Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ
Многочисленные исследования, посвященные процессу профамированной клеточной гибели (апоптозу), показали важную роль апоптоза в физиологических и патологических процессах организма (Kerr J.F.R., 1972; Ярилин А.А., 1997; Jacobson M.D., 1997) . Апоптозу принадлежит ведущая роль в поддержании гомеостаза организма. В наиболее общей форме назначение апоптоза состоит в поддержании постоянства численности клеток, их соотношения и удалении генетически дефектных клеток (Ярилин А.А., 1998).
Вместе с тем следует выделить и патологическую роль апоптоза, проявляющуюся нарушениями механизмов регуляции процессов профаммируемой клеточной гибели (ГПСГ), что может быть одним из главных звеньев патогенеза различных заболеваний. В частности, повышенная активация ГПСГ является одним из звеньев нейродегенеративных (LaFerla F.M., 1995) и миелодиспластических заболеваний, ишемических повреждений различных органов (Saikumar Р., 1998) и других патологических состояний. Напротив, ингибирование процессов ГПСГ наблюдается при опухолевых процессах (Levine A. J., 1994; Frassantino М.А., 1998), аутоиммунных (Kaneko Н., 1996; Никонова М.Ф., 1997). Данное положение можно отнести и к ряду вирусных заболеваний, сопровождающихся нарушениями регуляции клеточной гибели. При этом отмечается как повышение апоптоза (цитомегаловирусная инфекция), так и его ингибирование (вирус герпеса, бакуловирус, вирус Эпстайн-Барр) (Jerome К. R., 1998; Yang Y.L., 2000; Benetti L., 2004).
Ведущим звеном патогенеза ВИЧ-инфекции является развитие вторичного иммунодефицита вследствие развития дисфункции и уменьшения количества СВ4+Т-лимфоцитов (С04+Т-Лф) (Fauci A.S., 1988; Levy J.А., 1993; Mellors J., 1996; Badley A.D., 2000). Инфицированию ВИЧ-1 также подвержены макрофаги, гистиоциты, дендритные клетки.
Несмотря на то что выявлено несколько причин уменьшения числа СБ4+Т-Лф при ВИЧ-инфекции, ведущим фактором, обуславливающим снижение абсолютного числа CD4+T-JT4>, безусловно, является их гибель по механизму апоптоза (Badley A.D., 2000). Многочисленные механизмы, вносящие свой вклад в ВИЧ-ассоциированный апоптоз лимфоцитов, включают хроническую иммунологическую активацию; gpl20/160-связывание CD4-peuenTopa; усиленную продукцию моноцитами, макрофагами, В-клетками и С08+Т-клетками ВИЧ-инфицированных пациентов цитотоксических лигандов или вирусных белков, убивающих неинфицированные CD4+T-ioienai.
Механизмы апоптоза инфицированных ВИЧ-1 и неинфицированных С04+Т-Лф остаются до "тип»у "Г""«" дигду/уигдт^'" с одной
I *С НАЦИОНАЛЬНАЯ
I БИБЛИОТЕКА I
стороны, логичными выглядят результаты исследований, иллюстрирующих ослабление программы апоптоза в инфицированных ВИЧ-1 С04+Т-Лф и клеточных линиях, что в свою очередь, является необходимым фактором, обеспечивающим создание резервуаров для репликации ВИЧ-1 и предпосылок для усиления репликации вируса (Antoni В., 1995; Rapaport Е., 1998). С другой стороны, имеются также многочисленные данные об усилении гибели CD4+T-Jk}), а также различных клеточных линий, инфицированных ВИЧ-1 (Noraz N., 1997; Herbein G., 1998; Gandhi R., 1998). Данное противоречие может быть лишь отчасти объяснено различиями в используемых для инфицирования лабораторных штаммах ВИЧ-1 (Rapaport Е., 1998).
Наличие на клеточной поверхности Fas-рецепторов (CD95, АРО-1), определяющих способность клеток к восприятию апоптогенных стимулов и приводящих к гибели клетки по механизму апоптоза, признается рядом исследователей ведущим механизмом апоптоза лимфоцитов при ВИЧ-инфекции. Т-клетки ВИЧ-инфицированных пациентов проявляют как увеличенную экспрессию рецептора Fas, так и повышенную восприимчивость к Fas-опосредованной смерти (Katsikis P.D.,1995, McCloskey T.W., 1998). В мононуклеарных клетках (содержащих моноциты) периферической крови ВИЧ-инфицированных пациентов повышен FasL (Silvertris F., 1998), а также уровень растворимого FasL, который коррелирует с содержанием РНК ВИЧ-1 (Hosaka N.,1998). Эти данные заставляет предположить, что экспрессия Fas-рецептора и Fas-лиганда могут быть важны для некоторых форм ВИЧ-индуцированной клеточной смерти.
Тем не менее, экспрессия Fas рецептора является не единственным признаком, определяющим подверженность клеток апоптозу. Например, у больных ВИЧ-инфекцией также установлена выраженная экспрессия Fas-рецептора на поверхности CDS+T-Лф, что является следствием их активации. Между тем на ранних стадиях заболевания СБв+Т-лимфоциты устойчивы к апоптотической гибели. Механизмы устойчивости С08+Т-Лф к апоптозу остаются до конца не изученными.
Литературные данные свидетельствуют о том, что Т-Лф ВИЧ-инфицированных пациентов в большей степени подвергаются спонтанному апоптозу, чем Лф доноров (Katsikis P.D., 1995). Более того, активация СР4+Т-Лф ВИЧ инфицированных пациентов ex vivo (с помощью различных стимулов) постоянно усиливает апоптоз в отличие от клеток неинфицированных людей (Ledru' Е., 1998). Этот феномен, названный индуцированная активацией смерть клеток (activation-induced cell death (AICD)), происходит только в предварительно активированных клетках (Brunner Т., 1995) и может представлять собой модель для изучения последствий антигенной стимуляции in vitro (Yang Y., 1995). Покоящиеся Т-Лф периферической крови доноров после стимуляции через TCR
подвергаются пролиферации, секретируют цитокины (Nau G.J., 1988), и проявляют склонность к гибели по механизму Fas-опосредованного апоптоза (Alderson M.R., 1995).
Одним из потенциальных факторов, индуцирующих апоптоз Лф при различных патологических состояниях, в том числе, при ВИЧ-инфекции, может являться микровезикуляция. Данное предположение основано на данных, демонстрирующих повышенное количество микровезикул при программированной клеточной гибели различных типов клеток. Установлено, что микровезикулы (MB) являются фрагментами клеточных мембран, отделяемых от клеточной поверхности при активации и апоптозе (Martin S.J., 1995; Freyssinet J-M., 2003). Возможность индукции апоптоза Лф микровезикулами, содержащими вирусные частицы, привлекает внимание многих исследователей (Aupeix К., 1997; Bess J.W., 1997). Показано, что MB, содержащие на своей поверхности FasL, способны вызывать апоптоз различных клеток-мишеней (Jodo S., 2001; Andreola G., 2002), Тем не менее, некоторые авторы ставят под сомнение возможность индукции апоптоза растворимыми формами FasL (Suda Т., 1997). Кроме того, установлена возможность переноса микровезикулами тромбоцитарного и мегакариоцитрного происхождения хемокиновых рецепторов CXCR4 на поверхность негативных по данным рецепторам клеток. Этот факт может обуславливать их восприимчивость к инфицированию СХС114-тропным штаммом ВИЧ-1 (Rozmyslowicz Т., 2003).
Известно, что применение современных антиретровирусных препаратов способно подавлять репликацию ВИЧ-1, а также влиять на процессы апоптоза Лф в лимфоидной ткани и периферическом русле. Тем не менее, воздействие препаратов на резервуары ВИЧ-1 и индукцию апоптоза латентно инфицированных клеток существенно ограничено и неэффективно. Следовательно, понимание механизмов регуляции апоптоза может явиться предпосылкой для создания новых и перспективных методов терапии ВИЧ-инфекции и синдрома приобретенного иммунодефицита.
Исходя из этого, предпринято настоящее исследование, в котором были поставлены следующие цели и задачи.
Цель исследования:
Изучение механизмов апоптоза лимфоцитов у больных ВИЧ-инфекцией и их взаимосвязи с процессами активации лимфоцитов и репликации ВИЧ-1.
Задачи исследования:
-
Изучить последовательность и взаимосвязь событий спонтанного, индуцированного и активационного апоптоза лимфоцитов периферической крови доноров и больных ВИЧ-инфекцией.
-
Изучить экспрессию Fas-рецептора и его лиганда на поверхности лимфоцитов периферической крови, а также зависимость их экспрессии от функционального состояния лимфоцитов.
-
Исследовать механизмы Fas-индуцированного апоптоза лимфоцитов доноров и больных ВИЧ-инфекцией.
-
Изучить влияние процессов активации лимфоцитов на восприимчивость к действию апоптогенных стимулов.
-
Исследовать роль митохондрий, а также некоторых митохондриальных белков (в частности, Вс1-2), в процессах спонтанного и индуцированного апоптоза лимфоцитов при ВИЧ-инфекции.
-
Изучить взаимосвязь репликации ВИЧ-1 и апоптоза различных популяций лимфоцитов периферической крови и лимфоидных линий
7 Изучить роль процессов микровезикуляции в патогенезе ВИЧ-инфекции.
Научная новизна.
Впервые получены данные, иллюстрирующие зависимость
активационного статуса Лф больных ВИЧ-инфекцией и их повышенной
восприимчивости к апоптозу. Показано, что повторная активация
лимфоцитов, одновременно экспрессируюших активационные маркеры
(CD38, HLA-DR, CD26) снижает их чувствительность к действию
апоптогенных стимулов (ФГА, анти-Fas-MKAT). Впервые выявлена
повышенная чувствительность к Fas-индуцированному апоптозу у
лимфоцитов с гиперэкспрессией Fas-рецептора. Показано, что при ВИЧ-
инфекции имеется повышенная чувствительность лимфоцитов
периферической крови к апоптогенному действию глюкокортикоидов. В
то же время, только С08+Т-лимфоциты являются резистентными к ФГА-
индуцированному апоптозу. При инфицировании in vitro культуры
лимфоцитов наблюдается резкое снижение количества
неинфицированных С04+Т-лимфоцитов (но не CD8+ Т-лимфоцитов)
вследствие их гибели по механизму апоптоза. Впервые установлено, что
инфицированные in vitro лимфоциты являются резистентными к
апоптозу. Репликация ВИЧ-1 сопровождается подавлением программы
апоптоза инфицированных лимфоцитов и массовой гибелью
неинфицированных CD4+ Т-лимфоцитов по механизму апоптоза.
Установлено повышение образования микровезикул тромбоцитарного
происхождения у больных ВИЧ-инфекцией, коррелирующее с активацией
Т-лимфоцитов периферической крови.
Научно-практическая значимость.
Совершенствование диагностики ВИЧ-инфекции, проведение адекватной терапии невозможно без глубоких знаний о патогенезе и механизмах формирования иммунодефицитного состояния при данном заболевании. Полученные данные о механизмах гибели лимфоцитов при ВИЧ-инфекции открывают путь к поиску новых подходов к лечению данного заболевания. Модель оценки спонтанного и индуцированного апоптоза лимфоцитов может быть использована как в комплексном исследовании процессов ПКГ и функциональной активности клеток, участвующих в патогенезе вирусных заболеваний с нарушениями апоптоза, так и для направленного поиска средств фармакологического контроля.
Результаты проведенного исследования могут быть использованы патофизиологами, иммунологами, инфекционистами в научной, практической и учебной работе. Основные положения, выносимые на защиту:
-
Лимфоциты периферической крови больных ВИЧ-инфекцией подвержены апоптотической гибели, что обусловлено их повышенной активацией.
-
Субпопуляции лимфоцитов периферической крови больных ВИЧ-инфекцией различаются по чувствительности к апоптогенным стимулам. Наиболее резистентной популяцией лимфоцитов к активационному и Fas-индуцированному апоптозу является С08+Т-лимфоциты. Развитие устойчивости CD8+T-лимфоцитов к апоптозу зависит от их функционального состояния, выявляемого по экспрессии активационных маркеров.
-
Интенсивность репликации ВИЧ-1 in vitro обусловлена подавлением программы апоптоза инфицированных лимфоцитов. Повышенная гибель неинфицированных лимфоцитов по типу апоптоза находится в прямой зависимости от репликации ВИЧ-1.
Внедрение результатов исследования.
Разработанные в исследованиях методы исследования активационного апоптоза лимфоцитов периферической крови используются в комплексном иммунологическом исследовании больных ВИЧ-инфекцией в лаборатории иммунологии Республиканского центра по профилактике и борьбе со СПИД и ИЗ Министерства здравоохранения Республики Татарстан. Материалы диссертации используются в преподавании раздела "Патогенез иммунодефицита при ВИЧ-инфекции" на кафедре инфекционных болезней Казанского государственного медицинского университета.
Апробация работы. Основные положения и результаты работы доложены на 4, 5, 6, 7, 8 -ой Всероссийских конференциях по аллергологии и клинической
t
иммунологии "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург, 2000, 2001, 2002, 2003, 2004); на 10, 11-ом Национальных Конгрессах по болезням органов дыхания (Санкт-Петербург, 2000, Москва, 2001); 7, 8-ой Всероссийских школах молодых ученых "Актуальные проблемы нейробиологии" (Казань, 2000, 2001); 5-ой научно-практической конференции молодых ученых (Казань, 2001); 4-ом Конгрессе РААКИ "Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии" (Москва, 2001); 12-ой Конференции ученых КГУ "Нуклеазы микроорганизмов" (Казань, 2001); 11-ой Международном Конгрессе "Европейского респираторного общества" (Берлин, 2001); 1,3-ей научно-практической конференции с международным участием "Проточная цитофлуорометрия и ее использование в практической медицине" (Санкт-Петербург, 2001, 2004); XVII Менделеевском съезде но общей и прикладной химии (Казань, 2003); Юб.конференции, посвящ. 10-летию основания Всероссийской ассоциации по изучению тромбозов, геморрагии и патологии сосудов им. А.Шмидта-Б.Кудряшова (Москва, 2003), 3-м Российском конгрессе по патофизиологии "Дизрегуляторная патология органов и систем" (Москва, 2004), Всероссийском семинаре "Проблемы определения субпопуляций лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных лиц методом проточной цитометрии" (Смоленск, 2004); 2-й Всероссийской научной конференции "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии" (Москва, 2005); заседании предметно-проблемной комиссии КГМУ по патофизиологии и аллергологии (Казань, 2005).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 38 работ, из них 8 в центральной печати.
Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, глав обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследования, глав результатов исследования, заключения, выводов, Списка цитируемой литературы. Объем диссертации 252 страницы машинописного текста, содержит 52 рисунка, 4 таблицы. Список литературы включает 32 отечественных и 313 зарубежных источников.
