Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема вирусных инфекций приобретает все большую актуальность в связи с возросшей заболеваемостью, широким распространением среди трудоспособного населения, недостаточной эффективностью современных методов профилактики и лечения. Актуальным аспектом практической медицины остается недостаточная эффективность противовирусной терапии [Пименов Е.В. и др., 2003; Воробьев А.А., 2004; Львов Д.К., 2004; Дементьева Л.А., 2010].
Современные исследователи, опираясь на накопленные теоретические данные и клинический опыт, убеждены в том, что скорость развития инфекционного процесса определяется сложным комплексом взаимодействия патогена и организма человека. Известно, что особенности формирования и течения вирусной инфекции обусловлены, с одной стороны, гетерогенностью самого патогена (вирулентность, контагиозность, лекарственная устойчивость), а с другой - состоянием иммунной системы организма [Антонов П.В., 2001; Shrestha S., 2006; Халдии А.А., 2008; Волова Л.Ю., 2010; Губарева Е.В.,2010].
Факт формирования расстройств иммунного реагирования при развитии вирусных инфекций установлен давно. Известно, что возбудители инфекционных заболеваний обладают иммуномодулирующей активностью, вызывая иммунодефицитные состояния, степень выраженности которых связана непосредственно с характером и тяжестью инфекционного процесса и зависит от преморбидного фона пациента [Долгих В.Т., 2000; Рязанцева Н.В. и др., 2003, 2005; Климова P.P., 2010].
Особо следует акцентировать внимание на том, что многие вирусы, в том числе вирус простого герпеса (HSV) и вирус иммунодефицита человека (HTV), не только поражают клетки иммунной системы, но и репродуцируются в них [Mogensen Т.Н., 2001; Пименов Е.В. и др., 2003; Букринская А.Г., 2010].
Поражая различные, в том числе иммунокомпетентные клетки организма, ШУи вирусы группы герпеса вызывают формирование персистирующего инфекционного процесса с медленным вариантом развития клинических проявлений. Медленная вирусная инфекция характеризуется многолетним течением, клинически связанным с прогрессирующим подавлением иммунитета, вплоть до инвалидизации и смерти больного [Исаков В.А. и др., 2007; Горпинченко И.И., 2009; Андронова В.Л., 2010; Букринская А.Г., 2010; Гафарова Н.Э., 2010].
Особую роль в дизрегуляции иммунной системы при инфекционном процессе играют нарушения межклеточной кооперации. Известно, что в становлении и стабилизации контактов между взаимодействующими в ходе реализации противоинфекционной защиты клетками макроорганизма, важное значение принадлежит цитокин-рецепторной сети [Фрейдлин И.С. и др., 2001; Хаитов P.M., 2001; Симбирцев А.С., 2003, 2005; Ярилин А.А., 2001; Наследникова И.О., 2009; Шевчук Н.Е., 2009].
В основе патологии этой биологической мультисистемы могут лежать как непосредственное воздействие патогенов на продукцию цитокинов мононуклеарными лейкоцитами и их клеточные рецепторы, так и, опосредованная их влиянием, супрессия внутриклеточных сигналов активации, механизмов сигнальной транедукции и
транскрипции [Кетлинский С.А., 2002; Gomez I. et al., 2004; Nelson B.H., 2004; Smith P.L. et a!., 2005; Дмитриев П.Н., 2010].
Длительное сосуществование вируса и иммунокомпетентного хозяина, обеспечивающее выживание обоих видов, требует установления баланса между скоростью репликации инфекционного агента и его элиминации из организма. В «арсенале» иммунной системы имеется достаточное количество различных стратегических подходов к распознаванию и элиминации вирусов, на которые у последних выработаны всевозможные способы самозащиты [Hsu W.L., 2005; Kurt-Jones Б.А., 2005; Белозеров Е.С., Буланьков Ю.И., 2006; Каралян М.А, 2010].
Ключом к разгадке феномена длительной персистенции вирусов в организме человека служит баланс ТЫ- и ТЬ2-цитокинов, особенно на ранних стадиях заболевания. В частности, показано, что персистентные вирусные инфекции сопровождаются изменением баланса в системе иммунорегуляторных цитокинов с преимущественной гиперпродукцией цитокинов типа Th2 [Симбирцев А.С., 2003; Мальханов В.Б. и др., 2004; Наследникова И.О., 2005; Smith P.L., 2005; Белозеров Е.С., Буланьков Ю.И., 2006].
Функционирование цитокиновой сети при вирусной инфекции зависит от многих причин, в число которых входят индивидуальные различия в продукции иммунореіуляторньгх белков, обусловленные рядом генетических особенностей. Гены цитокинов, для большинства из которых описан аллельный полиморфизм, являются важнейшими генами-регуляторами, контролирующими иммунный ответ. Наиболее часто встречающиеся аллельные варианты генов цитокинов образуются в результате мутаций, затрагивающих некодирующую (интроны, промотор) область генов, в результате чего структура белкового продукта остается прежней, а изменяется уровень экспрессии и количество самого цитокина нарабатываемого иммунокомпетентными клетками [Сенников СВ. и соавт., 2004].
С одной стороны, вирусы обладают мощнейшим иммуносупрессорным воздействием на клетки организма, что приводит к изменениям равновесия в цитокиновой сети, с другой стороны, генетически детерминированная продукция цитокинов запускается в ответ на инфекцию. Таким образом, уровень экспрессии белковых продуктов полиморфных генов цитокинов определяет качество иммунного ответа и, соответственно, течение и исход болезни [Смольникова М.В., 2002; Pollara G., 2004; Nieters А., 2005; Коненков В.И. и др., 2006; Shrestha S., 2006; Нестерова, И.В., 2010].
В связи с этим, изучение распределения аллельных вариантов промоторных регионов генов ключевых иммунорегуляторных цитокинов, а также степени их ассоциации с уровнем продукции соответствующих белковых продуктов у пациентов с медленными вирусными инфекциями представляется актуальным, поскольку его результаты могут служить основой для разработки критериев прогноза течения и исходов вирусной инфекции, а также быть использованы для разработки новых способов персонифицированной иммунокорригирующей терапии.
Цель исследования: установить роль аллельного полиморфизма генов иммунорегуляторных цитокинов в формировании неблагоприятного течения медленных вирусных инфекций.
Задачи исследования:
-
Оценить содержание иммунорегуляторных цитокинов (IL-2, IL-4, IL-10, IL-12p, IFN-y, TNF-a) в крови у больных с медленными вирусными инфекциями (герпес, HIV-инфекция).
-
Изучить распределение аллельных вариантов генов IL2, IL4, IL10, IL12B, IFNG и TNFA среди пациентов с бессимптомным и хроническим рецидивирующим герпесом, с медленно и быстро прогрессирующим течением HIV-инфекции.
-
Определить ассоциацию полиморфных вариантов генов IL2, IL4, IL10, IL12B, IFNG и TNFA с содержанием соответствующих цитокинов в сыворотке крови у пациентов с медленными вирусными инфекциями.
-
Выявить иммуногенетические критерии риска неблагоприятного течения медленных вирусных инфекций (хронический рецидивирующий герпес, быстро прогрессирующее течение HIV-инфекции).
Научная новизна. С привлечением современных иммуногенетических методов исследования охарактеризована распространенность полиморфных вариантов генов про- и противовоспалительных цитокинов (T-330G гена IL2 (rs2069762), С-590Т гена IL4 (гз2243250), С-592А гена IL10 (rsl800872), А-1188С гена IL12B (rs3212227), +874А/Т гена IFNG (rs2069705), G-308A гена TNFA (rsl800629)) у пациентов с бессимптомным и хроническим рецидивирующим герпесом, а также HTV-инфекцией с медленно и быстро прогрессирующим течением. Выделены генетические факторы цигокинового дисбаланса (повышение концентрации EL-IO, IL-12J3, IFN-y, TNF-a при снижении содержания IL-2 в крови). Показано, что генотипы АА (С-592А) гена IL10, СС (А-1188С) гена IL12B, ТТ (+874А/Т) гена IFNG, АА (G-308A) гена TNFA и ТТ (T-330G) гена IL2 ассоциированы с повышенным содержанием соответствующих цитокинов в сыворотке крови. Установлена связь аллельного полиморфизма генов иммунорегуляторных цитокинов с характером течения инфекционного процесса при медленных вирусных инфекциях, вызванных HSV и HIV. Показано, что наибольший риск рецидивирующего течения герпетической инфекции связан с комбинацией генотипов СТ полиморфного сайта С-590Т гена IL4 и GA полиморфизма G-308A гена TNFA, в то время как наибольший риск быстро прогрессирующего течения HIV-инфекции связан с комбинацией генотипов АА полиморфного сайта +874АН гена IFNG и GG полиморфного участка G-308A гена TNFA.
Практическое и теоретическое значение работы. Полученные данные фундаментального характера раскрывают новые иммуногенетические аспекты развития медленных вирусных инфекций. Результаты исследования полиморфизма генов иммунорегуляторных цитокинов (IL2, IL4, 1Ы0, 1Ы2В, IFNG, TNFA) представляются важными для формирования новых знаний о генетически детерминированной предрасположенности или резистентности человека к развитию медленных вирусных инфекций, позволяют глубже проникнуть в молекулярные механизмы инфекционной патологии. Основные положения исследования могут служить базисом не только для дальнейшего изучения этиопатогенеза медленных вирусных инфекций, но и для разработки новых подходов к прогнозированию клинического течения и исхода герпетической и HIV-инфекций.
Положения, выносимые на защиту:
-
Дисцитокинемия при медленных вирусных инфекциях (хронический рецидивирующий герпес и ШУ-инфекция) связана с аллельным полиморфизмом генов цитокшюв и проявляется повышением концентрации IL-10, IL-12|3, IFN-y, TNF-a при снижении содержания IL-2 в крови. При этом у больных с хронической рецидивирующей герпетической инфекцией отмечается увеличение, а у пациентов с HIV-инфекцией с быстро прогрессирующим течением, напротив, уменьшение концентрации IL-4 в сыворотке крови.
-
Среди пациентов с медленными вирусными инфекциями наиболее частыми являются генотипы TG (T-330G) гена IL2, СТ (С-590Т) гена IL4, СА (С-592А) гена IL10, AC (А-1188С) гена IL12B, AT (+874А/Т) гена IFNG и GA (G-308A) гена TNFA. У пациентов с быстро прогрессирующим течением ШУ-инфекции преобладающим является генотип АА (+874А/Т) гена IFNG.
-
У лиц с бессимптомным носительством HSV, пациентов с хроническим рецидивирующим герпесом и медленно и быстро прогрессирующим течением НГУ-инфекции генотипы ТТ (T-330G) гена IL2, (С-590Т) гена IL4 и (+874А/Т) гена IFNG, генотипы АА (С-592А) гена IL10 и (G-308A) гена TNFA и генотип СС (А-1188С) гена IL12B ассоциированы с повышенным содержанием соответствующих цитокинов в сыворотке крови.
-
Подверженность неблагоприятному течению медленных вирусных инфекций (хроническое рецидивирующее течение герпеса, быстро прогрессирующее течение ШУ-инфекции) ассоциирована с аллелем Т (С-590Т) гена IL4, аллелем А (С-592А) гена IL10, аллелем С (А-1188С) гена IL12B и генотипом АА (+874А/Т) гена IFNG. Риск рецидивирующей герпетической инфекции дополнительно связан с аллелем G (T-330G) гена 11,2 и генотипом СТ (С-590Т) гена IL4, а прогрессирующий вариант течения ШУ-инфекции - с генотипом GA (G-308A) гена TNFA.
-
Общими иммуногенетическими факторами с протективным эффектом в отношении неблагоприятного течения медленных вирусных инфекций являются генотип ТТ (T-330G) гена IL2, генотип СС (С-590Т) гена IL4 и (С-592А) гена ILI0, генотип АА (А-1188С) гена IL12B, аллель Т (+874А/Т) гена IFNG и генотип GG (G-308A) гена TNFA. При этом защитный эффект в отношении подверженности рецидивирующему течению герпетической инфекции дополнительно опосредует генотип ТТ (+874А/Т) гена IFNG.
Реализация и апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на межгородской конференции молодых учёных «Актуальные вопросы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2009, 2010), X и XI международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2009, 2010), VIII Российско-германской научно-практической конференции «Инновации в медицине. Социально значимые инфекции» (Новосибирск, 2009), Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии» (Томск, 2009), Научной конференции с международным участием «Нейрогуморальные механизмы регуляции висцеральных органов и систем в норме и при патологии» (Томск, 2009), Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетические основы
функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии» (Новосибирск, 2010), научных семинарах кафедры патофизиологии ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России (Томск, 2008-2011).
Работа выполнена на базе кафедры патофизиологии и Центральной научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России при финансовой поддержке Совета по грантам при Президенте РФ для ведущих научных школ России (НШ-2334.2008.7 «Роль генетически детерминированных реакций системы крови в патоморфозе инфекционных заболеваний») и ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. по направлению «Клеточные технологии» (государственный контракт П718 от 12.08.2009 г. «Поиск факторов риска и прогнозирования течения и исходов социально значимых заболеваний на основе полиморфных ДНК-маркеров»).
Результаты исследований используются в лекционном курсе по патофизиологии в разделах «Патофизиология клетки», «Патофизиология иммунитета», «Роль наследственности в патологии».
Публикации. По теме диссертации опубликовано II работ, из них 5 в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 147 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырёх глав, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 4 рисунками и 28 таблицами. Библиографический указатель включает 236 источников, го них 150 отечественных и 86 зарубежных авторов.
Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации. Соискателем лично были выполнены следующие этапы работы: анализ литературных данных по теме диссертации, планирование исследования, постановка цели и задач исследования, пробоподготовка, иммуноферментный анализ, выделение ДНК, аллель-специфическая полимеразная цепная реакция, статистический анализ результатов, написание и оформление диссертации.
