной костры и 10-20% древесных опилок, что свидетельствует об инги-бирующем эффекте, возникающем из-за избытка лигноцеллюлозных компонент. 6. Установлено максимальное накопление фульвокислот в опытах с пивной дробиной (5-15%); достаточно высокое, соразмеримое с базовым опытом, - в опытах с льняной кострой (5-10%) и древесными опилками (5%). Получаемые при таких количествах исходных компонент продукты ферментации обладают согласно «конденсационной» теории пролонгированными удобрительными свойствами, способствуя повышению почвенного плодородия. 7. Предложена система оценки удобрительного «рейтинга» продуктов ферментации, показавшая их высокую удобрительную ценность, в 2-4 раза превышающую удобрительную ценность нативного подстилочного навоза. 8. Разработаны полезные модели на полупроизводственную установку и устройство пробоподготовки (патенты РФ №№ 39599, 38396), обеспечившие проведение цикла запланированных экспериментов.
