Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Особенности работы дыхательной цепи в интактной клетке 9
1.2. Современные концепции регуляции дыхания в клетке 20
1.3. Оценка состояния различных участков дыхательной цепи в интактных клетках и тканях 27
2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 37
2.1. Объект исследования 37
2.2. Реактивы и среда инкубации 38
2.3. Измерение скорости потребления кислорода кле- 39 точно-тканевыми препаратами
2.4. Исследование динамики окислительно-восстановительных превращений в тканевых препаратах флуорометрическим методом 42
2.5. Выбор режима работы с тканевыми препаратами 45
2.5.1. Характеристика окислительного метаболизма тканевых препаратов в процессе их переживания 45
2.5.2. Влияние температурного режима на активность дыхательной цепи в тканевых препаратах 51
ДИНАМИЧЕСКАЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНО-ПОЛЯРОГРАФИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ РАЗЛИЧНЫХ УЧАСТКОВ ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ В ТКАНЕВЫХ И КЛЕТОЧНЫХ ПРЕПАРАТАХ 56
3.1. Оценка интенсивности НАД-зависимого окисления в тканевых препаратах о помощью ингибиторного анализа 56
3.2. Особенности окисления сукцината в тканевых препаратах 72
3.3. Терминальный участок дыхательной цепи в тканевых препаратах 83
3.4. Оценка относительной активности /^-К+-тран-спортной АТФазы в срезах мозга с помощью калиевой нагрузки 90
3.5. Оценка состояния и активности различных участков дыхательной цепи в изолированных клетках печени 92
ИНГИБИТОРНЫИ АНАЛИЗ АКТИВНОСТИ ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ В ТКАНЕВЫХ ПРЕПАРАТАХ ПРИ ИЗМЕНЕНИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ТКАНИ 99
4.1. Влияние температурного режима 99
4.2. "Возраст" тканевых препаратов 100
4.3. Модель "голодания" ЮЗ
4.4. Особенности работы дыхательной цепи в тканевых препаратах мозга при сниженном значении р02... НО
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПАРАМЕТРОВ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО МЕТАБОЛИЗМА ДЛЯ ОТБОРА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА ТКАНЕВЫХ ПРЕПАРАТАХ
5.1. Проверка чувствительности параметров окислительного метаболизма тканевых препаратов к действию ХС-ингибиторов НАД-зависимого участка дыхательной цепи 119
5.2. Прогнозирование общей токсичности ХС по их ингибирующему влиянию на тканевое дыхание... 135
5.3. Экспресс-тест для выявления на тканевых препаратах ХС, влияющих на /^-К+ транспортную АТФазу 141
ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ 144
ВЫВОДЫ 148
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
- Особенности работы дыхательной цепи в интактной клетке
- Реактивы и среда инкубации
- Оценка интенсивности НАД-зависимого окисления в тканевых препаратах о помощью ингибиторного анализа
- Влияние температурного режима
- Проверка чувствительности параметров окислительного метаболизма тканевых препаратов к действию ХС-ингибиторов НАД-зависимого участка дыхательной цепи
Особенности работы дыхательной цепи в интактной клетке
"Тканевое" (клеточное) дыхание является параметром, отражающим активность множественных кислородзависимых процессов. Основная его часть связана с работой митохондриальной редоке-цепи и ее энергообразующей функцией, сопряженной с энергопотреб-лягощими процессами. Последние, как известно, протекают преимущественно во внемитохондриальном пространстве. Увеличение потребности в АТФ при инициации этих процессов интенсифицирует работу митохондриальной дыхательной цепи и сопряженные с ней потребление кислорода и окислительное фосфорилирование, что, в конечном итоге, приводит к образованию АН, компенсирующему его расход.
Обширный экспериментальный и теоретический материал, накопленный в работе с изолированными митохондриями и касающийся особенностей регуляции работы дыхательной цепи, никогда не снимал с повестки дня вопрос о специфических особенностях ее поведения в интактной клетке, в условиях сохранения сложнейшей связи между отдельными внутриклеточными структурами и метаболическими процессами, протекающими в них. Во многих работах, посвященных этой проблеме, неоднократно делались попытки проведения аналогий между состоянием дыхательной цепи митохондрий in vitio и в интактных клеточных, либо даже органных системах (мышца, печень, сердце, асцитные клетки, нервная ткань). Эти исследования показали, что потенциальная окислительная способность клеточных препаратов соответствует тому, что известно для изолированных митохондрий (49,51,52-55,60,68,93,97,140).
Эффективность окислительного фосфорилирования в клеточных препаратах оценивается теми же параметрами, что и в изолирован -10 ных митохондриях. Чансом были получены значения Р/0 для интакт-ных клеток асцитной опухоли Эрлиха, равные 0,9 на пункт фосфорилирования, что соответствует лучшим значениям, известным для изолированных митохондрий (52-55,97). Образование І моля АТФ на пункт фосфорилирования было подтверждено в серии исследований последних лет на самых разных клеточных объектах, органах и тканях: изолированных клетках печени, перфузируемых печени и сердце, у простейших одноклеточных, представителей разных классов (80,112,140,164).
Общая закономерность расположения дыхательных переносчиков в интактной клетке такая же, как и в изолированных митохондриях (52,65-67), то есть в условиях in vitio и in VlVo сохраняются общие принципы структурной организации дыхательной цепи.
Реактивы и среда инкубации
Работа проведена на тканевых препаратах коры головного мозга и печени, а также изолированных клетках печени беспородных белых крыс-самцов, весом 170-200 г.
Тканевые препараты приготовляли стандартным способом лезвием безопасной бритвы на микротоме (24-). Толщина получаемых препаратов составляла около 0,3-0,4 мм, вес препаратов был равен 3-5 мг. Для получения полноценных препаратов вся процедура их приготовления занимала 2-3 минуты со времени декапитации животного и экстирпации ткани. Часть препаратов использовали сразу же после приготовления (свежеизолированные), остальные помещали в специальные бюксы или чашки Петри и заливали инкубационной средой, подогретой до нужной температуры в соответствии с выбранным оптимальным режимом работы (см.ниже). Для облегчения диффузии кислорода к препаратам среду заливали таким образом, чтобы слой жидкости покрывал их не более, чем на 2-3 мм. Периодически производили перемешивание раствора. Преинкубацию тканевых препаратов (согласно выбранному режиму) производили в течение 40-60 минут при 37 в среде Тироде с глюкозой, кроме экспериментов на животных, подвергнутых предварительному голоданию, когда глюкозу заменяли на сахарозу в эквимолярной концентрации.
Для выяснения, как влияет изменение функционального состояния ткани на активность дыхательной цепи в тканевых препаратах, были проведены эксперименты на голодных животных и животных с различной резистентностью к гипоксии. Животные, переведенные на голодание, в течение 24 часов до эксперимента получали -только воду. Контрольным животным предоставлялось полноценное питание (смешанно-углеводная диета). Разделение животных по их резистентности к недостатку кислорода проводили по методу,предложенному Пьюшотем и Хош (143). Величина реакции животных на острый гипоксический стимул оценивалась по времени их пребывания на "высоте" 11000 м. Появление беспокойства, форсированного дыхания и агонального вдоха служило критерием устойчивости животных к гипоксии. После медленного "спуска" животные были разделены на три группы: I. Устойчивые ("У") - время наступления указанных признаков более 10 минут. 2. Среднеустойчивые -от 3 до 10 минут. 3. Неустойчивые ("НУ") - менее 3 минут. Через неделю "У" и "НУ" животных брали в эксперимент.
Изолированные клетки печени получали по методу Сеглена (148). Интактность гепатоцитов оценивали трипановым синим. Концентрация гепатоцитов в измерительной ячейке составляла 0,5-1,0 млн.клеток/мл.
Оценка интенсивности НАД-зависимого окисления в тканевых препаратах о помощью ингибиторного анализа
В отличие от изолированных митохондрий, в интактных клетках и тканевых препаратах имеется достаточное количество эндогенных субстратов, АДФ, Фн, которые обеспечивают сравнительно высокие скорости дыхания при физиологически адекватных условиях их инкубирования. Тем не менее экзогенные субстраты специфически изменяют ориентацию метаболизма. Так, например, НАД-зави-симые субстраты увеличивают скорость потребления кислорода тканевыми препаратами мозга и печени, хотя и с разной интенсивностью, определяемой метаболизмом ткани, зависящей также от температуры, условий инкубации, функционального состояния ткани (табл. 1,2). При этом, как правило, наблюдается восстановление пиридиннуклеотидов и флавопротеидов (рис.6,9).
В тканевых препаратах головного мозга, инкубируемых при 36,5 и окисляющих НАД-зависимые субстраты (кроме пирувата), удается наблюдать корреляцию между изменением скорости дыхания и редокс-состоянием ПНН и ФП: активация дыхания в первые 2-3 минуты протекает на фоне увеличения степени восстановленности ПНН и ФП; последующее уменьшение дыхания сопровождается снижением степени их восстановленности (рис.б ). Восстановление ПНН при действии НАД-зависимых субстратов существенно меньше, чем при окислении сукцината (рис. ). Наблюдаемый эффект восстановления дыхательных переносчиков в первом пункте фосфорилирования является отражением активации потока восстановительных эквивалентов в дыхательную цепь при окислении НАД-зависимых субстратов. Поэтому комплексная регистрация флуоресценции ПНН и ФП может быть использована в качестве показателя функционирования этого участка.
Пируват окисляет ПНН в свежеизолированных препаратах мозга (рис. ВА). Аналогичный эффект был получен Ван Россумом (162) на срезах печени и Чансом на перфузируемом сердце (68) и связывается с окислением пирувата в цитозоле либо в лактат-, либо в малатдегидрогеназной реакции. Снижение люминесценции в этом случае может отражать окисление цитозольного НАДН в одной из этих реакций. Тем не менее поток восстановительных эквивалентов в дыхательную цепь при этом поддерживается на достаточно высоком уровне, о чем может свидетельствовать восстановление флавинов, обусловленное перераспределением метаболических потоков в системе аэробного и анаэробного окисления (рис.8А).Через 60 минут после экстирпации ткани экзогенный пируват приводит По-видимому, в 60-минутных срезах происходит усиление окисления пирувата через НАД-зависимый участок дыхательной цепи. Таким образом, комплексная регистрация динамики редокс-ивменений ПНН и-ФП позволяет получать информацию о внутриклеточной локализации наблюдаемых изменений и направлении метаболических потоков.
Влияние температурного режима
В разделе ,2 было показано, что при работе с тканевыми препаратами, используемыми в качестве биологической модели,следует применять температуры, близкие к физиологическим (36-37), поскольку снижение температуры до 32-30 резко нарушает функциональные свойства ткани данного типа. У возбудимых тканей млекопитающих исчезает способность реагировать на электростимуляцию, подавляются синтетические процессы, снижается активность многих ферментных процессов. Наконец, при уменьшении температуры до 20 подавляется активность системы микросомального окисления (28а). В целом функционально метаболическая картина начинает резко отличаться от условий in vi\/o. Как уже отмечалось в разделе 2, изменение температуры влияет и на активность дыхательной цепи. Переход к физиологической температуре инкубации (36-37) ускоряет утилизацию субстратов (рис. ,5) и может вообще менять соотношение, направленность и эффективность действия субстратов (табл. I, 2). Ингибиторный анализ показывает, что температурный режим сказывается на особенностях работы различных участков дыхательной цепи. Так, для 60-минутных тканевых препаратов печени, окисляющих НАД-зависимые субстраты (пируват, глутамат, НАДН)?амиталчувствительное дыхание уменьшается при переходе к 20 (табл.І), что свидетельствует об ограничении способности данных субстратов окисляться через НАД-зависимый участок дыхательной цепи в этом случае. То же самое имеет место и при окислении глутамата 60-минутными срезами мозга (табл.2). Для свежеизолированных препаратов мозга, окисляющих различные экзогенные субстраты, амиталчувствительное дыхание, как правило, выше при 20, чем при 37 (табл.2). Через 60 минут соотношение меняется. Из этого следует, что температура должна влиять на процесс переживания тканевых препаратов. Действительно, предварительная инкубация ткани при сниженной температуре (20), задерживает ликвидацию последствий экстирпации, о чем свидетельствует лишь незначительное снижение высокой скорости эндогенного дыхания в процессе переживания срезов (табл.І, 2). При этом увеличивается амиталрезистентное дыхание в обеих тканях (табл.І, 2), свидетельствующее об ограничении НАД-зависимого окисления. При переходе к 20 изменяется также соотношение цианидчувствительного и цианидрезистентного дыхания (табл.І, 2).
Таким образом срезы тканей, видимо, отвечают на снижение температуры так же, как и ткани в организме при искусственном охлаждении.
class4 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПАРАМЕТРОВ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО МЕТАБОЛИЗМА ДЛЯ ОТБОРА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА ТКАНЕВЫХ ПРЕПАРАТАХ class5
Проверка чувствительности параметров окислительного метаболизма тканевых препаратов к действию ХС-ингибиторов НАД-зависимого участка дыхательной цепи
Результаты оценки состояния и относительной активности различных участков дыхательной цепи в клеточных системах с помощью ингибиторного анализа позволили предположить, что принципиально возможно использовать тканевые препараты для выявления ХС, действующих на энергетическую функцию клетки и нарушающих, в частности, процесс НАД-зависимого окисления. Это имеет большое значение в связи с тем, что,как показано Ягужинским Л.С. и сотр., самые разнообразные химические соединения, обладающие высокой липидорастворимостью, могут взаимодействовать с начальным участком дыхательной цепи между НАД+ и цитохромом в (28,30, 32, 33, 35). Эффект обусловлен неспецифической гидрофобной адсорбцией полярных и нейтральных молекул на ферменте, приводящей к торможению транспорта электронов. В полиферментной системе митохондрий он установлен, в частности, для нейтральных ароматических соединений, слабокислых фенолов, а также производных барбитуровой кислоты. Все эти вещества объединяются общими признаками: высокими рК и липидорастворимостью. Эти свойства определяют направленность их действия в изолированных полиферментных системах как ингибиторов дыхания и фосфорилирования при окислении НАД-зависимых субстратов, когда активирован первый участок дыхательной цепи, на котором указанные вещества легко адсорбируются. Эти же вещества слабее адсорбируются на втором гидрофобном участке дыхательной цепи (сукцинатдегидрогеназа -цитохром в). Поэтому их влияние на окисление сукцината проявляется при концентрациях, значительно более высоких, чем при окислении НАД-зависимых субстратов.
Методы исследования химико-физического взаимодействия веществ с первым ферментным комплексом дыхательной цепи в изолированной полиферментной системе митохондрий в настоящее время достаточно хорошо разработаны Ягужинским и сотр. (33). Возможность использования для этих целей тканевых препаратов, получение которых существенно проще, чем изолированных митохондрий, не изучена. Как уже указывалось выше, экономичность препаративного этапа работы с биологическими объектами и возможность экспресс-оценки свойств ХС имеет большое значение в условиях массового скрининга веществ и получения информации об их биологическом действии.
Для выяснения этого вопроса были исследованы 7 производных барбитуровой кислоты (табл.8), для которых на изолированных митохондриях установлено их взаимодействие с начальным участком дыхательной цепи.
Испытывали действие нарастающих концентраций этих веществ на дыхание и редокс-состояние дыхательных переносчиков в тканевых препаратах мозга и печени, окисляющих НАД-зависи-мый субстрат (смесь глутамата и малата), сукцинат и глюкозу. Влияние ХС на тканевое дыхание и состояние дыхательных переносчиков сравнивали с эффектами, полученными с помощью ами-тала.
