Введение к работе
Актуальность темы
Патогенез ВИЧ-инфекции состоит из различных процессов (Cohen O., et. al., 1997), среди которых ведущая роль принадлежит расстройствам функциональных возможностей иммунной системы, включая ее клеточное звено – Т- и В-лимфоциты (Т-Лф и В-Лф), антиген-презентирующие клетки (АПК) и др.(Espert L., et al., 2008)
У ВИЧ-инфицированных лиц на всех стадиях заболевания выявляются признаки хронической активации иммунной системы и нарушения, связанные с продукцией и секрецией цитокинов (Diamond D.C. et al., 1988; Biggs B.A. et al., 1995; Kedzierska K. et al., 2001; Fanales-Belasio Е., 2010; ., 2010). В частности, происходит «переключение» работы от Т-хелперов первого типа (T-helper 1, Th1), связанное со сниженным образованием интерлейкина-2 (ИЛ-2) и интерферона-гамма (ИФН-), на Th2, а именно увеличение секреции ИЛ-4, ИЛ-10, а также повышение продукции провоспалительных цитокинов – ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, и фактора некроза опухолей-альфа (ФНО-), что в свою очередь индуцирует репликацию ВИЧ-1 и, главным образом, экспрессию вируса посредством взаимодействия NF-kB с длинным терминальным повтором (LTR, long terminal repeat). Такая «нефизиологическая» продукция цитокинов нарушает клеточный иммунный ответ (Kedzierska K., et al., 2001).
Способность иммунокомпетентных клеток продуцировать вирус зависит от уровня Т-лимфоцитарной активности и стадии моноцитарно-макрофагальной дифференцировки (Zack J., et al., 1990; Sonza S. et al., 1996). Известно, что эффективная репликация вируса происходит в активированных CD4+Т-Лф (Korin Y.D., et al., 1998; Бойчук С.В., Мустафин И.Г., 2004). Одна из ключевых ролей в процессах активации и пролиферации Т-Лф in vivo отводится цитокинам (Granucci F., et al., 2001, 2003).
Наряду с «дисбалансом» цитокинов, ведущим звеном в патогенезе ВИЧ-инфекции является гибель CD4+Т-Лф. Результаты исследований последних лет свидетельствуют о том, что большинство CD4+Т-Лф, подвергающихся апоптозу в периферической крови и лимфатических узлах у ВИЧ-1 инфицированных пациентов, являются неинфицированными клетками окружения (Cossarizza A., 2008; Espert L., et al., 2008; ., 2010; Lenassi M., et al., 2010). Запрограммированная гибель этих неинфицированных Т-Лф окружения получила название «эффекта байстэндер». Механизмы снижения абсолютного количества CD4+Т-Лф остаются дискуссионными до настоящего времени. Это может быть обусловлено способностью вирусного белка Nef оказывать влияние на апотоз инфицированных и неинцицированных вирусом иммунокомпетентных клеток. В частности, имеется значительное количество исследований, которые указывают на участие ВИЧ-1 белка Nef в реализации «эффекта байстэндер» (Finkel T.H., et al., 1995; Katsikis P.D., et al., 1995; Muro-Cacho C.A., et al., 1995; Badley A.D., et al., 1998; Jekle А., et al., 2003; Yue F.Y., et al., 2005; Cossarizza A., 2008; Espert L., et al., 2008; Lenassi M., et al., 2010).
Белок Nef первоначально был назван «негативным регуляторным фактором», так как имелись сведения его отрицательного влияния на вирусную репликацию путем подавления транскрипции от LTR (Ahmad N., Venkatesan S., 1988). Однако появление данных о том, что Nef необходим для поддержания высокой вирусной нагрузки у инфицированных вирусом иммунодефицита обезьян (ВИО) макак (Kestler 3rd H.W. et al., 1991), дало основание предположить, что этот белок положительно влияет на репликацию вируса иммунодефицита человека.
В настоящее время известно, что основные функции вирусного белка Nef направлены на эффективную вирусную репликацию (Federico М., 2008), обеспечение инвазивности ВИЧ-1 (Stewart S.A., et al., 2000; Geyer M., et al., 2001; Greene W.C., Peterlin B.M., 2002), а также поддержание жизнеспособности инфицированных Лф (Collins K.L., et al., 1998; Yokoyama W.M., 1998; Geleziunas R., et al., 2001; Blagoveshenskaya A.D., et al., 2002; James C.O., et al., 2004; Lindwasser O.W., et al., 2007; ., 2010).
Таким образом, в данном исследовании была предпринята попытка изучить влияние ВИЧ-1 белка Nef на репликацию ВИЧ-1 и процесс апоптоза Лф в условиях цитокин-опосредованной активации клеток.
Цель и задачи исследования
Целью исследования явилось изучение роли ВИЧ-1 белка Nef в цитокин-индуцированной репликации вируса, активации и регуляции апоптоза лимфоцитов при ВИЧ-инфекции.
В соответствии с данной целью были поставлены следующие задачи:
1. Изучить способность ВИЧ-1 белка Nef влиять на цитокин-индуцированную репликацию вируса.
2. Исследовать влияние Nef на активацию инфицированных Лф в присутствии цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ФНО-).
3. Определить наличие или отсутствие зависимости между активацией инфицированных ВИЧ-1 (Nef+) и ВИЧ-1nef (Nef-) Лф и репликацией вируса.
4. Изучить роль белка Nef в апоптозе лимфоцитов.
Научная новизна
Научная новизна работы состоит в том, что впервые исследовались свойства ВИЧ-1 белка Nef по его влиянию на репликацию вируса и апоптоз Лф в условиях цитокин-индуцированной активации клеток.
Впервые показано, что для высоких уровней репликации ВИЧ-1 in vitro в присутствии цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ФНО-), и, предположительно высоких вирусных нагрузок in vivo, необходимо наличие в структуре вируса белка Nef.
Научно-практическая ценность
Создание in vitro уникальной модели, отражающей основные этапы развития ВИЧ-инфекции в организме больного (в присутствии таких цитокинов, как ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ФНО-), необходимо для более детального изучения и понимания звеньев патогенеза ВИЧ-инфекции in vivo. Изучение способности вирусного белка Nef обеспечивать защиту от гибели продуктивно инфицированных Лф и напротив, индуцировать апоптоз неинфицированных («байстендер») клеток в присутствии цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ФНО-), впервые позволило оценить значимость совместного участия цитокинов и данного белка в патогенезе ВИЧ-инфекции in vitro.
Полученные данные могут стать основой для последующих исследований и разработок более эффективных путей элиминации ВИЧ-1 из организма пациента, а также создания новых средств терапии ВИЧ-инфекции и СПИДа.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
1. Способность ВИЧ-1 белка Nef усиливать репликацию вируса в лимфоцитах обусловлена их преактивацией цитокинами, в первую очередь, ИЛ-7 и ИЛ-2, затем по убыванию ИЛ-4 и ФНО-.
2. ВИЧ-1 белок Nef поддерживает жизнеспособность продуктивно инфицированных лимфоцитов (клеток с активной вирусной репликацией) в наибольшей степени в условиях преактивации клеток ИЛ-2 и ИЛ-7 в то же время, индуцируя гибель неинфицированной популяции лимфоцитов по механизму апоптоза в присутствии цитокинов – в первую очередь, ФНО-, затем ИЛ-4, ИЛ-7, ИЛ-2.
Личный вклад диссертанта
Автором была выбрана тема, составлена программа, определены этапы диссертационной работы, проведен анализ научной литературы по изучаемой проблеме, выполнены экспериментальные исследования по влиянию ВИЧ-1 белка Nef на процессы активации, апоптоза лимфоцитов, роли данного белка в репликации ВИЧ-1. Автором выполнена статистическая обработка, группировка, анализ результатов, интерпретация полученных данных.
Достоверность полученных данных
Достоверность полученных результатов достигалась путем проведения достаточного количества экспериментов. Статистическая обработка данных осуществлялась с помощью программ Microsoft Excel для Windows 2003 и BIOSTATISTICA (S. A. Glantz, McGraw Hill). Результаты анализировались с использованием параметрических и непараметрических критериев. Уровень статистической значимости (р) считали < 0,05. Корреляционный анализ производился с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена (r).
Сведения об апробации результатов диссертации
Материалы диссертации доложены и обсуждены на: научно-практических конференциях молодых ученых Казанского государственного медицинского университета (2008, 2009, 2010 гг.), Х международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», посвященном 100-летию со дня рождения академика АМН А.Д. Адо (Казань, 2009г.), Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 85-летию создания кафедры инфекционных болезней КГМУ, «Актуальные вопросы инфектологии» (Казань,2010г.), совместном заседании кафедр патофизиологии, клинической иммунологии с аллергологией ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет Росздрава», аллергологии и иммунологии ГОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия Росздрава», сотрудников Республиканского центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями МЗ РТ (Казань, 2010 г.).
Публикации материалов исследования
Результаты диссертационного исследования отражены в 13 научных работах, в том числе 2 статьях в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией. Общий объем публикаций – 2,0 у.п.л., в том числе авторское участие – 1,2 у.п.л.
Внедрение результатов работы
Материалы диссертации используются в учебном процессе кафедры патофизиологии (для преподавания раздела «Иммунодефициты. Особенности врожденного и адаптивного иммунитета»), кафедры клинической иммунологии с аллергологией (для преподавания раздела «Молекулярные и клеточные основы адаптивного иммунитета») ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет Росздрава», а также в лаборатории иммунологии для культивирования клеточных культурх и инфицирования их ВИЧ-1 (Nef+) и ВИЧ-1 nef (Nef-) штаммами по разработанной методике.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов), выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего 236 источников, из которых 223 зарубежных авторов. Работа изложена на 144 страницах машинописного текста, иллюстрирована 23 таблицами и 35 рисунками.
![Клинико-эпидемиологическая характеристика ВИЧ-инфекции и поведенческих реакций у ВИЧ-инфицированных в Новгородской обл. [Электронный ресурс]](/i/i/4301/189413.png "Клинико-эпидемиологическая характеристика ВИЧ-инфекции и поведенческих реакций у ВИЧ-инфицированных в Новгородской обл. [Электронный ресурс] Ткаченко Татьяна Николаевна")
