Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Литературный обзор 8
1.1. Биологическая и фармакологическая активность соединений солодки 8
1.2. Липиды 12
1.3. Флавоноидные соединения 14
1.1.1. Методы выделение флавоноидов из растительного сырья 17
1.1.2. Основные методы разделения и идентификации флавоноидов 17
1.1.3. Идентификация спектральными методами 22
1.4. Глицирризиновая кислота 27
1.5. Сахара 34
1.6. Жидкостно-твердофазная экстракция основных классов БАВ Влияние различных факторов на экстракционное равновесие 37
ГЛАВА II. Объекты и методы исследования
2.1. Используемые реагенты 44
2.2. Получение экстрактов солодкового корня 44
2.3. Разделение и анализ липидов 47
2.4. Разделение этилацетатного экстракта методом ЖТФЭ растворителями различной полярности и водными растворами оснований 47
2.5. Фракционирование этилацетатного экстракта методом колоночной хроматографии 52
2.6. Анализ разделяемых смесей с помощью ТСХ 53
2.7. Силилирование соединений для масс-спектрометрического анализа 53
2.8. Получение глицирризиновой кислоты из глицирама 54
2.9. Получение концентрата глицирризиновой кислоты 54
ГЛАВА III. Термодинамика процессов экстракции бав корня солодки
3.1. Определение оптимальных параметров ЖТФЭ флавоноидов 55
3.1.1. ЖТФЭ этилацетатом 55
3.1.2. ЖТФЭ этанолом 56
3.2. Термодинамика ЖТФЭ 58
3.3. Термодинамика фракционирования этилацетатного экстракта корня солодки 64
ГЛАВА IV. Экстракционно-хроматографическое разделение этилацетатного экстракта корня солодки 69
4.1. Разделение этилацетатного экстракта корня солодки 69
4.2. Анализ VIII фракции этилацетатного экстракта 73
4.3. Экстракционное разделение ЭА экстракта водными растворами оснований 89
ГЛАВА V. Липиды, сахара, глицирризиновая кислота 102
5.1. Лшгиды корня солодки 102
5.2. Сахара 105
5.3. Вьщеление ГК из шрота корня солодки
5.3.1. Экстракция корня солодки водным раствором щелочи 110
5.3.2. Извлечение ГК из шрота солодкового корня и промышленных экстрактов органическими растворителями 112
ГЛАВА VI. Пути практической реализации результатов проведенных исследований
6.1. Биологическая активность некоторых компонентов, выделенных из корня солодки 120
6.2. Вольтамперометрия флавоноидов из корня солодки на статическом ртутном капельном и платиновом ультрамикроэлектроде 132
6.3. Получение глицирама 136
6.4. Получение тринатриевой соли глицирризиновой кислоты 13 7
6.5. Вьщеление основных классов БАВ из каллусной ткани солодки голой 140
Выводы 147
Литература 149
- Основные методы разделения и идентификации флавоноидов
- Разделение этилацетатного экстракта методом ЖТФЭ растворителями различной полярности и водными растворами оснований
- Термодинамика фракционирования этилацетатного экстракта корня солодки
- Экстракционное разделение ЭА экстракта водными растворами оснований
Введение к работе
Актуальность темы. Тенденция к использованию лекарственны?; препаратов, получаемых из продуктов переработки растительного сырья, постоянно возрастает. Среди лекарственных растений особое место занимает солодка голая (Glycyrrhiza glabra L.), экстракты которой содержат широкий диапазон продуктов, в основном смеси тритерпенов и полифенолов. Интерес к данным классам соединений обусловлен широким спектром проявляемом ими биологической активности, а также низкой токсичностью и отсутствием побочных эффектов.
Однако, одним из наиболее значительных недостатков существующих процессов переработки солодкового корня для нужд химико-фармацевтической и медицинской промышленности является недостаточная степень извлечения экстрактивных веществ - -40-60%. Кроме того, получаемые в промышленности экстракты часто содержат значительное количество балластных веществ, что осложняет дальнейший процесс получения субстанций для лекарственных препаратов.
Экстракционный метод переработки лекарственно-технического сырья сегодня является одним из немногих, гарантирующих глубокое и практически полное извлечение биологически активных веществ (БАВ). Применяемые методы жидкостно-твердофазной экстракции (ЖТФЭ) в технологии получения фитопрепаратов должны обеспечить возможность комплексного использования растительного сырья. Использование нескольких селективных экстрагентэв дает возможность получения ряда субстанций (чаще всего суммарных).
До настоящего времени остаются не изученными физико-химические закономерности селективного извлечения различных классов БАВ корня солодки. Отсутствуют и данные по термодинамике соответствующих процессов, необходимые для понимания механизма экстракции. Поэтому систематическое исследование процессов ЖТФЭ является актуальным и позволит решить ряд задач теоретического и практического значения.
Диссертация выполнена в соответствии с планом НИР Института органической химии УНЦ РАН по темам: "Комплексообразование и сольватация низкомолекулярных биорегуляторов с d- и f- металлами и фармаконами" (номер государственной регистрации 01.9.40009079), "Разработка физико-химических методов комплексной переработки солодки - высокоценного растительного сырья - как основа получения лекарственных препаратов" (how ер проекта 8.1.28) в рамках РГНТП "Экологически безопасные процессы химии и химической технологии" (Научный совет направления: "Химия и технология переработки возобновляемого растительного сырья").
Цель работы.
определение оптимальных параметров ЖТФЭ и термодинамики процессов селективного извлечения основных классов БАВ;
разработка методов фракционирования экстрактов;
выделение и идентификация ряда компонентов корня солодки;
разработка технологичного способа комплексной переработки корня солодки с целью получения ряда субстанций для производства фармпрепаратов.
Научная новизна. Разработаны научные основы комплексной переработки корня солодки и предложена схема селективного извлечения и разделения основных классов БАВ путем последовательной жидкостно-твердофазной экстракции корня солодки растворителями возрастающей полярности. Проведена оптимизация экстракционных процессов и определены термодинамические параметры ЖТФЭ.
Разработаны методы фракционирования фенольных соединений, основанное на различиях кислотно-основных свойств компонентов экстрактов. Из этилацетатного экстракта (ЭА) выделены и идентифицированы современными физико-химическими методами производные изофлавана глабридина.
Практическая' ценность. Разработана схема селективного извлечения основных классов БАВ, имеющая преимущества перед используемыми в промышленности способами переработки корня солодки и позволяющая упростить ряд технологических процессов получения отдельных субстанций фармакологических пргпаратов.
Выделенные из корней Glycyrrhiza glabra L. экстракты, проявили высокую противовоспалительную, противоязвенную, репаративную, гепатопротек-торную активности. Они являются ценными субстанциями для создания ряда лекарственных форм и фармацевтических препаратов.
Разработаны технологичные способы получения тринатриевой соли гли-цирризиновой кислоты (ГК) и глицирама. Наработаны опытные партии соли (Na3rK) для нового гепатопротекторного препарата "Фосфолив" и переданы в Институт Бномедицинской химии РАМН.
Для экспресс-оценки суммы флавоноидов в растительном сырье изучено электрохимическое восстановление флавоноидов из корня солодки и предложена методика их определения в воде и этанольных экстрактах методами циклической и дифференциальной импульсной вольтамперометрии со статическим ртутным капельным и платиновым ультрамикроэлектродами с нижней границей определяемых содержаний п-10"7 моль/л.
На защиту выносятся:
закономерности ЖТФЭ компонентов корня солодки органическими растворителями;
механизм экстракции основных классов биологически активных веществ корня солодки;
принципиапьная схема комплексной переработки корня солодки;
экстраки.ионно-хроматографическое выделение и разделение липофилыгой фракции флавоноидов корня солодки;
пути практической реализации результатов проведенных исследований.
Апробация работы. Результаты исследований были доложены и обсуждены на X (Уфа, 1994) и XI (Москва, 1998) конференциях по экстракции, II съезде Биохимического общества РАН (Москва, 1997), II Международном симпозиуме "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования" (Пущино, 1997), III симпозиуме "Физико-химические оснозы физиологии растений и биотехнология" (Москва, 1997), Международной конференции "Состояние и перспективы развития биотехнологии растений" (Алматы, 1997), III Всероссийском совещании "Лесохимия и органический синтез" (1998), V конференции "Биоантиоксидант" (Москва, 1998), Международном симпозиуме "Solvent extraction for the XXI century" и IV школе по современным проблемам химии и технологии экстракции (Москва, 1999), Всероссийской конференции "Химический анализ веществ и материалов" (Москва, 2000 г.).
Публикации. По результатам исследований опубликовано 4 статьи и тезисы 13 докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, посвященного методам выделения, разделения, идентификации и анализа основных классов БАВ корня солодки, описания объектов и методов исследования, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы.
Работа изложена 16S страницах машинописного текста, содержит 40 рисунков и Збтаблиц. Список цитируемой литературы включает 217 наименований.
Основные методы разделения и идентификации флавоноидов
Для выделения и разделения определенных классов соединений используются различные способы экстракции. В ряде работ описана предварительная обработка корня н-гексаном для удаления жиро-липидного комплекса соединений [112, 113]. Из этилацетат-ного экстракта выделены и охарактеризованы такие соединения как: глабрен (изофлавен) и глаброн (изофлавон) [104], глабридин (изофлаван) и глаброл (флаванон) [97], 7,4 -дигидроксифлавон, изоликвиритигенин [92], ликопиранокумарин [94]. Описано выделение глабрена и глабридина также и из дихлорметанового экстракта. Канзонол R [113] получен из бензольного экстракта корней солодки. Исследование хлороформенных экстрактов позволило выделить из них ряд соединений: ликофлавонол, глицирол, ликорикон [112], ликорисидин, семиликоизофлавон В, медикарпин и др. [114].
Значительную часть флавоноидных гликозидов корня солодки экстрагируют этанолом, метанолом или их водными растворами [101, 103] (ликвиритин, ликуразид, изоли-квиритин и др.). При этом извлекаются также сильно гидроксилированные или метокси-лированные агликоны: эхинатин (4,4 -дигидрокси-2-метоксихалкон), формононетин (7-гидрокси-4-метоксиизофлавон) [115], 6,4 -диметокси-7,2 -дигидроксиизофлавон [116] и др. Полученные спиртовые экстракты часто подвергают экстракционному фракционированию, используя воду и один из растворителей: эфир [106], хлороформ [93] или этилацетат [117,118].
В настоящее время отсутствует общепринятый способ выделения флавоноидных соединений из корня солодки. Однако, прослеживается некоторая обобщенная схема выделения и разделения флавоноидных агликонов и их гликозидов. Для извлечения аглико-нов в качестве экстрагентов используют такие растворители, такие как бензол, эфир, ацетон, хлороформ, этилацетат. Гликозиды извлекают спиртами или водно-спиртовыми смесями. Полученные экстракты сгущают, как правило, в вакууме при температуре (40-50 С).
Основные методы разделения и идентификации флавоноидов Дальнейшее фракционирование и очистка полученных экстрактов могут быть достигнуты хроматографическими методами. Наиболее эффективным в этом отношении является такой классический метод как колоночная хроматография (КХ).
Колоночная хроматография (КХ) является очень эффективной методикой для первоначальной очистки или для разделения больших количеств флавоноидов из сырых растительных экстрактов. Обычно используемыми адсорбентами являются окись алюминия (Ш), силикагель, полиамид, целлюлоза, Sephadex gel. Фракции, полученные КХ с использованием одного из этих адсорбентов, часто перехроматографируют для дальнейшей очистки, используя колонки с другими наполнителями или ВЭЖХ. Фракции могут контролироваться на флавоноиды во время вьвделения с использованием УФ-спектроскопии и /или ТСХ [119, 120]. а) Силикагель может быть использован для выделения как агликонов, так и гликозидов. КХ на силикагеле является первым этапом во фракционировании сырого растительного экстракта, содержащего флавоноиды. Соединения элюируются из колонки растворителя ми, колеблющимися от бензина и бензола через хлороформ к более полярному этилацета ту и метанолу. Часто применяется градиентное элюирование. На силикагеле флавоновые агликоны разделяются смесями хлороформ-метанол, тогда как для гликозидов необходи мо добавлять к таким системам воду. б) Полиамид является наиболее широко используемым сорбентом и хорошо подходит для разделения соединений различной полярности. Преимущество полиамидной КХ со стоит в высоких емкости и разрешении, особенно по сравнению с целлюлозной хромато графией. Недостаток в том, что фракции могут быть загрязнены растворенным полиами дом, если колонки не были тщательно промыты перед использованием [121]. в) Sephadex gel является превосходной неподвижной фазой. Вещества, выделенные по средством КХ, ТСХ или ПБХ обычно загрязнены примесями адсорбента или бумаги и мо гут мешать при последующей идентификации. Колонки Sephadex LH - 20 особенно подхо дят для окончательной очистки. Элюирование в основном производится метанолом, также применяют градиент этанол-вода для дигидрофлавоноловых гликозидов, или хлороформ для окончательной очистки дигидрохалконов [108, 119]. Разделение эфирорастворимой фракции этанольного экстракта корня солодки описано в целом ряде работ [105, 106, 110]. Разделение фракции проводили на силикагеле с использованием в качестве элюэнтов различных пропорций смеси СбНб-ЕЮАс. Очистка элюата СбНб-ЕЮАс (9:1) на препаративной ТСХ (элюэнт - бензол) позволила выделить ликкумарин (6-ацетил-5-гидрокси-4-метилкумарин) [ПО]. Препаративной ТСХ в системе СбНб-ЕЮАс (1:1) разделены 2-метилизофлавоны: глизарин (2-метил-7-гидрокси-8-ацетилизофлавон) [105], 7-ацетил-2-метилизофлавон, 7-метокси-2-метилизофлавон, 7- гидрокси-2-метилизофлавон [106]. Из других фракций были выделены и идентифицированы кверцетин, кемпферол, апигенин, ликвиритигенин и изоликвиритигенин.
Ряд работ посвящен исследованию этилацетатного экстракта корней солодки. Хроматографией этилацетатного экстракта на силикагеле (элюэнт СН3ОН-СНСІ3-Н2О 13:7:8) выделены гликорикон и ликофуранон [122]. Хроматографирование этого экстракта с использованием системы СНСІ3-СН3ОН дало ликохалкон, ликофлаванол и гликокумарин [45]. Последовательное разделение этилацетатного экстракта на силикагеле и Sephadex LH-20 позволило выделить изоликвиритигенин, формононетин, 7,4 -дигидроксифлавон, эхинатин и глаброл. Для ликоизофлавона В и ликоизофлаванона разделение было выполнено скоростной колоночной хроматографией на силикагеле и Sephadex LH-20 после аци-лирования, так как обычные методы оказались неэффективными [92]. Перехроматографи-рование фракций на силикагеле смесью СбНб-(СНз)2СО и окончательно на полиамиде метанолом позволило выделить глабридин и глаброл [97], глаброн и глабрен [104]. Также предложено выделение глабрена и глабридина из дихлорметанового экстракта [93]. Экстракт был первоначально хроматографирован на силикагеле, полученные фракции пере-хроматографированы на обращенно-фазной силикагельной колонке. Глабрен выделен перекристаллизацией одной из фракций из смеси СбНб-(СНз)2СО, глабридин - другой фракции из смеси СбНб-СбНн.
Последовательным хроматографированием бензольного экстракта на силикагеле градиентом СбНб- ЕІ20, полученных фракций снова на силикагеле градиентом СбНі4- СНС1з и окончательной очисткой препаративной ТСХ выделен канзонол R (пре-нилированное производное птерокарпана) [113]. Авторами работы [116] предложена схема разделения и выделения 16 флавоноидных соединений этанольного экстракта, который первоначально фракционирован на Amberlite XAD-2 последовательно водой, метанолом и бензолом. Полученные фракции далее были очищены либо перехроматографированием с использованием другого сорбента, ВЭЖХ или препаративной ТСХ (в работе приведены условия и элюэнты для каждого соединения).
Возможность разделения на полиамиде флаванонов и халконов описана в работах [96, 101]. Установлено, что флаваноны (лакразид, неоликвиритин, ликвиритигенин, лик-виритин, глаброзид) могут быть выделены элюированием водой и водно-спиртовыми смесями, тогда как халконы (ликуразид, неоизоликвиритин, изоликвиритигенин, изоликвиритин, изоглаброзид) - только спиртами. Полиамид, активированный кислотой [123], применен для дополнительной очистки вьщеленных гликозидов. Флавоноидные моногликозиды изоликвиритин и неоизоликвиритин и агликоны - ликвиритигенин и изоликвиритигенин более четко разделены на полиамиде, предварительно обработанном щелочью. Для элюи-рования в этом случае использована смесь хлороформа или дихлорэтана со спиртом.
Разделение этилацетатного экстракта методом ЖТФЭ растворителями различной полярности и водными растворами оснований
Большинство распространенных в растениях фенольных соединений растворимо в воде, спиртах, ацетоне, этилацетате, хуже в диэтиловом эфире и нерастворимо в неполярных растворителях: петролейном эфире, н-гексане, бензоле, толуоле. При последовательном экстрагировании высушенного растительного материала растворителями возрастающей полярности возможно выделение следующих классов соединений: петролейным эфиром или бензолом извлекается основная масса хлорофилла и терпеноидные соединения; эфиром - оксикоричные кислоты, катехины, агликоны флавонолов и др.; этилацетатом -мономерные леикоантоцианы, моно- и дигликозиды флавонолов, хлорогеновая кислота и др.; этанолом и н-бутанолом - полигликозиды флавонолов, ацилированные флавоноиды, олигомерные леикоантоцианы, конденсированные фенольные соединения [125,136, 211].
Кроме того, флавоноидные соединения по своей растворимости образуют ряд, на одном конце которого стоят эфирорастворимые, но нерастворимые в воде соединения, такие как негликозидированные высокометилированные производные, а на другом - нерастворимые в эфире, но растворимые в воде гликозиды, содержащие до трех сахарных остатков. Промежуточное положение занимают спирторастворимые негликозидированные оксифлавоны, оксифлаваноны и оксиизофлавоны. Ввиду значительных различий в растворимости этих веществ в воде и органических растворителях не существует простого метода экстракции флавоноидов, идеально подходящего для выделения их из природного материала [212].
В литературе прослеживается использование нескольких вариантов экстракционного выделения и разделения соединений различной полярности. Описано первоначальное экстрагирование различного растительного материала горячей водой. В этом случае хлорофилл и большинство терпеноидов не переходит в раствор, но помимо фенольных соединений могут быть извлечены моносахара, олигосахариды, аминокислоты и растворимые белки. Компоненты водного экстракта далее извлекаются последовательно петролейным эфиром или бензолом, эфиром, этилацетатом и н-бутанолом [136]. Предложено водные экстракты для извлечения агликонов сначала обрабатывать смесью эфира с этилацетатом, затем чистым этилацетатом извлекать моногликозиды, дигликозиды - смесью этилацетата с этанолом или метанолом. Более сложные гликозиды остаются в водной фазе. Подобное фракционирование не всегда осуществимо достаточно четко и во всех случаях требует тщательного хроматографического контроля.
Авторы [119] проводят извлечение полярных флавоноидов следующим образом: материал обрабатывается водой, водным метанолом или 100% метанолом. Хлорофилл, воска и липиды удаляются из него обработкой петролейным эфиром или сильно липофильными растворителями. Очищенный таким образом экстракт может содержать еще и свободные сахара. Для разделения флавоноидов и Сахаров экстракт последовательно обрабатывается эфиром и этилацетатом. Большинство Сахаров остается в водном слое. Аг-ликоны экстрагируются в эфирный слой, гликозиды и оставшиеся агликоны - в этилаце-тат. Однако, водный остаток может содержать сильнополярные гликозиды, которые не экстрагируются этилацетатом. Флавоноиды низкой полярности могут быть получены последовательным экстрагированием н-гексаном или петролейным эфиром и одним или последовательно по полярности следующими растворителями: хлороформ, дихлорметан, эфир, этилацетат, этанол, метанол. В гексановом и петролейном экстрактах в основном содержатся только липиды. Большинство неполярных флавоноидов будет присутствовать в хлороформенном или дихлорметановом экстракте.
Однако данные схемы представляют себя трудно осуществимые в технологическом плане решения, так как нет последовательности в осуществлении процессов ЖТФЭ как классам выделяемых соединений, так и по применяемым растворителям.
Таким образом, анализируя литературу по данному вопросу, можно сделать вывод, что наиболее удобной является последовательная экстракция исходного растительного материала несколькими растворителями с возрастающей полярностью. Из растительного материала сначала выделяют с помощью неполярного органического растворителя (например, петролейного эфира, гексана, бензола, хлороформа или эфира) нефенольные неполярные вещества. Соединения фенольной природы и ГК можно затем выделить путем экстракции ацетоном, этанолом, метанолом или водой и щелочными водными растворами, причем выбор растворителя определяется числом гидроксильных групп и остатков сахара в молекуле [211].
Используют также деление фенольных соединений на "кислые" и "нейтральные". Если водный экстракт при рН 7.0-7.5 извлекать эфиром, то в эфирный слой перейдут лишь те простейшие фенольные соединения, которые не содержат карбоксильной группы ("нейтральные"). Затем водный слой подкисляют до рН 3.0-3.5 и тем же растворителем извлекают "кислые" фенольные соединения, то есть фенолкарбоновые кислоты [136]. Аналогичным образом разработаны основные методы вьщеления ГК: кислыми растворами органических растворителей или водными растворами щелочей (натриевые, калиевые и аммонийные соли ГК хорошо растворимы в воде и нерастворимы в органических растворителях).
Однако анализ сложных смесей соединений полученных растительных экстрактов часто сопряжен со значительными трудностями разделения близких по структуре гликозидов и агликонов, а также сопутствующих оксикоричных кислот, их сложных эфиров и гликозидов. Поэтому предпринимаются различные попытки комбинированных приемов, которые помогли бы упростить процессы выделения и разделения как суммарных экстрактов, так и более узких фракций соединений, объединенных строением и свойствами (или проявляемыми видами биологической активности).
Таким образом, из литературного обзора по ЖТФЭ можно сделать вывод, что пока не разработана схема экстракции, позволяющая селективно извлекать различные классы БАВ корней солодки. В связи с этим встает задача разработки методов ЖТФЭ биологически активных соединений из корня солодки с использованием накопленных способов выделения и очистки природных соединений для комплексного использования этого возобновляемого сырья, что позволит разрабатывать эффективные технологии производства лекарственных препаратов.
Одной из основных физико-химических стадий получения препарата из любого растительного сырья является экстрагирование. Экстрагирование можно проводить селективным экстрагентом (для получения индивидуального компонента) или универсальным (суммарный экстракт). Также возможно получение ряда субстанций (как индивидуальных, так и суммарных) при последовательном экстрагировании сырья несколькими селективными экстрагентами (растворителями и/или их смесями), например, возрастающей полярности. Получение продуктов более высокой степени очистки требует соответствующей технологии, и постановка ее ради одного компонента не всегда оправдывает себя. Применяемая технология должна давать возможность комплексного использования растительного сырья с максимальным извлечением различных классов БАВ.
Термодинамика фракционирования этилацетатного экстракта корня солодки
Используя данный ряд растворителей, возможно разделение ЭА экстракта на более узкие фракции по электронно-донорным свойствам компонентов. При этом аномальное положение самого этилацетата на этих зависимостях (по соответствующим параметрам AN и я) связано с тем, что в экстракте возможно содержание моногликозидов флавонои-дов, которые, по-видимому, не участвуют в ММВ с галогенсодержащими растворителями.
Разделение на фракции по растворимости не позволяет извлечь химически родственные соединения в одну фракцию; это основано на различном поведении отдельных членов гомологических рядов или других родственных групп химических соединений при взаимодействии с экстрагентом.
Заключение. Таким образом, в ходе исследования процессов выделения флавоно-идных соединений определены оптимальные параметры экстракции этилацетатом и этанолом. Равновесие в экстракционной системе устанавливается за 4-5 часов процесса. Максимальное извлечение флавоноидов достигается при соотношении фаз 1 : 4, 1 : 5 и составляет 4 и 12% для этилацетата и этанола соответственно. Выход целевого продукта повышается с ростом температуры процесса. Однако, увеличение температуры ТЖФЭ выше 40-50 С нежелательно вследствие значительных потерь экстрагента, а также возможной изомеризации флавоноидных соединений. Кроме того, при высоких температурах этанол может экстрагировать различные побочные продукты, такие, например, как сахара.
На основании данных по межфазному распределению БАВ и констант распределения между экстрагентом и твердой фазой определены основные термодинамические характеристики изучаемых систем. Процессы извлечения как агликонов, так и гликозидов флавоноидов эндотермичны (ДН 0), что связано с разрушением межмолекулярных водородных связей и малыми значениями энергии сольватации молекул флавоноидов экстра-гентами, и сопровождаются увеличением энтропии системы (100-200 Дж/(моль-К)). Изменение энергии Гиббса (AG 0 во всем изучаемом температурном интервале) в процессе выделения ГК обусловлено большим отрицательным изменением энтропии AS=-48 Дж/(моль-К)), которое намного превосходит энтальпийный фактор процесса экстракции. Это является следствием высокой сольватации молекулами экстрагента молекул ГК.
Наличие термодинамического компенсационного эффекта указывает на общность кооперативных межмолекулярных взаимодействий между экстрагентами и различными классами БАВ корня солодки.
Термодинамический подход к процессу ЖТФЭ корня солодки позволил определить возможные пути селективного извлечения различных классов БАВ в зависимости от природы экстрагента и свойств экстрагируемых соединений.
Из литературного обзора видно, что применяемые исследователями методы обнаружения, выделения, идентификации и анализа фенольных соединений, основаны главным образом на полярности гидроксильной группы ароматического кольца. Фенолы, встречающиеся в природе, являются слабыми кислотами (рКа самого фенола 9.98). Полярность фенольных соединений определяется как числом, так и стерическими особенностями оксогрупп в их молекулах. Однако, от этого правила наблюдаются значительные отклонения, связанные с индукционным и мезомерным влиянием заместителей.
Трудности, возникающие при выделении природных фенольных соединений, объясняются многообразием изомерных структур относительно гидроксильных групп ароматического кольца. Многие гидроксилсодержащие производные фенолов имеют в качестве заместителей также карбонильную, карбоксильную и другие группы. Поэтому все виды фенольных соединений, содержащихся в корне солодки, практически невозможно выделить за одну или две стадии экстракции или сорбции.
Для качественной оценки содержания флавоноидов ЭА экстракт был предварительно изучен методом жидкостной распределительной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием УФ-детектирования в диапазоне длин волн 220-377.5 нм. Первоначально экстракт был фракционирован на БіС -колонке на 19 фракций. Затем каждая фракция пере-хроматографирована на колонке Сів в системе метанол-вода СН3ОН-Н2О (9:1). Качественную идентификацию компонентов фракций, разделенных хроматографически, проводили только по тем соединениям, содержание которых (по площади соответствующего пика на хроматограмме) было более 2% от суммарной площади пиков. Это позволило сделать предположение, что число основных компонентов в этилацетатном экстракте не более 20. Причем только первые фракции дали довольно четкое разделение компонентов - 3-4 компонента в каждой фракции при достаточно небольшом времени удерживания (TR). Начиная с четвертой, каждая фракция является сложной многокомпонентной системой. Кроме того, наблюдается распределение некоторых компонентов между фракциями.
Применение приборов с большой скоростью сканирования (хроматограф + ЭВМ), позволяющей записывать УФ-спектры соответственно в нескольких частях хроматогра-фического пика, позволило использовать полученные данные для идентификации компнентов изучаемых фракций. Анализ электронных спектров поглощения (ЭСП) показал, что большинство компонентов этилацетатного экстракта имеют полосы поглощения в коротковолновой области, и лишь незначительная часть - в области X 330 нм. Однако, четкое отнесение полос поглощения УФ-спектров узких фракций, полученных при разделении методом ВЭЖХ к определенному классу фенольных соединений невозможно. Поэтому нами была разработана схема предварительного разделения фенольных соединений этилацетатного экстракта в зависимости от их полярности (схема на Рис. 2.3.) и кислотно-основных свойств (схемы на Рис. 2.4. и 2.5.)
Согласно схеме, приведенной на Рис. 2.4., ЭА экстракт был обработан сначала ДХЭ. При этом ЭА экстракт разделился на две части: слабополярные соединения перешли в ДХЭ (около 60%), более полярные - составили нерастворимый остаток (40%).
Для дальнейшего фракционирования была взята растворимая в ДХЭ часть ЭА экстракта. Исследуемую часть ЭА экстракта, растворенную в ДХЭ, последовательно экстрагировали водными растворами карбоната натрия и щелочи (NaOH) с целью разделения соединений, обладающих различными кислотно-основными свойствами.
Материальный баланс фракционирования по схеме 2.4. приведен в Табл. 4.1. Как видно из данных Табл.4.1. относительно более полярная часть ЭА экстракта составила порядка 40% (экстракт 0). Остальные компоненты, перешедшие в ДХЭ, распределились следующим образом. Извлеченные водным раствором карбоната натрия и, следовательно, так называемые "кислые" соединения, составили 14-15% (экстракты XI и XIV). Количество "слабокислых" фенолов, проэкстрагированных NaOH, оказалось несколько выше - 23% (экстракты VIII и ГХ). Практически "нейтральные" соединения сконцентрировались в экстракте VI - 13%. Таким образом, "слабокислые" фенольные соединения составляют основную часть ЭА экстракта, растворимого в ДХЭ.
Экстракционное разделение ЭА экстракта водными растворами оснований
Несмотря на то, что вышеописанная предварительная обработка суммарного ЭА экстракта является необходимым этапом, значительно улучшающим дальнейшее хромато-графическое разделение отдельных фракций, анализ результатов показал, что экстрагирование двумя основаниями не дало нужного разделения экстракта. Большинство феноль-ных соединений, содержащихся в ДХЭ экстракте, являются по кислотно-основным свойствам более "кислыми", чем предполагалось в начале. Поэтому для более четкого разделения фенольных соединений по их кислотным свойствам было увеличено число экстра-гентов с более широким диапазоном основных свойств.
Растворенный в этилацетате ЭА экстракт последовательно экстрагировали 1 н водными растворами ацетата натрия, гидрокарбоната натрия, карбоната натрия и едкого натра согласно методике, описанной во II главе. Результаты проведенного фракционирования приведены в таблице 4.6. Как видно из таблицы, распределение этилацетатного экстракта зависит от кислотности соединений, присутствующих в нем, и полярности растворителя. Нерастворившийся в щелочных экстрагентах остаток этилацетатного экстракта составляет 76%. После контакта этилацетатного экстракта с щелочными экстрагентами органическая фаза была промыта дистиллированной водой (1:1). При этом на границе раздела образовалась промежуточная фаза, содержание которой 22%. Возможно, что этот слой составляют натриевые соли полифенольных соединений.
Соединения ЭА экстракта, обладающие сильно кислыми свойствами и, следовательно, проэкстрагированные ацетатом натрия, составляют 1.16%. Баланс фракций, извлекаемых из подкисленного до рН 1 ацетатного водного раствора органическими растворителями различной полярности, показывает, что 2/3 соединений переходит в полярные растворители (хлороформ и этилацетат), а остальные распределяются по убывающей между четыреххлористым углеродом, дихлорэтаном и хлористым метиленом. Соответствующие органические фракции, из-за их небольшого количества, препаративно не разделяли и идентификацию осуществляли хроматографией в тонком слое и УФ-спектроскопией. В таблице 4.7 приведены УФ-спектральные характеристики данных фракций, а в таблице 4.8 - данные ТСХ-анализа на пластинках "Silufol". Как видно из таблиц, все извлеченные органическими растворителями фракции из растворимой в ацетате натрия части этилацетатного экстракта имеют одинаковые максимумы поглощения в Уф-спектрах в области 250-260 и 281-288 нм, за исключением фракции четыреххлористого углерода, которая имеет дополнительный максимум в коротковолновой УФ-области при 208 нм, и этилацетатной фракции с дополнительными максимумами при 312.5 и 362 нм.
При рассмотрении данных ТСХ (таблица 4.8.) было обнаружено в ССЬгфракции 7 пятен, соответствующих фенольным соединениям; на хроматограммах C2H4CI2-, СНгСЬ- и СНСІз-фракций бьшо обнаружено по 1-3 пятна с идентичными Rf (0.08-0.40). Пятно с фиолетово-голубой флуоресценцией (Rf -0.07 в системе ацетон-гексан 1:1) присутствует на хроматограммах всех четырех фракций. В парах аммиака оно приобретает голубовато-зеленую окраску, что соответствует производным фенолкарбоновых кислот. На основании сравнения с литературными данными можно предположить, что это кофейная или хлорогеновая кислоты. ТСХ-исследование этилацетатной фракции показало, что она содержит большее число компонентов по сравнению с вышеупомянутыми фракциями. Сине-голубые флуоресцирующие в УФ-свете ( 280 нм) пятна соответствуют производным флавона и изофлавона; желтое в видимом и темно-коричневое в УФ-свете пятно (Rf), как и наличие в спектре максимума поглощения при X = 362 нм, является характерным для халконов. Кроме того, максимумы полос поглощения в УФ-спектре этилацетатной фрак-ции-225, 261, 312.5 нм - указывают на наличие хромофора 7-оксикумарина.
В гидрокарбонате натрия также растворились соединения, обладающие значительными кислотными свойствами, но, как показывают данные таблицы 4.6, их содержание несколько больше - 2.90%. Баланс фракций, извлекаемых из подкисленного до рН 1 водного раствора гидрокарбоната натрия органическими растворителями различной полярности, показывает, что основная часть компонентов распределяется между слабополярнымы (четыреххлористый углерод, дихлорэтан) растворителями и полярным этилацетатом. CH2Q2- и СНСЬ-фракции суммарно содержат 7% от всех извлеченных гидрокарбонатом натрия соединений. Как видно из данных таблицы 4.7 полученные фракции имеют почти одинаковые УФ-спектры, за исключением спектра поглощения этилацетатной фракции (ктах- 202, 227-229, 254-259, 276-281, 312-318 нм). Спектр поглощения этилацетатной фракции отличается соотношением максимумов при 259, 276 и 312.5 нм. Качественный состав полученных фракций был исследован хроматографически на пластинках "Silufol". Данные таблицы 4.9 показывают, что аналогичны не только УФ-спектры CCI4-, C2H4CI2-, СНгСЬ- и СНСІз-фракций, но и хроматограммы, полученные при их разделении (за исключением нескольких компонентов, которые отсутствуют в той или иной фракции). Каждая из перечисленных фракций при .разделении дает 9-Ю пятен, соответствующих фенольным соединениям. Общими для всех фракций являются пятна с Rf (0.043, 0.238, 0.352, 0.542, 0.614), наблюдаемые на хроматограммах в УФ-свете в виде ярко флуоресцирующих фиолетовых и голубых пятен. Нахождение одних и тех же компонентов во фракциях, соответствующих растворителям с различной полярностью, говорит об их перераспределении при жидкостной экстракции подкисленного до рН 1 водного раствора бикарбоната натрия. Характерная флуоресценция пятен позволяет предположить присутствие фенолкарбонових кислот, что согласуется с литературными данными по их отделению от других фенольных соединений экстракцией насыщенным раствором бикарбоната натрия [211]. Поскольку нами проводилась лишь качественная оценка компонентов полученных фракций, можем предположить наличие кофейной и хлорогеновой кислот, а также их производных.
У сине-фиолетовых пятен с Rf 0.542, 0.645 и 0.982 наблюдается усиление флуоресценции в УФ-свете после обработки хроматограммы парами аммиака, что может быть связано с присутствием производных кумарина.
Таким образом, обработка этилацетатного экстракта водными растворами ацетата натрия и гидрокарбоната натрия дает возможность отделить значительную часть так называемых "кислых" соединений (в том числе фенолкарбонових и оксикоричных кислот), хотя их общее содержание в этилацетатном экстракте незначительно - 4%.
Данные таблицы показывают, что более щелочной реагент - водный раствор карбоната натрия - извлекает 5% соединений этилацетатного экстракта, которые проявляют более слабые кислотные свойства, по сравнению с компонентами, рассмотренными ранее (растворившиеся в ацетате и гидрокарбонате натрия). Экстрагирование подкисленного до рН 1 водного раствора растворителями различной полярности показало (таблица 4.6.), что извлекаемые карбонатом натрия соединения в основном распределились между двумя растворителями: дихлорэтаном - 70% и этилацетатом - 22%. Переход основной массы экстракта в растворители неполярного и слабополярного характера (четыреххлористый углерод, дихлорэтан, хлористый метилен) говорит о преимущественном содержании в нем слабополярных соединений. Более полярные компоненты извлекаются хлороформом и этилацетатом.
