Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 7
1. Клубнеобразование у картофеля 7
2. Факторы, влияющие на процесс клубнеобразования 8
2.1. Факторы окружающей среды (экологические факторы) 8
2.2. Гормоны 10
2.3. Углеводы 16
3. Ферменты углеводного метаболизма 17
3.1. Инвертаза 21
3.2. Сахарозосинтаза 27
3.3. Фруктокиназа, УДФ-глюкозопирофосфорилаза и гексокиназа 31
3.4. АДФ-глюкозопирофосфорилаза 34
3.5. Синтез крахмала 36
3.6. Формирование крахмальных гранул 38
4. Трансгенные растения 43
4.1. Плазмиды агробактерий рода Agrobacterium: Ті- и Ri-плазмиды 44
4.2. Гены го/ 47
Материалы и методы 57
1. Реактивы, использованные в работе 57
2. Объекты 57
3. Выращивание растений in vitro 58
4. Препарирование растений для цитологических исследований 60
5. Определение активности ферментов углеводного метаболизма 61
5.1. Гистохимическое определение локализации активности ферментов углеводного метаболизма in situ 61
5.2. Определение активности ферментов углеводного метаболизма в экстрактах 64
6. Определение содержания цитокининов в микроклубнях картофеля... 65
7. Определение содержания Сахаров в микроклубнях картофеля 66
8. Определение содержания крахмала в микроклубнях картофеля 67
9. Статистическая обработка данных 68
Результаты 69
1. Морфогенетические особенности растений картофеля, содержащих ген дрожжевой инвертазы, rolC- и rolB-гены 69
1.1. Рост в условиях, неблагоприятных для клубнеобразования 69
1.2. Образование клубней в условиях, благоприятных для клубнеобразования 71
2. Анатомическое строение микроклубней контрольных и трансформированных вариантов растений картофеля 73
2.1. Соотношение различных тканей клубня 73
2.2. Исследование крахмальных зерен в микроклубнях трансформированных и контрольных растений 80
2.3. Определение средней площади крахмальных гранул на суспензиях микроклубней 83
3. Влияние трансгенов rolC, rolB и inv на углеводный метаболизм растений картофеля 86
3.1. Гистохимическое определение локализации активности ферментов углеводного метаболизма в стеблях растений картофеля разных генотипов... 86
3.2. Гистохимическое определение локализации активности ферментов углеводного метаболизма в микроклубнях картофеля разных генотипов 93
3.3. Определение активности сахарозосинтазы и инвертазы в экстрактах микроклубней различных генотипов растений картофеля 101
3.4. Содержание моно- и дисахаридов в микроклубнях растений картофеля различных генотипов 108
3.5. Содержание крахмала в микроклубнях растений картофеля различных генотипов 112
4. Содержание цитокининов в микроклубнях контрольных и трансформированных rolC-, rolB- и /wv-генами растений картофеля 115
Обсуждение 119
Заключение 137
Выводы 139
Список цитируемой литературы 142
- Фруктокиназа, УДФ-глюкозопирофосфорилаза и гексокиназа
- Гистохимическое определение локализации активности ферментов углеводного метаболизма in situ
- Исследование крахмальных зерен в микроклубнях трансформированных и контрольных растений
- Определение активности сахарозосинтазы и инвертазы в экстрактах микроклубней различных генотипов растений картофеля
Введение к работе
Картофель принадлежит к числу важнейших сельскохозяйственных культур. Клубни картофеля содержат около 25% сухих веществ (крахмала - 14-22% , белков - 1,4-3%, клетчатки - около 1%, жира - 0, 3% и 0,8-1% зольных веществ), витамины С, В (В], В2, В6), РР и К, а также каротиноиды.
Установлены два центра происхождения возделываемых видов картофеля. Первый центр расположен в тропическом поясе Южной Америки, в горных районах Анд - на высоте 2000-4800 м над уровнем моря - в Боливии и Перу; второй центр расположен в умеренных широтах Чили, на высотах от 0 до 250 м над уровнем моря. В первом поясе возникли сорта основного тетраплоидного подвида Solanum ssp andigena, во втором поясе - сорта тетраплоидного подвида Solanum ssp tuberosum (Чайлахян, 1984).
Из Америки в Европу (Испанию) картофель был ввезен около 1565 года, а из Испании - в другие страны Центральной Европы. В Россию первые растения картофеля были отправлены из Голландии Петром Первым в конце XVII века.
В настоящее время эту культуру возделывают более чем в 70 странах. В плане ежегодного мирового производства картофель занимает четвертое место после пшеницы, риса и кукурузы. Картофель является не только ценной пищевой культурой, но также используется как кормовая и техническая культура.
Клубнеобразование у картофеля представляет собой многоэтапный процесс, включающий образование столонов, индукцию и инициацию формирования клубней, их дальнейший рост и созревание. Все этапы клубнеобразования регулируются целым комплексом различных факторов. Среди них факторы внешней среды, гормональные сигналы и метаболитная (углеводная) регуляция. Все эти факторы влияют не только на количество получаемой продукции и сроки созревания урожая, но и на биохимический состав клубней.
Крахмал - основной запасной метаболит картофельного клубня, он является основным питательным компонентом собираемых органов - клубней. В последние десятилетия резко возросла потребность в крахмале как при производстве специализированных пищевых продуктов, так и в технических целях (Katz, 1991). Это произошло главным образом в результате разработки технологий получения
широко употребляемых напитков с высоким содержанием фруктозы, а также получения био-этанолов (производства этанола). Изучен целый ряд специальных типов крахмала по их пригодности в качестве материала для тех или иных пищевых продуктов и их производства, а также использования при биодеградации (сбраживании). Кроме того, крахмал активно используют в бумажной, текстильной и фармакологической промышленностях, а также при производстве саморазлагающихся упаковочных материалов (биопластмасс). Картофельный крахмал отличается от крахмала злаковых культур по нескольким функционально важным аспектам. В частности, амилоза, составляющая приблизительно 25% картофельного крахмала, имеет более высокую степень полимеризации по сравнению с амилозой из крахмала злаковых. Поэтому картофельный крахмал коммерчески более выгоден для производства биопластмасс (Hofvander et al., 2004). В свете всего вышесказанного, выяснение критических звеньев в углеводном метаболизме картофеля, ведущего к синтезу крахмала, вызывает большой интерес исследователей.
Процесс клубнеобразования исследуется с помощью различных методов, причем в последнее время с этой целью широко используются различные формы трансгенных растений, в частности трансформанты с измененными гормональными и/или углеводными характеристиками. В частности, в лаборатории роста и развития им. М.Х. Чайлахяна ИФР РАН проводятся активные исследования с использованием коллекции трансгенных растений картофеля. Именно эти фундаментальные исследования и послужили исходной базой для данной диссертационной работы
Фруктокиназа, УДФ-глюкозопирофосфорилаза и гексокиназа
Как было отмечено выше, активность СС может регулироваться конечными продуктами реакции по принципу обратной связи (Doehlert, 1987).
Реакции, участвующие в фосфорилировании свободных гексоз, представляют собой потенциально важный сайт регуляции распада углеводов (Kruger, 1990). Гексозы могут поступать в дыхательные циклы, могут запасаться (например, в созревающих фруктах) или могут использоваться в качестве осмотиков (Morgan, 1984). Следовательно, необходимость в фосфорилировании глюкозы и фруктозы варьирует в зависимости от того, какой углевод предстоит утилизировать. Было показано, что любая растительная ткань обычно содержит от трех до пяти различных гексозо-фосфорилирующих ферментов (Turner and Turner, 1980; Kruger, 1990), которые отличаются по кинетическим свойствам. В работе Ренза и др. (Renz et al., 1993а) было проведено разделение гексозо-фосфорилирующих ферментов из растущих «акцепторных» клубней картофеля {Solatium tuberosum, L.). В результате были обнаружены три фермента, метаболизирующие фруктозу и неактивные по отношению к глюкозе; и другие три фермента, активные по отношению к глюкозе, но не к фруктозе (Renz et al., 1993а). Фруктокиназа (ЕС 2.7.1.4) (ФК). Фруктоза является очень сильным ингибитором сахарозосинтазной реакции (Dancer et al., 1990). Для осуществления распада сахарозы с помощью сахарозосинтазы содержание цитозольной фруктозы должно сохраняться низким. Это осуществляется или за счет отложения фруктозы в запас, либо путем ее быстрого превращения. В клубнях картофеля образующаяся в результате действия сахарозосинтазы фруктоза превращается в фруктозо-6-фосфат под действием фермента фруктокиназы. фруктокиназа
Ренз и др. (1993а) обнаружили относительно высокую активность фермента в листьях картофеля и высокую активность фруктокиназы в растущих клубнях, которая соответствовала потребности в этом ферменте во время протекания реакции расщепления сахарозы под действием сахарозосинтазы. Причем, в клубнях растений картофеля присутствовали две формы фруктокиназы, а в листьях обнаруживалась иная форма фермента (Renz et al., 1993а). Апельдорн и др. (Appeldoorn et al., 1997) показали, что активность фруктокиназы в развивающихся клубнях картофеля резко возрастает, начиная с 5-го дня формирования клубня, именно в тот же срок, когда начинает активно работать сахарозосинтаза. Обнаруженная корреляция в работе этих ферментов выявлена и на уровне трапскриптов генов СС и ФК (Appeldoorn et al., 2002). Более того, оба фермента показывают один и тот же низкий уровень экспрессии и активности в апикальной почке и в базальной области перехода клубня в столон (Appeldoorn et al., 2002). Авторы считают, что эти данные, полученные in situ, указывают на существование скоординированного в пространстве и времени контроля работы этих двух ферментов в процессе клубнеобразования (Viola, 1996; Appeldoorn et al., 2002).
УДФ-глюкозопирофосфорилаза (EC 2.7.7.9) (УДФГаза). Второй продукт реакции расщепления сахарозы, катализируемой сахарозосинтазой, - УДФ-глюкоза превращается в глюкозо-1-фосфат в результате действия фермента УДФ-глюкозопирофосфорилазы.
После начала клубнеобразования отмечалось повышение общей активности УДФ-глюкозопирофосфорилазы (и уровня мРНК этого фермента) в три раза, которое авторы объясняют как результат индукции, вызванной общим повышением содержания Сахаров в набухающих верхушках столонов (Sowokinos, 1976; Zrenner et al., 1993). Гистохимический анализ этого фермента in situ показал, что общая активность УДФГазы присутствовала во всех тканях во время развития столонов и клубней; это говорит о том, что фермент не находится под онтогенетическим контролем. Более того, отсутствие явного увеличения ферментативной активности в набухающей субапикальной зоне столона в начале клубнеобразования говорит в пользу той точки зрения, что метаболическое изменение расщепления сахарозы с инвертазного на сахарозосиптазный (Merlo et al., 1993) не требуют изменения активности УДФ-глюкозопирофосфорилазы в запасающих паренхимных тканях во время роста клубня (Appeldoorn et al., 1997; 2002).
Гексокиназа (ЕС 2.7.1.1) (ГК) превращает глюкозу в глюкозо-6-фосфат. По-видимому, работа этого фермента связана с действием инвертазы. Например, было отмечено, что активность этого фермента быстро снижается в клубнях картофеля в первые пять дней их развития, т. е. до того момента, когда клубень начинает активно разрастаться в ширину, а после пятого дня активность гексокипазы снова повышается. Именно в течение первых пяти дней происходит значительное уменьшение активности инвертазы, связанной с клеточными стенками, что свидетельствует о положительной корреляции между двумя этими ферментами (Appeldoorn et al., 1997). Кроме того, гистохимические опыты по определению активности гексокипазы в столонах картофеля показали очень высокую активность этого фермента в апикальной и субапикальной зонах, по сравнению с центральной частью столона, и именно в этих зонах была отмечена высокая активность инвертазы (Appeldoorn et al., 1999). Авторы считают, что специфическая локализация высокой активности обоих ферментов в меристематической области по сравнению с остальной частью столона предполагает наличие функциональной связи с процессом клеточного деления. Аналогичную корреляцию между активностями гексокиназы и инвертазы наблюдали в клубнях в период запасания крахмала (Roitsch et al., 1995; Claassens and Vreugdenhil, 2000). Повышение активности гексокиназы в клубнях можно объяснить высокой потребностью в фосфорилированной глюкозе в процессе накопления крахмала (Appeldoorn et al., 1997). В хранящихся клубнях активность гексокиназ возрастала, что коррелировало с уменьшением активности сахарозосинтазы (Pressy, 1969; Geigenberger and Stitt, 1993) и увеличением активности инвертазы (Pressy and Shaw, 1966). Существуют данные, которые указывают на то, что в клубнях одновременно идет синтез и расщепление крахмала (Geigenberger et al., 1994; Neuhaus et al., 1995).
Один из расщепляющих крахмал ферментов, амилаза, освобождает глюкозу, а повторный синтез крахмала из этой глюкозы требует активной работы гексокиназы (Appeldoorn et al., 1997). Гексокиназа не только фосфорилирует глюкозу (Renz and Stitt, 19936), но, как описано в литературе, может играть важную сигнальную роль в процессе распознавания Сахаров, ведущего к изменению экспрессии регулируемых сахарами генов (Gancedo, 1992; Jang and Sheen, 1994; Jang et al., 1997). Возможный механизм согласованного действия инвертазы клеточных стенок и гексокиназы в распознавании Сахаров состоит в метаболической сигнализации притока глюкозы из апопласта через ступень фосфорилирования (Gancedo, 1992). Это приводит к транскрипционной (и/или трансляционной) активации генов, участвующих в процессе клеточного деления (Roitsch et al., 1995).
Гистохимическое определение локализации активности ферментов углеводного метаболизма in situ
Крахмал-разветвляющие ферменты. Крахмал-разветвляющие ферменты (а-1,4-глюкан: а-1,4-глюкан-6-гликозилтрансфераза, ЕС 2.4.1.18) (КРФ) катализируют образование о 1,6-глюкановых связей. Реакция включает гидролиз а-1,4-связи, за чем следует присоединение высвободившейся 1,4-глюкановой цепи к оставшейся или к другой 1,4-глюкановой цепи посредством 1,6-связи (Fisher et al., 1996). Тот факт, что клубни картофеля содержат множественные изоформы КРФ (Burton et al., 1995; Martin and Smith, 1995; Smith et al., 1995), говорит о возможности того, что разные формы фермента создают или цепи различной длины, или точки ветвления с различной частотой (Smith et al., 1997). На основе различий в аминокислотной последовательности все изученные изоформы КРФ можно отнести к одному из двух классов (называемых А и В), хотя есть возможность того, что в некоторых органах существуют и другие типы изоформ (Fisher et al., 1996; Sun et al., 1996). По-видимому, КРФ-активность обусловлена как А-, так и В-изоформами (Larsson et al., 1996). Значительное снижение активности В-изоформы КРФ в клубне картофеля за счет экспрессии антисмысловой РНК оказывает лишь незначительный эффект на структуру амилопектина (Flipse et al., 1996). В настоящее время полученные данные не дают оснований считать, что изоформы А и В играют определенную и существенную роль в создании кластерной структуры амилопектина (Smith et al., 1997).
Роль деветвящих ферментов (ДВФ). Болл и др. предложили модель образования и организации амилопектиновых кластеров на периферии растущей гранулы крахмала, в которой ДВФ является существенным компонентом (Ball et al., 1996). Растворимая крахмалсинтаза удлиняет очень короткие цепи на периферии гранулы. Изначально эти цепи недостаточно длинные, чтобы служить субстратом для КРФ, и они остаются неразветвлепными. Когда они достигают достаточной длины, с помощью крахмалсинтазы и КРФ образуются ветви. ДВФ удаляет внешние ветви с этого неупорядоченного глюкана, созданного крахмалсинтазой и КРФ, но не имеет доступа к точкам ветвления, сформированным вблизи упорядоченной, закрученной двойной спиралыо зоны (Ball et al., 1996).
В ряде работ было исследовано влияние некоторых воздействий, приводящих к изменению размера крахмальных гранул. Было показано, что активность АДФ-глюкозопирофосфорилазы может влиять на свойства крахмала. В крахмале, изолированном из клубней картофеля (Solarium tuberosum L.), содержащего пониженное количество фермента, было обнаружено, что содержание амилозы сильно снизилось. При этом амилопектин трансгенных растений содержал большее количество относительно более коротких цепей, чем у контрольных растений, и размер крахмальных зерен был меньше. Трансгенные растения содержали большее количество связанной с крахмальными зернами крахмалсинтазы, что приводило к возрастанию максимальной активности фермента на единицу исследованного крахмала (Lloyd et al., 1999).
В клубнях картофеля с измененной экспрессией гена АТФ/АДФ-переносчика, локализованного в мембране амилопласта, было отмечено изменение соотношения амилоза/амилопектин: в клубнях «смысловых» растений оно было увеличено, а в «антисмысловых» - снижено (Tjaden et al., 1998; Geigenberger et al., 2001). Изменение транспорта АТФ в амилопласты картофеля также повлияло на форму клубней (Tjaden et al., 1998) и на морфологию гранул - клубни с редуцированной активностью АТФ/АДФ-переносчика содержали крахмальные зерна гораздо меньшего диаметра, но в большем количестве в пересчете на клетку (Geigenberger et al., 2001).
Крахмальные гранулы имели меньшие размеры в клубнях растений картофеля со сниженной активностью обеих форм крахмал-разветвляющих ферментов, по сравнению с гранулами контрольных линий (Hofvander et al., 2004). Кроме того, было установлено, что введение гена дрожжевой инвертазы в амилопласты клубней картофеля приводит к формированию более мелких гранул треугольной формы (Gerrits et al., 2001).
Из приведенных выше литературных источников следует, что в настоящее время большой интерес исследователей вызывают биогенетические механизмы синтеза крахмала у растений картофеля, выяснение критических звеньев этого процесса, а также механизмы, определяющие формирование гранул крахмала, их структуру и размеры. Одним из инструментов, позволяющих изучать углеводный метаболизм, в том числе процессы распада сахарозы и дальнейшего превращения продуктов ее расщепления вплоть до биосинтеза крахмала и формирования крахмальных гранул, а также регуляцию этих процессов, является использование трансгенных растений с измененными биохимическими характеристиками.
В последние десятилетия получены многочисленные и разнообразные трансформанты, которые успешно применяются для решения различных задач как фундаментальной, так и прикладной биологии. В частности, применение трансгенных растений позволяет исследовать взаимосвязь гормональной и углеводной регуляции клубнеобразования. Одним из подходов к исследованию взаимозависимости гормональной и углеводной регуляции клубнеобразования является использование трансгенных форм картофеля, особенно с измененным метаболизмом фитогормонов и/или углеводов. Наиболее распространенным способом введения генетической информации является агробактериальная трансформация.
Род Agrobacterium - почвенные бактерии, являются представителями семейства Rhizobiaceae и включают пять групп: A. radiobacter не является вирулентным; А.гиЫ вызывает опухоли на стеблях (стеблевые галлы) черной смородины (Rubus sp., Rosaceae); A. tumefaciens способны вызывать два вида опухолей, тератогенную и недифференцированную опухоли. Обычно эти опухоли возникают в месте соединения стебля и корня («корончатые галлы»), иногда они могут возникать на корнях растения (Gaudin et al., 1994; Лутова и др., 2000). Бактерии вида A. rhizogenes индуцируют «бородатый корень» (в месте поражения неожиданно возникает пролиферация корней), «опушенный узел» (из недифференцированного каллуса формируются корешки), а также возможно формирование опухолей без развития корней (Riker, 1930; De Cleene and De Ley, 1981 цитирую no Gaudin et al., 1994). Чтобы включить все штаммы биотипа III, которые вызывают корончатый галл у винограда европейского (Vitis vinifere), в 1990 году были выделены в отдельный род Agrobacterium vitis (Ophel and Kerr, 1990 цитирую no Gaudin et al., 1994).
С практической точки зрения наибольший интерес исследователей вызывают два вида бактерий рода Agrobacterium - A. rhizogenes и A. tumefaciens. Это связано в тем, что векторы, созданные на основе плазмид из A. rhizogenes и A. tumefaciens, являются естественными векторами, которые обеспечивают перенос и включение в геном растительных клеток протяженных фрагментов экзогенной ДНК (Романов, 2000; Лугова и др., 2000).
Исследование крахмальных зерен в микроклубнях трансформированных и контрольных растений
Как показали наши исследования, активность гексокиназы была достаточно высокой в стеблях растений всех изученных вариантов. Особенно интенсивно окрашивались проводящие ткани стебля, что говорит о наиболее высокой активности гексокиназы именно в этих тканях рис. 12 (a-d).
Как и в случае гексокиназы, активность фруктокиназы (рис. 12 e-g) в стеблях растений исследуемых генотипов достаточно высока, в том числе в стеблях нетрансформированного контроля, в стеблях растений B33::inv и в стеблях растений ВЗЗ::го/С.
В отличие от гексокиназы и фруктокиназы активность сахарозосинтазы (рис.12 h-i) в стеблях растений картофеля была очень низкой или отсутствовала совсем. Из литературных источников известно, что сахарозосинтаза - фермент, который, как правило, не функционирует в органах, растущих в длину, в нашем случае - в стеблях, но активен в запасающих органах, в частности в клубнях картофеля (Appeldoorn et al., 1997). Таким образом, полученные нами результаты соответствовали ранее сделанным наблюдениям.
Интересные результаты были получены при определении локализации активности инвертазы в стеблях (рис. 12 j-n). На рис. 12 (j-n) представлен паттерн активности инвертазы в стеблях нетрансформированного контроля, стеблях растений, содержащих ген дрожжевой инвертазы и в стеблях растений, трансформированных геном rolC.
Как видно на рис. 12, активность инвертазы в стеблях растений с разными генотипами неодинакова.
Самая низкая активность инвертазы была отмечена в стебляхнетрансформированного контроля. На рис. 12 (к) показан срез апикальной верхушки стебля нетрансформированного растения картофеля, а на рис. 12 (1) срез, полученный с нижерасположенного участка того же стебля. Из рис. 12 (к и 1) видно, что активность инвертазы в апикальной верхушке выше активности этого фермента в ниже расположенных участках стебля. Из литературных данных (Appeldoorn et al., 1997, 2002) известно, что в стеблях растений инвертаза присутствует в активной форме, но ее активность невысока и наибольшая активность инвертазы отмечается в апикальной части стебля растений. В стеблях растений с генотипом B33::mv активность инвертазы была значительно выше (рис. 12т), чем в стеблях нетрансформированного контроля.
Несмотря на то, что ген дрожжевой инвертазы был введен в растение под контролем клубнеспецифичного пататинового промотора, который преимущественно экспрессируется в клубне, активность инвертазы увеличивалась также и в стебле. Это, по-видимому, объясняется тем, что при достаточно высоком содержании сахарозы в культуралыюй среде, контролируемые ВЗЗ-промотором гены могут экспрессироваться и в других органах растений, в том числе в стебле (Rocha-Sosa et al., 1989; Крылова и др., 2003; Дерябин и др., 2003).
Интересно, что в стеблях растений с введенным геном rolC активность инвертазы также оказалась выше, чем в стеблях нетрансформированного контроля (рис. 12 п).
Таким образом, гистохимический метод локализации активности ферментов показал, что в стеблях растений картофеля всех исследуемых вариантов присутствуют активные формы гексокиназы и фруктокиназы. Особенно высокая активность этих ферментов была отмечена в проводящих тканях. При этом не наблюдалось резких различий в активности гексокиназы или фруктокиназы у всех испытанных вариантов. Активность сахарозосинтазы в стеблях изучаемых вариантов была очень незначительной. Активность инвертазы была сравнительно высокой у всех изученных вариантов, особенно у B33::/wv растений (что можно объяснить частичной экспрессией введенного гена inv), а также в стеблях растений с генотипом ВЗЗ::го1С. 3.2. Гистохимическое определение локализации активности ферментов углеводного метаболизма в микроклубнях картофеля разных генотипов
Аналогично стеблям активность ферментов углеводного метаболизма выявляли гистохимически на срезах микроклубней. С помощью гистохимического анализа мы обнаружили, что в микроклубнях картофеля 1-й 4-неделыюго возраста присутствуют фруктокиназа и гексокиназа в активной форме. Достоверных различий в активности этих ферментов в зависимости от возраста клубней не выявлено.
На рис. 13 (a-j) представлена активность гексокиназы и фруктокиназы на срезах 7-дневных микроклубней. Как видно из рис. 13 (a-f), гексокиназа в активной форме присутствовала в клубнях всех изученных генотипов, однако, поскольку интенсивность окрашивания была невысока, можно заключить, что активность фермента была достаточно низкой. Активность гексокиназы была более выражена в проводящих пучках и менее - в паренхимных тканях клубня. Значительных отличий в активности гексокиназы между апикальной и нижележащей частью клубня не выявлено. На рис. 13 (g-j) видно, что в клубнях растений всех исследуемых вариантов присутствовала фруктокиназа в активной форме. Рис. 13 (g-j) демонстрирует активность фруктокиназы в паренхимных тканях клубня и в проводящих пучках. При этом в проводящих тканях активность фермента была особенно высокой. На рис. 13 (h) показана апикальная часть клубня; из этого рисунка видно, что в апикальной части активность фруктокиназы была выше, чем в средней части клубня (ср. с рис. 13 g, і, j). Локализация гексокиназы и фруктокиназы на срезах, полученных с одного и того же клубня, позволила сравнить относительные активности этих ферментов по интенсивности окрашивания. Исходя из интенсивности окрашивания (визуальное наблюдение), активность фруктокиназы была значительно выше активности гексокиназы как в клубнях нетрансформированного контроля, так и в клубнях трансформированных растений.
Определение активности сахарозосинтазы и инвертазы в экстрактах микроклубней различных генотипов растений картофеля
Из литературных данных (Appeldoorn et al., 1997, 2002) было известно, что в формирующихся клубнях растений картофеля дикого типа инвертаза присутствует только в апикальной почке клубня и в его столоноподобной нижней части.
В нашем случае, действительно, в клубнях нетрансформированного и трансформированного контрольных растений была обнаружена активность фермента только в апикальной почке и в базальной части (место прикрепления клубня к столону, см. далее) и не обнаружена в срединной части клубня как в клетках паренхимы, так и в проводящих пучках (рис. 15Ь).
На рис. 15с представлен срез, полученный с 4-х недельного клубня нетрансформированного контроля. На срезе видно, что активность инвертазы очень высока в столонной «ножке» клубня и очень незначительна в базальной части собственно клубня, то есть в том месте, где клубень прикрепляется к столону.
Таким образом, наши данные по локализации активности инвертазы и сахарозосинтазы в клубнях контрольных растений картофеля Дезире соответствуют результатам, полученным ранее на микроклубнях картофеля сорта Бинджи (Appeldorn et al., 2002). В обоих случаях в развивающихся клубнях активность инвертазы присутствовала лишь в апикальной и базальной частях, тогда как активность сахарозосинтазы была локализована в срединной части клубня: как в клетках паренхимы, так и в проводящих пучках.
У трансформированных растений с введенным геном inv, а именно B33::mv и B33::inv+rolC, инвертазная активность была очень высока, как в 1-недельных (рис. 15f, 15h), так и в 4-недельных микроклубнях (рис. 15g, 15i).
Высокая активность инвертазы в микроклубнях mv-растений и двойного трансформанта с inv+ rolC генами является ожидаемой, т. к. при трансформации в эти растения был введен ген дрожжевой инвертазы с клубнеспецифичным пататиновым промотором ВЗЗ, что обеспечивало экспрессию инвертазы именно в этом органе. Надо отметить, что дрожжевая инвертаза скорее всего имеет апопластную локализацию, т. к. трансформирующий ген инвертазы был дополнен последовательностью для сигнального пептида (ингибитора протеиназы II), направляющего белки в апопласт (Heineke et al., 1992).
При определении активности инвертазы у rolC- трансформантов найдено, что фермент локализуется в клубнях разного возраста (как 1-, так и 4-недельных), при этом высокая активность инвертазы обнаружена у всех изученных линий с го/С-геном (линии 4ь42і и 444) (рис. 15j-m).
По интенсивности окрашивания можно заключить, что активность инвертазы в клубнях растений линии 444 была достаточно высока, но ниже, чем в клубнях других ro/C-растений (линии А\ и 420 (ср. рис. 15т и рис. 15J-1).
Из рис. 15 (j-m) видно, что активность фермента присутствовала у всех линий с rolC не только в базальной части клубня, как это было в случае нетрансформированного контроля (рис. 15с), но и проявлялась и в средней части клубня, главным образом в области проводящих пучков.
Обнаружение активности инвертазы в средней части клубней растений, содержащих ген rolC, было достаточно неожиданным, поскольку в клубнях контрольных растений инвертаза не функционирует и активна лишь в апикальной почке и «столонной» части клубня (см. выше). Таким образом, в клубнях rolC-растений, а именно в их срединной крахмал-образующей части, «работают» оба фермента, расщепляющих сахарозу: сахарозосинтаза и инвертаза.
Поскольку активная инвертаза в срединной части клубней растений с введенным геном rolC присутствовала у всех трех независимо полученных линий с генотипом ВЗЗ::го/С, эти данные вряд ли можно считать результатом случайного изменения генетического материала вследствие встраивания чужеродного гена в процессе трансформации в тот или иной участок хромосомы, различный у разных линий. По всей видимости, наличие активности инвертазы в срединной части клубней го/С-растений - это опосредованный результат экспрессии самого трансгена.
В средней части клубней ro/5-растений мы не обнаружили инвертазной активности; активность фермента в этом случае была локализована, так же как в микроклубнях растений нетрансформированного контроля, в апикальной почке и «столонной» части клубня (рис. 15п).
Поскольку известно, что ключевым ферментом синтеза глюканов (происходящего в амилопластах), из которых в последствии формируются крахмальные гранулы, является АДФ-глюкозопирофосфорилаза, представлялось важным локализовать активность этого фермента в микро клубнях трансформированных и контрольных растений. Определение АДФ-глюкозопирофосфорилазы проводили на 1-недельных микроклубнях в период интенсивного роста и отложения крахмала.
Как видно на рис. 16, у всех изученных вариантов активность фермента была очень высока в разных частях клубней (апикальной, срединной, базальной) и в различных тканях клубня (клетки паренхимы, проводящие пучки). Но видимой, значительной разницы в активности фермента в клубнях трансформированных и нетрансформированных растений обнаружено не было. Как известно из литературных данных (Appeldorn et al., 1999), полученных на клубнях нетрансформированных растений картофеля, АДФ-глюкозопирофосфорилаза наиболее активна в течение первых десяти дней роста клубня in vitro, когда происходит активный синтез и запасание крахмала.
Таким образом, применение гистохимической методики определения локализации ферментов позволило сделать следующие обобщения. В микроклубнях картофеля всех исследуемых линий, как контрольных растений, так и трансформантов, обнаружены активные формы гексокиназы и фруктокиназы. При этом, у всех вариантов активность фруктокиназы в микроклубнях разного возраста была выше, чем активность гексокиназы. Активность сахарозосинтазы, очень высокая в 1-недельных микроклубнях у всех вариантов, снижалась в клубнях 4-недельного возраста, сохраняясь в наибольшей степени в проводящих тканях. В клубнях контрольных растений и растений с геном rolB инвертазная активность была очень низкой и локализована только в апикальных верхушках и базальных частях клубней. Как и ожидалось, очень высокую активность инвертазы наблюдали в микроклубнях растений, экспрессирующих трансген дрожжевой инвертазы. Заметная активность инвертазы обнаружена в клубнях rolC-трансформантов, с локализацией в том числе в срединной части клубней. Активность АДФ-глюкозопирофосфорилазы была высокой в клубнях 1-недельного возраста у всех исследуемых вариантов.
