Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Многообразие современных способов биоконверсии органического сырья и отходов. Преимущества твердофазной ферментации 10
1.2. Процесс аэробной твердофазной ферментации 15
1.2.1. Общая характеристика процесса 15
1.2.2. Аппаратурное оформление процесса 16
1.2.3. Характеристика ферментируемых субстратов 17
1.2.3.1. Сырье животноводства 17
1.2.3.2, Углеродсодержащие материалы растительного происхождения 19
1.2.4. Факторы, влияющие на ход ферментации 21
1.2.4.1. Углеродно-азотное соотношение 22
1.2.4.2. Содержание целлюлозо-липшновых компонентов 24
1.2.4.3. Влажность 27
1.2.4.4. Кислотность 29
1.2.4.5. Размер частиц и скорость аэрации 31
1.2.4.6. Температура 32
1.2.4.7. Использование биостимуляторов 33
1.3. Подходы к моделированию аэробной твердофазной ферментации.. 35
1.3.1. Общие положения 35
1.3.2. Термодинамическое моделирование 36
1.3.3. Кинетическое моделирование 38
2. Объекты и методы исследований 42
2.1. Устройство лабораторной установки 42
2.2. Устройство полупроизводственпои установки 43
2.3. Схема экспериментов на полупроизводственной установке 44
2.4. Физико-химическое тестирование процесса 46
2.4.1. Наблюдение за режимом влажности 46
2.4.2. Наблюдение за температурным режимом 46
2.4.3. Наблюдение за уровнем кислородообеспечения 47
2.4.4. Кислотный режим процесса 49
2.5. Биохимическое тестирование процесса 49
2.5.1. Определение каталазной активности 49
2.5.2. Определение дегидрогеназной активности 51
2.5.3. Определение пероксидазной активности 52
2.5.4. Определение полифенолоксидазной активности 53
2.5.5. Определение содержания триптофана 55
2.5.6. Определение сырого протеина 55
2.5.7. Определение сырого жира 56
2.5.8. Определение сырой клетчатки 57
2.5.9. Определение органического углерода гуминовых и фульвовых кислот 58
2.6. Химическое тестирование процесса 60
2.6.1. Определение азота 60
2.6.2. Определение фосфора 62
2.6.3. Определение калия 64
2.6.4. Определение зольности 65
2.7. Микробиологическое тестирование процесса 66
2.7.1. Общие требования к проведению микробиологических анализов 66
2.7.2. Определение общей микробной обсемененности 68
2.8. Статистическая обработка данных 68
3. Комплексное исследование процессов аэробной твердофазной ферментации 69
3.1. Исследование базового процесса ферментации 69
3.1.1. Варьирование режимов аэрации и выбор оптимума 69
3.1.2. Оценка физико-химических показателей 72
3.1.3. Оценка биохимических показателей 73
3.1.4. Оценка микробиологических показателей 77
3.2. Исследование влияния различных органических субстратов на ход процесса ферментации 80
3.2.1. Оценка физико-химических показателей 81
3.2.2. Оценка биохимических показателей 84
4. Моделирование аэробной твердофазной ферментации 96
4.1. Кинетика развития целлюлозолитических аэробов при использовании различных лигноцеллюлозных субстратов. Ингибиругощая способность лигнина 96
4.2. Кинетическая модель биодеградации органической фракции 102
5. Технологические расчеты, эколого-экономическая оценка производства и применения продуктов твердофазной ферментации 113
5.1. Проектирование технологической линии. Материальный баланс производства и себестоимость получаемых удобрений 113
5.1.1. Расчет расхода компонентов на цикл 115
5.1.2. Расчет материального баланса производства и стоимости продуктов ферментации 116
5.2. Эколого-экономическая эффективность получаемых удобрений 121
Выводы и рекомендации 128
Список литературы 130
Приложение 1 141
Приложение 2 146
Приложение 3 150
- Многообразие современных способов биоконверсии органического сырья и отходов. Преимущества твердофазной ферментации
- Определение органического углерода гуминовых и фульвовых кислот
- Варьирование режимов аэрации и выбор оптимума
- Кинетика развития целлюлозолитических аэробов при использовании различных лигноцеллюлозных субстратов. Ингибиругощая способность лигнина
Введение к работе
Актуальность проблемы и общая характеристика работы. На сегодняшний день не существует отходов, которые нельзя было бы переработать тем или иным способом. Правда при этом велики расходы энергии и себестоимость единицы массы переработанных отходов. Именно это сдерживает применение традиционных способов переработки и одновременно стимулирует разработку новых экологически и экономически эффективных технологий.
К так называемым технологиям «нового поколения» следует отнести биотехнологические способы утилизации отходов. Продукты, получаемые биотехнологическими способами, выгодно отличаются от традиционных химических тем, что сырьем для их получения служат возобновляемые материалы животного и растительного происхождения, а также отходы различных производств.
Большая часть биотехнологий представлена различного рода ферментационными процессами. Занимаясь их разработкой, исследователи руководствуются следующими основными соображениями: получаемые продукты не должны представлять опасности для окружающей среды, а их себестоимость должна быть возможно ниже.
Фактически, создание и отладка новой технологии сводятся к поиску оптимальных величин параметров технологического процесса. Решать задачи такого рода позволяет математическое моделирование, в связи с тем, что лишь с использованием математической модели возможна объективная оценка хода процесса на любом этапе.
Среди многочисленных технологий биопереработки органического сырья, (анаэробное и аэробное компостирование, анаэробное сбраживание, гидролиз с последующим выращиванием кормовых дрожжей и др.), наиболее активно разрабатываемых на базе научно-исследовательских институтов РАСХН (ВНИПТИОУ, ВНИПТИХИМ, ВНИИСХМ, СЗНИИМЭСХ и др.), одной из наиболее перспективных является технология аэробной твердофазной ферментации навоза и помета с углеродсодержащими материалами растительного происхождения (торф, опилки, солома и др.), в основу которой положено воздействие на ферментируемую массу
воздуха, подаваемого извне компрессором. Регуляция процесса осуществляется варьированием физико-химических и биохимических параметров, что приводит к активации микрофлоры, присущей трансформируемым субстратам, и ее ферментного аппарата.
В 1987-2000 гг. во Всероссийском НИИ сельскохозяйственного использования мелиорированных земель (ВНИИМЗ) проводились фундаментальные и прикладные исследования, направленные на изучение биологических аспектов аэробной твердофазной ферментации и разработку технологии получения высокоэффективных, экологически чистых удобрений. Фундаментальные исследования были проведены при тесном сотрудничестве с кафедрой биотехнологии и химии Тверского государственного технического университета (ТГТУ).
В то же время, в этой области оставался нерешенным ряд проблем. Среди них недостаточно проработанным оказался вопрос использования в качестве компонентов смесей для ферментации различных углеродсодержащих отходов сельскохозяйственного производства, пищевой и деревоперерабатывающей промышленности. Кроме того, должное внимание не уделялось и поиску математических зависимостей параметров ферментации от состава и свойств исходных смесей.
В этой связи целью настоящей работы являлся поиск путей оптимизации аэробной твердофазной ферментации на основании результатов комплексного мониторинга процесса с учетом новых технологических решений и в зависимости от природы и количеств углеродсодержащих субстратов в составе исходных смесей.
Для достижения поставленной цели решались следующие основные задачи:
1. разработка полезной модели устройства (ферментера) для приготовления
удобрений (биокомпостов) и усовершенствование устройства пробопод-готовки для используемого в процессе ферментации анализатора кислорода. Выявление оптимальных параметров и режимов работы ферментера, обеспечивающих благоприятное течение процесса ферментации;
2. комплексное исследование базового процесса аэробной твердофазной
ферментации и процессов при использовании различных количеств угле
родсодержащих субстратов - ранее наиболее активно применяемых в
аналогичных процессах (опилки) и впервые предлагаемых к использованию в таком качестве (пивная дробина, льняная костра);
выявление связей между величинами, характеризующими течение исследуемых процессов;
разработка кинетической модели процесса ферментации, позволяющей оценить степень биодеградации органической фракции ферментируемых смесей, с целью его дальнейшей оптимизации для получения удобрений с заданными свойствами;
сравнительная оценка эколого-экономической эффективности производст-
ва и применения удобрений, получаемых по базовой технологии и при использовании углеродсодержащих субстратов.
Научная новизна работы и практическая значимость.
Разработана полезная модель установки для экспрессного приготовления биокомпостов. Усовершенствован анализатор кислорода посредством устройства пробоподготовки и получен патент на полезную модель.
Проведен экспресс-анализ базового процесса ферментации и доказана целесообразность 20-секундной продувки ферментируемой смеси через каждые 10 минут. Выполнен комплексный мониторинг процессов ферментации при использовании различных концентраций углеродсодержащих субстратов.
Установлено, что использование одного из традиционных субстратов (древесных опилок) допустимо лишь в количестве, не превышающем 5% от общей массы ферментируемой смеси, что подтверждается благоприятным течением процесса, способствующим формированию качественных продуктов.
Впервые в процессе аэробной твердофазной ферментации использованы 2 вида нетрадиционных углеродсодержащих субстратов - отходы сельского хозяйства (льняная костра) и пивоваренной промышленности (пивная дробина). Выявлены благоприятные уровни концентраций пивной дробины (5-15%) и льняной костры (5-10%) на течение процессов ферментации, их интенсивность и направленность.
Построена кинетическая модель, характеризующая развитие целлюлозораз-рушающих аэробов на начальной стадии процесса ферментации в зависимости от состава лигноцеллюлозного комплекса ферментируемых субстратов, позволившая
выявить пределы их концентраций, оказывающие позитивное влияние на развитие указанной группы микроорганизмов и их деградабельную способность.
Построена кинетическая модель биодеградации органической фракции ферментируемых смесей с учетом комплекса физико-химических показателей: температуры, влажности, зольности, кислородообеспечения, пористости, порозности, изменения массово-объемных соотношений, позволяющая осуществлять прогнозирование течения процесса ферментации с оценкой готовности и качества получаемой продукции (биокомпоста).
Выявлены оптимальные параметры и режимы работы ферментера, предложены подходы к расчету составов исходных смесей для получения удобрений с заданными свойствами.
Технологические приемы, представленные в диссертационной работе, могут использоваться сельскохозяйственными предприятиями различных форм собственности, обладающими разнообразной сырьевой базой, практически во всех регионах РФ и в настоящее время применяются при реализации процессов аэробной твердофазной ферментации на лабораторном, полупроизводственном и производственном уровнях во ВНИИМЗ.
Полученные данные и сделанные выводы использованы во ВНИИМЗ при выполнении Программы прикладных и фундаментальных исследований Россельхо-закадемии в 2001-2005 гг.: 12.05.05 «Разработать научные основы и технологии получения новых видов и форм органических удобрений, мелиорантов и кормовых добавок на основе биоферментации разнообразного растительного сырья, органических отходов и природных агроруд», а также проектов научных отраслевых программ Министерства образования и науки РФ, реализованных в ТГТУ: «Создание научных основ биосорбции и биодеструкции органических отходов» (программа «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники»), «Разработка технологии получения и использования биологически активных веществ - регуляторов биотехнологических процессов переработки сельскохозяйственного сырья» (программа «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники»).
Материалы диссертации могут оказаться полезными при подготовке курсов по математическому моделированию в сельскохозяйственной биотехнологии и других смежных дисциплинах.
Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на Международной конференции молодых ученых «От фундаментальной науки к новым технологиям» (Тверь, 2001), Международной научно-практической конференции «Использование органических удобрений и биоресурсов в современном земледелии» (Владимир, 2002), Всероссийской заочной конференции «Перспективы развития Волжского региона» (Тверь, 2003), Международной научно-практической конференции «Высокие технологии добычи, глубокой переработки и использования озерно-болотных отложений» (Томск, 2003), 11-ом Международном Конгрессе «Молекулярные взаимодействия между растениями и микроорганизмами: новые мосты между прошлым и будущим» (С.-Петербург, 2003), 6-ой Межрегиональной конференции по использованию и управлению земельными и водными ресурсами (Альбасете, Испания, 2003), 2-ой научно-практической конференции «Научные проблемы устойчивого развития Тверской области: экономика, экология, социология» (Тверь, 2003), Межрегиональной конференции «Производство продовольствия и вода» (Москва, 2004), конференции молодых ученых «Энергию молодых - мелиорации» (Москва, 2004), Международной научно-практической конференции «Научно-производственное обеспечение развития сельского социума» (Астрахань, 2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, получены патенты РФ на полезные модели №39599, № 38396 и патент РФ на изобретение № 2249581.
Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, 5 глав, выводов и рекомендаций, содержит 151 страницу печатного текста, 29 рисунков, 26 таблиц в основном тексте и 8 в приложениях. В списке литературы 139 наименований, в том числе 79 на иностранном языке.
Многообразие современных способов биоконверсии органического сырья и отходов. Преимущества твердофазной ферментации
В основе большинства процессов биоконверсии лежит деятельность микроорганизмов, определяющая скорость и глубину биотрансформации. Известно, что микроорганизмы способны участвовать в синтезе различных органических соединений. Исследования [1] показали, что направленная и регулируемая микробная конверсия способствует накоплению сложных циклических соединений.
Достоинства биоконверсионных процессов заключаются в отсутствии необходимости применять высокие температуры и давление при реализации ферментативных реакций, что свидетельствует о их большей эффективности по сравнению с традиционными методами переработки сырья, а также о сравнительной простоте технического обеспечения производственных процессов.
Биоконверсия позволяет достичь большей экологической чистоты произведенной продукции по сравнению с химическими технологиями, поскольку сырьем для ее осуществления служат возобновляемые материалы растительного и животного происхождения, а сама продукция полностью расходуется в процессах потребления [2, 3]. Поэтому процессы такого рода способны не только ускорить и удешевить получение конечной продукции, но и снизить затраты по защите воздушного и водного бассейнов, а также почвы от загрязнений.
Известны способы биоконверсии, в которых жидкие отходы сельскохозяйственных животных подвергаются прессованию и высушиванию [4]. Подобные подходы экономически нецелесообразны ввиду большой энергоемкости процесса сушки и неудовлетворительного качества получаемого корма. Поэтому жидкие фракции навоза рекомендуется подвергать биоочистке в аэротенках с возможностью доочистки в рыбоводно-биологических прудах [5].
Достаточное распространение в сельскохозяйственной практике получили различные методы силосования отходов животноводства с растительными остатками, а также гидролитические способы получения биоконверсионных продуктов путем воздействия на органическое сырье разбавленными кислотами. Их использование позволяет существенно увеличить выход глюкозы в конечных продуктах [6].
В качестве сырья для приготовления удобрений особой популярностью пользуется торф. Доказана целесообразность его использования при переработке сточных вод предприятий пищевой промышленности и животноводческих комплексов на удобрения. Существуют неферментационные технологии, позволяющие использовать торф для производства кормовых добавок [7]. При этом через слой сфагнового торфа со степенью разложения 5-20% и влажностью 50-60%, служащий своего рода фильтром, пропускают сточные воды, что способствует насыщению конечного продукта белково-жировыми веществами. Полученный продукт подвергают сушке, пока его влажность не достигнет 5-10%.
Гидролизаты древесины и торфа можно использовать в качестве питательной среды для кормовых дрожжей, что позволяет получать разнообразные белковые, каротиноидиые и жировые препараты [8, 9].
В последние десятилетия достаточной популярностью пользуется метод переработки органических отходов вермикультивированием. Характерной чертой этого способа биопереработки является возможность использования широкого спектра органического сырья и отходов красным калифорнийским червем: навоза всех видов животных, помета птицы, осадков очистных сооружений, отходов сельскохозяйственного и перерабатывающих производств [10, 11].
Методами анаэробного разложения органических отходов получают биогаз. В состав биогаза, который относится к возобновляемым источникам энергии, входит 50-60% метана [12]. Производство биогаза из возобновляемых источников - отходов биомассы промышленного, сельскохозяйственного и бытового происхождения - осуществляется во многих странах. Пионером в этой области являются США [13].
В достаточной степени эффективным признан процесс культивирования дрожжей на отходах животноводческих комплексов [14], заключающийся в разделении жидкой и твердой фракций с помощью центрифугирования исходного сырья с последующим гидролизом жидкой фракции серной кислотой и нейтрализации известковым молоком. Твердая фракция складируется и используется для получения компоста, жидкая используется для выращивания дрожжей. Разработаны способы выращивания дрожжей из отходов животноводства без их предварительного гидролиза. Для лучшей биотрансформации исходное сырье подвергается предобработке: пастеризации, аэробной или анаэробной ферментации. Одновременно с ростом и размножением дрожжевых клеток гибнут патогенные микроорганизмы. Эти процессы не только позволяют получать дешевые кормовые добавки, но и способствуют облагораживанию 90% животноводческих стоков [15].
Наряду с этим, постоянно разрабатываются и совершенствуются способы очистки отходов животноводства с использованием микроводорослей Spirulina и аэрирования субстрата. В ходе таких процессов биопереработки в большом количестве синтезируются аминокислоты и витамины, в том числе пантотеновая и никотиновая кислоты, рибофлавин и пиридоксип.
Значительная часть современных процессов биоконверсии может быть отнесена к так называемым способам твердофазной ферментации [16], для которых характерен кометаболизм, то есть участие, как минимум, двух субстратов, один из которых используется для роста микроорганизмов, а другой превращается в ценный целевой продукт [17]. При этом осуществляется культивирование микроорганизмов на увлажненных твердых субстратах.
В отличие от способов ферментации жидких субстратов, для твердофазной ферментации характерны больший выход полезного продукта с улучшением его свойств, меньшие затраты и относительная простота. Для осуществления твердофазной ферментации используются природные гетерогенные материалы [18], содержащие сложные полимеры: лигнин [19], пектин [20, 21], лигпоцеллюлозу [22] и т.д.
Твердофазная ферментация направлена на получение продукции широкого спектра использования. Ниже представлены процессы твердофазной ферментации, нашедшие применение в разных отраслях промышленности и сельскохозяйственного производства.
В пищевой промышленности применение твердофазной ферментации обусловлено необходимостью производства ферментов, органических кислот, ароматизаторов и др. Так, культивированием Aspergillus oryzae на смесях из пшеничных отрубей и соевых хлопьев производят протеиназы для получения соевых соусов [23]. Под действием протеиназ нерастворимый протеин соевых хлопьев преобразуется в небольшие растворимые пептиды и аминокислоты, которые составляют соевый соус.
Лимонная кислота является одной из наиболее важных органических кислот, используемых в пищевой промышленности. Несмотря па то, что традиционное производство базируется на жидкофазной ферментации, разработаны альтернативные приемы твердофазной ферментации, в которых для получения лимонной кислоты используются отходы сельскохозяйственного производства [24].
Определение органического углерода гуминовых и фульвовых кислот
К навеске органического субстрата 2-2.5 г приливают 200 мл 0,1 н. раствора NaOH, перемешивают и оставляют до следующего дня (20-24 ч). В течение рабочего дня содержимое колб время от времени помешивают. Чтобы изолировать раствор NaOH от СОг воздуха (во избежание образования соды и растворения гуматов кальция), колбы необходимо закрыть притертыми пробками.
На следующий день в колбы прибавляют 50 мл насыщенного раствора Na2S04 (1/4 объема жидкости) для коагуляции илистых частиц и ускорения фильтрации, хорошо перемешивают растворы, оставляют колбы в покое на 10-15 мин, снова перемешивают непосредственно перед фильтрацией и фильтруют через бумажный (простой, нескладчатый) фильтр диаметром 15-17 см.
При фильтрации, особенно в самом начале, необходимо перенести на фильтр раствор вместе с субстратом, чтобы заполнить поры фильтра его частицами. Если первые порции фильтрата получаются мутными, их снова выливают на фильтр, добиваясь полной прозрачности раствора. Остаток анализируемого субстрата на фильтре и в колбах не промывают, а выбрасывают, так как в дальнейший анализ он не идет, В отдельных порциях полученной вытяжки определяют содержание органического углерода по Тюрину, бурых гуминовых кислот (БГК) и фульвокислот (ФК). - Определение содержания органического углерода по Тюрину. В конические колбочки на 100 мл берут от 10 до 50 мл вытяжки в зависимости от густоты ее окраски, прибавляют немного, на кончике тонкого шпателя, прокаленной пемзы и выпаривают содержимое колбочки на кипящей водяной бане или этернитовой плитке. В последнем случае не нужно сильно кипятить вытяжки и лучше выпаривать их не совсем досуха, чтобы избежать разложения при высокой температуре некоторых органических веществ и растрескивания колб от перегрева в сухом состоянии. Окончательно остаток на дне колбочек досушивают на водяной бане или в сушильном шкафу при температуре 80-90 С. Органический углерод в сухих остатках определяют по Тюрину. Для получения достоверных результатов определение проводится дважды. - Определение содержания углерода БГК. В коническую колбочку на 100-200 мл берут пипеткой 50-100 мл щелочной вытяжки и прибавляют к ней двойное эквивалентное количество 1,0 н. раствора H2SO4, т.е. соответственно 10 или 20 мл, с таким расчетом, чтобы концентрация свободной серной кислоты в подкисленной вытяжке была приблизительно 0,05 н., а рН раствора не менее 1,3-1,5 (осаждение ГК концентрированной H2SO4 недопустимо!). Содержимое колбочек нагревают до 70-80С (не доводить до кипения!) и фильтруют в подогретом или охлажденном состоянии через небольшой беззольный фильтр - белая или синяя лента. Осадок ГК в колбочке и на фильтре промывают 2-3 раза слабым раствором H2SO4 (0,05 и 0,1 н), после чего не нужно промывать осадок водой во избежание частичного растворения ГК. Воронки с осадками ГК, после того как они отмыты слабым раствором серной кислоты, вставляют в те же колбочки, в которых производили осаждение (на стенках их всегда остаются частицы ГК), и растворяют ГК из промывалки небольшими порциями горячего раствора NaOH. Щелочной раствор доводят до объема 100 мл в мерной колбочке и отсюда берут пробы для определения углерода гуминовых кислот (СГк). Определение в продуктах ферментации жизненно необходимых элементов питания проводят в обязательном порядке с целью агрохимической оценки их качества. Такая оценка позволяет впоследствии легко рассчитать необходимые для внесения дозы удобрения в почву. Кроме того, она позволяет проверить эффективность процесса производства этих удобрений. Сущность метода. Метод основан на минерализации сухого органического удобрения при нагревании с концентрированной серной кислотой в присутствии перекиси водорода или смешанного катализатора с последующим измерением оптической плотности окрашенного индофенольного соединения, образующегося в щелочной среде при взаимодействии аммиака с гипохлоритом и салицилатом натрия. Минерализацию органического субстрата осуществляют методом мокрого озоления при помещении навески в колбу Кьельдаля с концентрированной серной кислотой и смешанным катализатором, либо с концентрированной серной кислотой и перекисью водорода. Кипячение раствора продолжают до его полного обесцвечивания. После обесцвечивания раствор кипятят еще в течение 15-20 мин, а затем колбу снимают с колбонагревателя и охлаждают. Ход анализа. В химические стаканы или конические колбы вместимостью 100 см или бытовые банки в кассетах помещают по 0,5 см раствора, полученного за счет переноса минерализата в колбу на 250 см3, предварительно налив в нее 25-30 см3 воды. При этом происходит разогревание содержимого колбы. После охлаждения объем раствора доводят до метки дистиллированной водой. Полученный раствор минерализата служит исходным для определения массовой доли общих форм азота, фосфора и калия. Параллельно в химические стаканы помещают растворы сравнения в объеме 0,5 см3 и добавляют к содержимому каждой колбы по 50 см3 рабочего окрашивающего раствора. Растворы перемешивают, прибавляют по 2,5 см3 рабочего раствора гипохлорита натрия и снова перемешивают. Растворы оставляют на 1 ч при комнатной температуре для полного развития окраски. Оптическую плотность растворов измеряют относительно раствора сравнения №1, при длине волны 655 нм, используя кюветы 10 мм. Одновременно через все стадии анализа проводят контрольный опыт в тех же условиях и с тем же количеством реактивов, но без анализируемого продукта для внесения поправки в результат анализа, для учета содержания примесей аммония в реактивах. Приготовление реактивов. 1. Рабочий окрашивающий раствор. В плоскодонную колбу вместимостью 4 л помещают 250 мл запасного окрашивающего раствора, приливают 2 л дистиллированной воды и 100 мл раствора NaOH молярной концентрации 2 моль/л, а затем 4,5 трилона Б. 2. Раствор сравнения. В мерные колбы вместимостью 100 мл помещают указанные в табл. 2.2 объемы образцового раствора NH4CI. Затем в каждую колбу до-бавляют по 50 см дистиллированной воды, по 8 см концентрированной H2SO4 и содержимое колб перемешивают. После охлаждения объемы растворов доводят дистиллированной водой до метки и снова перемешивают. Их хранят в холодильнике не более 3-х месяцев. Для градуировки фотоэлектроколориметра растворы сравнения используют в день проведения анализа. Окрашивание растворов сравнения проводят аналогично окрашиванию анализируемых растворов и одновременно с ними.
Варьирование режимов аэрации и выбор оптимума
Как видно из рисунка, максимальный рост температуры был зафиксирован в опытах с 10-20% пивной дробины. Кроме того, для этих опытов были отмечены минимальные коэффициенты охлаждения смесей, что связано, по-видимому, с тем, что в этих опытах микробная активность сохранялась на достаточно высоком уровне вплоть до конца процесса. Отметим, что для опытов с 15-20% пивной дробины была отмечена максимальная длительность термофильного периода - 4-6 суток, что свидетельствует о благоприятном воздействии пивной дробины на метаболизм микроорганизмов термофильной группы.
Для опытов с 15 и 20% льняной костры и 5-20% древесных опилок на фоне быстрого разогрева смесей в течение 1-2-х суток, о чем свидетельствуют соответствующие величины коэффициента разогрева, было отмечено сокращение длительности термофильного периода по сравнению с базовым процессом до 2-х суток, что указывает на ингибирующий эффект избытка лигноцеллюлозных компонент в отношении термофильной микрофлоры.
Сходным образом анализировались данные об изменении содержания кислорода в ферментируемых смесях (рис. 3.5). При этом сравнивались коэффициенты поглощения кислорода микроорганизмами: максимальный (ОХМАХ - отношение содержания кислорода в воздухе ( 21%) к минимальному содержанию кислорода, зафиксированному в ходе эксперимента) и итоговый (OXFIN - отношение содержания кислорода в воздухе к содержанию кислорода в смеси к концу процесса), а также длительность периода (MINOXIN), в течение которого содержание кислорода в смеси не выходило за границы 5-12%-ного интервала.
Очевидно, что максимальными величинами MINOXIN, соразмеримыми с величиной этого показателя для базового процесса, а стало быть наилучшим поглощением кислорода микрофлорой характеризовались все опыты с пивной дробиной, а также опыты с 5% льняной костры и 5% древесных опилок. В опытах с большим содержанием лигноцеллюлозных субстратов — костры и опилок - наблюдали снижение скорости и величины общего поглощения кислорода, о чем свидетельствует уменьшение величин MINOXIN и ОХМАХ. К концу процесса во всех опытах содержание кислорода оказывалось близким к атмосферному.
Результаты корреляционного анализа убедительно доказывают существование тесной антибатной связи между изменениями температуры в ходе фермента 83 ции и соответствующими изменениями содержания кислорода в смесях: величина отрицательной корреляции между этими показателями в среднем по опытам составила RcP —0,84. В дальнейшем указанная взаимосвязь этих показателей может быть использована в целях оценки уровня потребления кислорода микрофлорой на основании температурных изменений, и наоборот.
Поскольку изменения температуры смесей являются следствием активной биодеградации органических соединений, составляющих ферментируемые субстраты, оказывается целесообразным анализ изменений зольности ферментируемых смесей (рис. 3.6). Как видно из рисунка, наилучшей степенью озоления в ходе ферментации, измеряемой отношением зольности конечного продукта к зольности исходной смеси, характеризовались опыты с использованием 10-20% пивной дробины. Озолением, соразмеримым с базовым опытом, характеризовались опыты с 5% пивной дробины, 5-10% льняной костры и 5% древесных опилок. В то же время в опытах с 15-20% костры и 10-20% опилок отмечено снижение степени озоления продуктов ферментации, что в очередной раз доказывает ранее сделанные выводы о труднодоступное субстратов, богатых веществами лигноцеллюлозной природы, для микрофлоры, осуществляющей биотрансформацию.
Аналогично базовому опыту влажность смесей в опытах с дробиной, кострой и опилками монотонно снижалась (табл. П. 1.1). Следует отметить, что в опытах с 20% льняной костры и древесных опилок степень высушивания смесей к концу ферментации оказывалась существенно выше, чем во всех остальных опытах. Это связано с тем, что для смесей большими количествами костры и опилок наряду с температурой на изменение влажности оказывает существенное влияние фактор повышенной порозности ферментируемых субстратов.
Результаты биохимических исследований процесса ферментации в опытах с использованием пивной дробины, льняной костры и древесных опилок свидетельствуют о том, что использование указанных субстратов привносит в ранее отмеченные для базового опыта закономерности свою специфику (табл. П.1.2-П.1.5). Во всех опытах наблюдали снижение содержания сырой клетчатки и сырого жира, однако степень конверсии указанных веществ была различной. Степень конверсии того или иного вещества можно выразить формулой: где Со и Cf,n начальная и конечная массовые концентрации соответственно. На рис. 3.7 представлены результаты сравнительного анализа степеней конверсии трудногидролизуемых соединений: жиров и клетчатки во всех опытах.
На основании полученных сведений об изменении степеней конверсии сделаны выводы о том, что, во-первых, степень конверсии тесным образом связана с величиной температурного максимума и длительностью термофильной фазы, а во-вторых, что значительные количества лигноцеллюлозосодержащих субстратов ин-гибируют не только процессы деструкции целлюлозы, но и других трудногидролизуемых соединений, в частности, жиров. Кроме того, можно констатировать, что во всех опытах с использованием пивной дробины в сравнении с базовым процессом наблюдается активация деструкции высокомолекулярных соединений, проявляющаяся наилучшим образом в опытах с 10-15% дробины.
Кинетика развития целлюлозолитических аэробов при использовании различных лигноцеллюлозных субстратов. Ингибиругощая способность лигнина
Резюмируя вышесказанное, следует отметить, что введение в состав исходных смесей органических субстратов различной природы по-разному отражалось на течении процессов ферментации.
Установлено, что наилучшим разогревом смесей, максимальной длительностью термофильного периода и минимальными коэффициентами остывания отличались опыты с 10-20% пивной дробины, что свидетельствовало о благоприятном воздействии указанного субстрата в отношении микроорганизмов, активизирующихся в термофильную фазу. Наряду с быстрым увеличением температуры для опытов с 15 и 20% льняной костры и 5-20% древесных опилок отмечено сокращение длительности термофильного периода по сравнению с базовым процессом, что указывает на ингибирующий эффект избытка лигноцеллюлозных компонент в отношении термофильной микрофлоры.
Отмечено, что по сравнению с базовым опытом наилучшим поглощением кислорода микрофлорой (лучшим коэффициентом ОХМАХ, а также максимальным периодом MINOXIN) характеризовались все опыты с пивной дробиной, а также опыты с 5% льняной костры и 5% древесных опилок. Очевидно, что существование значимого отрицательного коэффициента корреляции (R , -0,84) между величинами температуры смеси и объемной концентрации кислорода, свидетельствующего об антибатности динамики этих физико-химических параметров, может быть использовано при оценке скорости потребления кислорода микрофлорой на основании температурных изменений, и наоборот.
Наилучшей степенью озоления, свидетельствовавшей об активной биодеградации в ходе ферментации, характеризовались опыты с использованием 10-20% пивной дробины. В опытах с 15-20% костры и 10-20% опилок степень озоления продуктов ферментации оказывалась существенно ниже, что подтверждает вывод о труднодоступное субстратов, богатых веществами лигноцеллюлозной природы.
Выявлено, что степень конверсии высокомолекулярных органических соединений (целлюлозы, жиров) зависит от длительности термофильной фазы, проявляясь наилучшим образом в опытах с 10-15% пивной дробины. В опытах с пивной дробиной (5-15%) направленность процессов трансформации, определяемая каталазно-дегидрогеназным коэффициентом (КДК), аналогична базовому опыту, причем первичное увеличение КДК указывает на доступность веществ пивной дробины, способных оказывать каталитическое влияние на ферментный аппарат микрофлоры.
Обнаружены высокие коэффициенты корреляции между содержанием триптофана и протеазной активностью, варьирующие в интервале 0,8-0,9 для опытов с пивной дробиной (10-15%), льняной кострой (5-10%) и опилками (5%), в которых накопление аминокислоты было максимальным, что свидетельствует о высокой удобрительной ценности получаемых продуктов.
Результаты исследований влияния различных углеродсодержащих субстратов на ход процесса ферментации и формирование продуктов с высоким удобрительным потенциалом позволили сделать вывод о сохранении тенденции преимущественного накопления гумусоподобных соединений в ходе ферментации независимо от типа используемого субстрата.
Максимальное накопление в ходе ферментации гумусоподобных соединений, в том числе, доступных для растений фульвокислот, наблюдали в опытах с пивной дробиной (5-15%); достаточно высокое, соразмеримое с базовым процессом, - в опытах с льняной кострой (5-10%) и древесными опилками (5%). Продукты ферментации, приготовленные при использовании органических субстратов в указанных количествах, богаты фульвокислотами и обладают согласно «конденсационной» теории пролонгированными удобрительными свойствами, поскольку при внесении в почву способны повышать запас ее питательных веществ и плодородие. При этом, как показали величины полифенолоксидазно-пероксидазных коэффициентов (ППК), в опытах с применением пивной дробины (10-15%) к концу ферментации (при остывании смесей) наблюдалось превалирование активного прямого синтеза фульвокислот, что отличало эти опыты от всех прочих, для которых было характерно преимущественное накопление фульвокислот за счет деструкции исходных высокомолекулярных соединений.
