Введение к работе
ВИЧ-инфекция продолжает оставаться большой медико-социальной проблемой. До настоящего времени патогенез этого заболевания остается до конца не изученным, что обуславливает проведение научных исследований. Продемонстрировано, что существуют различные механизмы гибели С04+Т-лимфоцитов при ВИЧ-инфекции. Продуктивно инфицированные СВ4+Т-лимфоциты (клетки с активной вирусной репликацией) погибают преимущественно по механизму некроза. Данный процесс обусловлен цитопатическим действием вирусных белков (Vpu, Vpr, Vif), которые накапливаются в клетке в процессе его репликации [Fauci A.S., 1988; Levy J.A., 1993; Gonzales М.Е., Corrasco L., 2001; Lenardo M.J., et al., 2002; Sakai K., et al., 2006]. Показано in vivo, что уже на самых ранних сроках заболевания (дни после инфицирования) в слизистых оболочках (т.е. на прямых путях инфицирования ВИЧ-1) происходит массовая гибель С04+Т-лимфоцитов памяти преимущественно за счет прямого цитопатического действия ВИЧ-1 [Menandru S., et al., 2004; Veazey R.S., Lackner A.A., 2004; Mattapallil J.J., et al., 2005].
Продемонстрировано, что неинфицированные CD4+T-лимфоциты при ВИЧ-инфекции погибают преимущественно по механизму апоптоза. Данный процесс также обусловлен белками ВИЧ-1. Вирусные белки (Env, Nef, Tat, Vpr, протеаза) запускают программу апоптоза в неинфицированных СБ4+Т-лимфоцитах при контактном взаимодействии с ними. Механизмы действия данных белков весьма разнообразны: а) индукция процесса активации лимфоцитов, что повышает чувствительность клеток к развитию активационного апоптоза (вирусные белки Env, Nef, Tat); б) активация специфических протеаз, именуемых каспазами (например, каспазы-3,-8,-9), вызывающих необратимые изменения в ядре и цитоплазме клетки (вирусные белки Env, Nef, Tat, протеаза, Vpr); в) повреждение митохондрий, что проявляется снижением трансмембранного митохондриального потенциала (вирусные белки Env, Vpr); г) подавления функции внутриклеточных белков-ингибиторов апоптоза, в частности, Вс1-2 (вирусные белки Env, Nef, Tat, протеаза); д) активация про-апоптогенных белков, в частности, Вах (вирусные белки Env, протеаза) [ Westendorp М.О., et al., 1995; Krammer P.H., 2000; Yusim A., et al., 2000; Roumier Т., et al., 2002;
James CO., et al., 2004; Nie Z., et al., 2007; Shedlock D.J., et al., 2008; Trushin S.A., et al., 2009 ].
Напротив, в популяции продуктивно инфицированных CD4+T-лимфоцитов наблюдается подавление программы апоптоза [Almonti J.B., et al., 2003; Мустафин И.Г., 2005; Бойчук СВ., с соавт., 2006; Shedlock D.J., et al., 2008]. Механизмы данного феномена остаются недостаточно изученными. Продемонстрировано участие в его развитии вирусных белков. В частности, белок вируса Nef инактивирует внутриклеточный белок-индуктор апоптоза Вах [Wolf D. et al., 2001]. Вирусный белок Tat повышает в клетке активность белка-ингибитора апоптоза c-FLIP [Gibellini D. et al., 2005]. Угнетение апоптоза продуктивно инфицированных CD4+T-лимфоцитов играет негативную роль для ВИЧ-инфицированных лиц, т.к. способствует поддержанию репликации ВИЧ-1.
Логичным является предположение о наличии в организме ВИЧ-инфицированных больных факторов, способных регулировать вышеописанные процессы: 1) репликацию ВИЧ-1; 2) гибель CD4+T-лимфоцитов.
Данные факторы остаются дискуссионными. Их изучение имеет важное значение, поскольку будет способствовать раскрытию патогенетических механизмов заболевания и разработке новых стратегий терапии больных ВИЧ-инфекцией. Для их поиска весьма актуальным является изучение молекулярных межклеточных взаимодействий в иммунной системе. Известно, что эти взаимодействия осуществляются двумя способами: а) путем прямого контактного взаимодействия клеток; б) через специальные гуморальные медиаторы (цитокины), которые одни клетки секретируют, а другие воспринимают посредством специфических рецепторов (межклеточные взаимодействия по типу лиганд-рецептор).
Продемонстрировано, что у ВИЧ-инфицированных лиц по мере прогрессирования заболевания изменяется баланс цитокинов: а) повышается уровень ТЬ2-цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-10 и др.), продуцируемых Т-лимфоцитами-хелперами 2 типа (Тп2-клетками); б) снижается уровень ТЫ -цитокинов (ИЛ-2, ИФН-у и др.), продуцируемых Т-лимфоцитами-хелперами 1 типа (Thl-клетками) [Klein S.A.. et al., 1997; Kawamura Т., et al., 2003; Romagnani S., 2006; Sirskij D., et al., 2008]. В организме больного происходит сдвиг ТЫЛЪ2-баланса в сторону преобладания Тп2-клеток. Возникновение
данного дисбаланса обуславливает неэффективность иммунного ответа против ВИЧ-1 [Clerici М, Shearer G.M., 1993, 1994; Imami N., et al., 2002; Sirskij D., et al., 2008], что может явиться одним из патогенетических механизмов развития иммунодефицита.
Уровни некоторых цитокинов в плазме ВИЧ-инфицированных больных могут указывать на прогрессирование заболевания: а) снижение ИЛ-2; б) повышение Тп2-цитокинов (ИЛ-4); в) повышение ИЛ-7; г) повышение ФНО-а [Vigano A. et al., 1995; Kinter A., et al., 1996; Rizzardi et al., 1998; Marone G., et al., 2000; Napolitano L.A., et. al., 2001; de Oliveira Pinto L.M., et al., 2002; Wig N. et al., 2005; Wang Q., et. al., 2006; Бойчук СВ., с соавт., 2006; Herbein G., Khan K.A., 2008; Sirskij D., et al., 2008].
Все вышеизложенное явилось основанием для проведения настоящего исследования по изучению роли цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7 и ФНО-а) в патогенезе ВИЧ-инфекции, а именно, в регуляции процессов репликации ВИЧ-1 и апоптоза лимфоцитов.
Объект и предмет исследования
Объектом исследования являлись 30 здоровых доноров (17 мужчин, 13 женщин) в возрасте от 25 до 50 лет. Донорам проводилось соответствующее обследование: общеклинические, вирусологические и серологические анализы. Предмет исследования составляли лимфоциты периферической крови.
Цель исследования
Изучить способность цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7 и ФНО-а) регулировать процесс репликации ВИЧ-1 в лимфоцитах, а также апоптоз лимфоцитов при ВИЧ-инфекции in vitro.
Задачи исследования
Изучить влияние цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7 и ФНО-а) на регуляцию процесса репликации ВИЧ-1 in vitro.
Исследовать влияние цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7 и ФНО-а) на активацию С04+Т-лимфоцитов при их инфицировании in vitro ВИЧ-1.
Охарактеризовать взаимосвязь между процессами активации С04+Т-лимфоцитов и репликации ВИЧ-1.
Исследовать влияние цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7 и ФНО-а) на регуляцию процесса апоптоза лимфоцитов при их инфицировании in vitro ВИЧ-1.
Методы исследования
В работе использовался ряд современных методов патофизиологии, иммунологии и молекулярной биологии: выделение и культивирование лимфоцитов периферической крови, иммуноферментный анализ, изучение некоторых маркеров апоптоза лимфоцитов и их активационного статуса методом проточной цитометрии.
Достоверность полученных данных и их научная новизна Для получения достоверных результатов проведено достаточное количество экспериментов. Полученные данные были подвергнуты статистической обработке с помощью программы BIOSTATISTICA (S. A. Glantz, McGraw Hill). Для анализа данных использовались параметрические и непараметрические критерии. Уровень статистической значимости (р) считали равным 0,05. Связь между признаками оценивали с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена (г).
Научная новизна полученных результатов, по мнению автора, состоит в выявлении следующих процессов. Впервые установлено, что в инфицированных in vitro ВИЧ-1 клеточных культурах цитокины (НЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ФНО-а) поддерживают жизнеспособность продуктивно инфицированных лимфоцитов (клеток с активной вирусной репликацией), в то же время, индуцируя гибель неинфицированной популяции лимфоцитов по механизму апоптоза.
Исследование показало, что продуктивно инфицированные лимфоциты имеют особый активационный статус. Этот активационный статус следует определить термином - «минимальная активация» (клетки с активной вирусной репликацией обладают, в отличие от неинфицированных лимфоцитов, минимальной экспрессией активационных маркеров). Особый активационный статус продуктивно инфицированных лимфоцитов является результатом совместного действия цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ФНО-а) и белков ВИЧ-1.
Исследование продемонстрировало, что цитокины (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, и ФНО-а) индуцируют репликацию ВИЧ-1 в CD4+T-лнмфоцитах. Вызванные данными цитокинами процессы (инициация репликации ВИЧ-1, массовая гибель неинфицированной популяции лимфоцитсз по механизму апоптоза, поддержание жизнеспособности продуктивно инфицированных лимфоцитов) способствуют развитию ключевых признаков, характерных для прогрессирования
заболевания, а именно, нарастанию вирусной нагрузки и лимфопении, ответственной за развитие вторичного иммунодефицита.
Теоретическая и практическая значимость
Результаты проведенного исследования позволяют углубить современные представления о патогенезе ВИЧ-инфекции. В работе показано, что цитокины (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ФНО-а), которые в норме поддерживают жизнеспособность лимфоцитов и обеспечивают формирование иммунного ответа, при ВИЧ-инфекции способны играть негативную роль.
Материалы диссертации могут быть использованы патофизиологами, иммунологами, инфекционистами: а) в учебном процессе - для преподавания разделов: «Патогенез ВИЧ-инфекции», «Иммунодефицита», «Молекулярные и клеточные основы адаптивного иммунитета»; б) в научной работе - для дальнейшего изучения механизмов гибели лимфоцитов при ВИЧ-инфекции.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
Цитокины ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, и ФНО-а индуцируют репликацию ВИЧ-1 в С04+Т-лимфоцитах. Наиболее эффективными индукторами вирусной репликации являются ИЛ-7 и ИЛ-2.
В инфицированных in vitro ВИЧ-1 клеточных культурах цитокины (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ФНО-а) поддерживают жизнеспособность продуктивно инфицированных лимфоцитов (клеток с активной вирусной репликацией), в то же время, индуцируя гибель неинфицированной популяции лимфоцитов по механизму апоптоза. Наиболее эффективным индуктором апоптоза лимфоцитов является ФНО-а.
Личный вклад соискателя
Автором выбрана тема, составлена программа, определены этапы диссертационной работы, проведен анализ научной литературы по изучаемой проблеме. Автором выполнены экспериментальные исследования по влиянию некоторых цитокинов на процессы активации и апоптоза лимфоцитов, а также репликации ВИЧ-1, которые проводились в лаборатории иммунологии Республиканского центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями МЗ РТ (заведующий лабораторией, д-р мед. наук Мустафин И.Г.). Автором проведена статистическая обработка, группировка, анализ результатов, интерпретированы полученные
данные. Формулирование выводов, рекомендаций, положений, выносимых на защиту принадлежат лично автору.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены и обсуждены на: научно-практических конференциях молодых ученых Казанского государственного медицинского университета (2005, 2007, 2008, 2009 гг.), DC Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2006г.), VIII Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2007г.), Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008г.), X международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», посвященном 100-летию со дня рождения академика АМН А.Д. Адо (Казань, 2009г.).
Публикации по теме диссертации
Основные результаты диссертационного исследования отражены в 14 научных работах, в том числе 4-х статьях в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией. Общий объем публикаций - 2,2 у.п.л., в том числе авторское участие - 0,9 у.п.л.
Реализация результатов работы
Материалы диссертации используются в учебном процессе кафедры патофизиологии (для преподавания раздела «Иммунодефицита») и кафедры клинической иммунологии и аллергологии (для преподавания раздела «Молекулярные и клеточные основы адаптивного иммунитета») Казанского государственного медицинского университета.
Методы культивирования лимфоцитов, предложенные в диссертации внедрены в практическую работу лаборатории иммунологии ФГУН «Казанский научно-исследовательский институт эпидимиологии и микробиологии Роспотребнадзора».
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов), выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего 322 источника, из которых 307 зарубежных авторов. Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, иллюстрирована 18 таблицами и 29 рисунками.
