Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
Иммуносупреесивнаятерапия: перспективыразвития 11
Флавоноидьгкак потенциальный источник для изыскания новых лекарственных средств
1.2.1. Флавоноиды - структурно-разнообразные полифенолы растений
1.2.2. Флавоноиды регулируют транскрипцию генов, влияя на ак- 18 тивность внутриклеточных сигнальных молекул
1.2.3. Фармакология флавоноидов: существующие лекарственные препараты, проблемная фармакокинетика
2.4. Единство и борьба противоположных фактов: флавоноидыиммуностимуляторы или иммуносупрессанты?
-2.4.1. Флавоноиды и механизмы врожденного иммунитета 25
1.2.4.2. Флавоноиды и адаптивный иммунный ответ 30
Глава 2. Материалы и методы исследования 36
2-1. Поэтапная схема постановки экспериментов 36
2.2. Лабораторные животные 36
2.3. Тестируемый агент и его стандартизация 38
2.4. Выделение лимфоцитов из периферической крови человека Приготовление суспензии клеток лимфоидных органов
2.6. Иммуномагнитная сепарация 41
2.7. Определение действующих концентраций активирующих агентов (митогенов) " 42
2.8. Оценка пролиферации-лимфоцитов, индуцированной различными митогенами 43
2.9: Оценка «раннего» апоптоза и некроза 44
2.10. Оценка «позднего» апотоза 44
2.11. Модель контактной чувствительности 45
2.12. Адоптивный перенос контактной чувствительности 46
2.13. Оценка уровня секреторных цитокинов 48
2.14. Статистическая обработка результатов 49
Глава 3. Результаты собственных исследовании
3.1. Влияние ФКС на ростовые характеристики (пролиферация, апоптоз) активированных лимфоцитов
3.1.1. Оценка .влияния ФКС на пролиферацию митоген-активированных МНК in vitro
3.1.2. Влияние предобработки ФКС in vivo на митоген-стимулированную пролиферациию МНК мышей ex vivo
3.1.3. Влияния ФКС на «поздний» апоптоз митоген-активированных МНК
3.1.4. Изучение влияния ФКС ни секрецию цитокинов активированными МНК
3.2. Изучение эффективности ФКС в реакции КЧ 59
3.2.1. Влияние ФКС на развитие отека уха у мышей в реакции КЧ 5 9
3.2.2. Влияние ФКС на пролиферативную активность и абсолютное количество МНК регионарных лимфоузлов в модели КЧ
3.2.3. Влияние введения ФКС на ранних сроках после ДНФБ-сенсибилизации на секрецию цитокинов МНК регионарных 64 лимфоузлов
3.3. Изучение механизмов иммуносупрессивного эффекта ФКС в реакции контактной чувствительности
3.3.1. Влияние ФКС на функциональную активность лимфоцитов- ,fi эффекторов в реакции КЧ 3.3.1.1. Оценка проапоптогенного эффекта ФКС по отношению к лимфоцитам-эффекторам КЧ
3.3.1.2. Влияния ФКС на способность спленоцитов, сенсибилизированных ДНФБ мышей, адоптивно переносить КЧ
3.3.1.3. Влияние ФКС на способность Т- лимфоцитов ДНФБ- сенсибилизированных мышей адоптивнопереносить КЧ
3.3.1.4. Влияние ФКС на способность субпопуляций Т-лимфоцитов адоптивно переносить КЧ
3.3.1.5. Влияние ФКС на адоптивный перенос КЧ комбинацией CD4+-и CD8+-лимфоцитов.
Глава 4. Обсуждение результатов 78
Выводы 89
Список литературы
- Флавоноиды регулируют транскрипцию генов, влияя на ак- 18 тивность внутриклеточных сигнальных молекул
- Определение действующих концентраций активирующих агентов (митогенов)
- Влияние предобработки ФКС in vivo на митоген-стимулированную пролиферациию МНК мышей ex vivo
- Оценка проапоптогенного эффекта ФКС по отношению к лимфоцитам-эффекторам КЧ
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Переход исследований в медицине на молекулярный уровень привел к накоплению в последние десятилетия многочисленных данных, позволивших детально описать патогенез целого ряда заболеваний. Важнейшим достижением данного этапа исследований стало выявление и характеристика молекул, появление которых либо сопутствует патологическому процессу, либо играет ведущую роль в его возникновении (молекулярные маркеры заболевания и/или «патологические молекулы»). Принципиальное изменение ситуации произошло в связи с завершением интенсивных исследований в иммунологии, биотехнологии и молекулярной биологии. В результате развития этих областей сформировалась унифицированная идеология, так называемой, прицельной или мишень-направленной терапии. В связи с этим поиск новых таргетных лекарственных средств, способных селективно корригировать ключевые звенья патогенеза того или иного заболевания приобретает все большую актуальность.
Одним из перспективных направлений в этой области является разработка менее токсичных и более специфичных иммуносупрессивных лекарственных средств. В настоящее время в качестве иммуносупрессантов широко используются цитостатики, глюкокортикостероиды и ингибиторы кальциневрина. Цитотоксические противоопухолевые препараты (иммуносупрессанты первого поколения) неизбирательно воздействуют на любые клетки, находящиеся в процессе деления. Этим объясняется наличие у этого класса лекарственных препаратов большого числа побочных эффектов. Внедрение ингибиторов кальциневрина (циклоспорин А, такролимус) явилось важным шагом в направлении создания более избирательных препаратов, однако побочные эффекты этого класса лекарственных средств все еще значительны. В тоже время идеальный иммуносупрессант должен обладать избирательным действием на отдельные субпопуляции лимфоцитов, не вызывая повреждения как других клеток организма, так и клонов лимфоцитов, осуществляющих реакции противоинфекционного и противоопухолевого иммунитета. Иначе говоря, действие препарата должно быть направлено преимущественно на антиген-специфические клетки, принимающие участие в патологических реакциях приобретенного иммунитета. В настоящее время на роль идеального иммуносупрессанта претендуют моноклональные антитела (МАТ), ингибиторы внутриклеточных сигнальных молекул и так называемые «переключатели иммунного ответа».
Вещества растительного происхождения всегда являлись интересным источником для создания новых лекарственных средств. Пристальное внимание исследователей в последнее время уделяется изучению флавоноидов – большой группы полифенольных соединений, присутствующих практически во всех высших растениях. Результаты многочисленных исследований демонстрируют, что эти вещества обладают широким диапазоном фармакологических активностей, проявляя противовоспалительные, иммунотропные, антиканцерогенные и другие эффекты [Евстропов А.Н., 2004, ., 2010, Chang C.L., 2010, Jin S., 2010, Lamoke F., 2011, Singh R.P., 2006]. Изучение механизмов действия флавоноидов на молекулярном уровне показывает, что некоторые их классы (изофлавоны, халконы) способны эффективно ингибировать фосфорилирование, а как следствие и активацию, ключевых молекул сигнальных путей в животных клетках. Ряд работ свидетельствуют об иммуностимулирующем действии некоторых флавоноидов в моделях in vivo [., 2010, Sakai T., 2010]. Несмотря на многочисленные исследования иммунотропных эффектов флавоноидов, на сегодняшний день отсутствует единая концепция, объясняющая их механизмы действия.
В связи с этим актуальным является изучение механизмов иммунотропной активности флавоноидов и экспериментальное обоснование их фармакологической эффективности в моделях на животных.
Цель исследования: изучение на доклиническом уровне иммуносупрессивных эффектов флавоноидов корня солодки (ФКС).
Задачи исследования:
-
Изучить влияние ФКС на индуцированную пролиферацию и оценить проапоптогенный эффект данного препарата по отношению к митоген-активированным человеческим и мышиным мононуклеарным клеткам.
-
Оценить влияние ФКС на продукцию цитокинов активированными мононуклеарными клетками мышей.
-
Изучить эффективность ФКС в реакции контактной чувствительности, индуцированной 2,4-динитрофторбензолом у мышей.
-
Исследовать влияние ФКС на пролиферативный ответ и функциональную активность иммунокомпетентных клеток на ранних сроках после сенсибилизации 2,4-динитрофторбензолом.
-
Изучить влияние ФКС на функциональную активность лимфоцитов-эффекторов в реакции контактной чувствительности.
Научная новизна исследования
Впервые было проведено исследование фармакодинамических эффектов флавоноидной фракции экстракта корня солодки в моделях, рекомендованных для доклинического изучения новых фармакологических веществ с иммунотропной активностью.
Впервые был продемонстрирован антипролиферативный эффект ФКС in vitro в отношении митоген-активированных человеческих и мышиных Т-лимфоцитов. Было доказано, что антипролиферативный эффект ФКС не связан с индукцией апоптоза, но обусловлен модулирующим действием на продукцию цитокинов: наблюдается подавление секреции ИЛ-2 и ИФН, и повышение уровня ИЛ-6 и ИЛ-17.
Впервые было показано, что ФКС ингибирует развитие реакции контактной чувствительности, индуцированной 2,4-динитрофторбензолом у мышей.
Впервые было показано, что внутривенное введение ФКС на ранних сроках после сенсибилизации 2,4-динитрофторбензолом приводит к снижению, как абсолютного числа клеток регионарных лимфоузлов, так и к подавлению их пролиферативного ответа в системе in vitro. Это коррелирует с изменением цитокинового баланса: наблюдается уменьшение секреции ИЛ-2, ИФН и ИЛ-4 и увеличение продукции ИЛ-10 и ИЛ-17 клетками регионарных лимфоузлов, что может свидетельствовать о способности флавоноидов солодки переключать Th1/Th2 иммунные ответы в процессе развития контактной чувствительности на формирование Th17-лимфоцитов.
Впервые показано, что на поздних сроках после ДНФБ-сенсибилизации, обработка ФКС суммарной фракции спленоцитов, а также выделенных из нее с помощью иммуномагнитной сепарации T-клеток, приводит к блокаде адоптивного переноса реакции контактной чувствительности несенсибилизированным сингенным мышам-реципиентам.
Впервые было показано, что блокирующий эффект ФКС не наблюдается в случае обработки CD8+ лимфоцитов-эффекторов, выделенных из спленоцитов сенсибилизированных животных. Воспроизведение блокирующего эффекта ФКС, происходит только после обработки CD4+-популяции и последующего ее адоптивного переноса совместно с CD8-эффекторами несенсибилизированным мышам-реципиентам.
Практическая значимость работы
Совокупность полученных в работе данных углубляет фундаментальные представления о механизмах развития иммунного ответа.
Растительное происхождение, большое количество ранее установленных биологических эффектов, а также выявленные принципиально новые механизмы действия флавоноидов корня солодки открывают перспективу их дальнейшего изучения в качестве иммуносупрессивных лекарственных препаратов.
В работе подобран комплекс методов, позволяющих оценивать иммунотропную активность и эффективность новых фармакологических агентов.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и патологии» (Новосибирск, 2010), Национальной конференции: «Аллергология и клиническая иммунология – практическому здравоохранению» (Москва, 2010), 2nd European Congress of Immunology: “Immunity for Life, Immunology for Health” (Berlin, Germany, 2009), V World Congress of Immunopathology and Respiratory Allergy (Tel Aviv, Israel, 2009), VI Georgian Congress of Allergology and Immunology, VI International Congress “Health and Drug” (Tbilisi - Tskhaltubo, Georgia, 2010), III World Asthma & COPD Forum, World Forum of Pediatrics (Dubai, UAE, 2010).
Работа апробирована на совместном заседании кафедры фармакологии педиатрического факультета, кафедры иммунологии МБФ и отдела иммунологии ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Росздрава». По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе в изданиях рекомендованных ВАК РФ – 8.
Внедрение результатов исследования
Результаты диссертации внедрены в учебный процесс на кафедре фармакологии ГОУ ВПО «Севоро-Осетинская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития».
Разработанные в диссертации модели и методы используются в экспериментальной работе кафедры и отдела иммунологии ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Росздрава» и отдела молекулярной и экспериментальной гематологии, онкологии и иммунологии ФГУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава.
Структура и объем диссертации
Флавоноиды регулируют транскрипцию генов, влияя на ак- 18 тивность внутриклеточных сигнальных молекул
Флавоноиды, представляют собой одно из самых разнообразных (более 4000 представителей) семейств вторичных метаболитов растительной клетки. На сегодняшний день они рассматриваются-как активные метаболиты клеточного обмена растений, выполняющие важную роль во многих физиологических процессах: фотосинтезе, дыхании, формировании устойчивости к инфекционным агентам [45, 108, 119]. Большинство из таких соединений определяют пигментацию различных частей растений и выполняют роль фильтра, поглощающего свет в коротковолновой части спектра (280-320 нм), вследствие чего защищают фотосинтезирующий аппарат клетки от повреждающего воздействия УФ-радиации.
По химической структуре флавоноиды относятся к полифенольным соединениям. В основе их структуры лежит скелет, состоящий из двух бензольных колец, соединенных между собой трехуглеродной цепочкой. Это приводит к образованию Сі5-гетероцикла, где кольцо В углеродного скелета представлено фенилаланином, а кольца А и С - результат конденсации 3 молекул малонил-КоА в процессе биосинтеза молекулы флавонои-да в растениях (рисунок 1.2). Положение заместителей в углеродных кольцах В и С обусловливает структурное разнообразие (рисунок 1.3) этого класса соединений, тогда как кольцо А за некоторым исключением имеет относительно консервативную структуру [6, 20].
На рисунках 1.2 и 1.3 показаны общие структурные формулы фла-воноидов и их некоторых подклассов, которые не связанны с молекулой сахара (агликоны). Однако в растениях эти соединения часто представлены также и в виде гликозидов, т. е. могут быть связанными с одной или более молекулой сахара. Присоединение углеводных остатков влияет на физико-химические свойства флавоноидов. В то время как агликоны характеризу но
Стуктурное разнообразие флавоноидов. Основные подклассы. " ются высокой липофильностью и, как правило, нерастворимы в воде, гликозиды флавоноидов, содержащие более трех остатков сахара, наоборот, растворяются в воде, но не в полярных органических растворителях. Гликозиды флавоноидов могут подвергатьсякислотному и ферментативному гидролизу. Огликозиды при действии-минеральных кислот и ферментов легко гидроли-зуются до агликона и углеводного остатка. С-гликозидьк очень стойкие и с трудом расщепляются под действием концентрированных кислот [6].
Плохо поддается классификации принадлежность подклассов или. отдельных .флавоноидов к тому или иному семейству высших растений. Даже отдельные семейства растений характеризуются исключительным многообразием типов полифенольных соединений, синтезируемых в их представителях (таблица 1.2). Во многих литературных источниках отмечается; что наиболее богаты флавоноидами растения семейства бобовых [20].
Подклассы флавоноидов Представители Растение-источник или продукт питания Флаванолы КатехинГаллокатехинЭпикатехингаллат чай, красный виноград, красное вино, какао бобы, шоколад Флаваноиы Гесперидин Нарингенин Ликвиритигенин растения семейства цитрусовых: апельсин; лимон и др. корень солодки Флавоны Апигенин Лютеолин листья зелени (петрушка и др.) Флавонолы КверцетинМирицетинКемпферол яблоки, томаты, лук, брокколи и др. Антоцианидины ДельфинидинПетунидинЦианидин ягоды: (земляника, клубника, черника и др.) Изофлавоноиды Генистеин ДайдзеинИзоликвиритигенин Глабридин растения семейства бобовых: бобы сои корень солодки 1.2 .2. Флавопоиды регулируют транскрипцию генов, влияя на активность внутриклеточных сигнальных молекул
Исследования; проведенные в последние десятилетия демонстрируют, что флавоноиды, а также некоторые ферменты, участвующие в их биосинтезе, локализуются в различных компартментах, включая ядерный аппарат растительной клетки [118]. Тот факт, что некоторые флаван-3-олы связываются с гистонами в клеточном ядре растений, сформировал предположение о том, что подобные молекулы могут модулировать транскрипцию генов [109] и, по-видимому, не только в самой растительной клетке. Так, флавоноиды экссудата корней бобовых растений регулируют транскрипцию генов у азотфик-сирующих клубеньковых бактерий, выполняя роль индукторов образования сигнальных молекул (Nod-факторов: липохитоолигосахаридов) в процессе становления симбиоза растения и микроорганизма [65]. Интересно, что сек-ретируемые липохитоолигосахариды, действуя через специфические рецепторы и инициируя Са2+-зависимый сигнал, опосредуют подавление иммунных реакций растительной клетки, что необходимо на ранних этапах становления симбиоза, в то время как структурные аналоги Nod-факторов - N-ацетилхитоолигосахариды (компоненты хитина грибов) запускают активацию защитных механизмов клетки растения [42].
В животных клетках флавоноиды не обнаруживаются, однако огромное количество экспериментов посвящено их исследованию именно в этих биологических системах. В литературе в качестве возможного механизма действия флавоноидов рассматривается их способность ингибиро-вать активность многих ферментативных систем in vitro (таблица 1.3).
Также, в условиях in vitro продемонстрирована возможность влияния различных флавоноидов на транскрипцию генов у млекопитающих, посредством влияния на активность гистонов или топоизомераз [100, 143].
Известно, что фосфорилирование гистонов осуществляется по сери-новым остаткам и коррелирует с активацией генов в клетках млекопитаю щих. В остеокластах крыс кверцетин ингибировал фосфорилирование гис 5 тона НІ [100]; тогда как в человеческих клетках, содержащих мутантную АТМ-протеинкиназу кверцетин и генистеин, наоборот, индуцировали \ фосфорилирование гистона Н2АХ по серину139 [143]. Функция нормаль ной АТМ-киназы состоит в остановке клеточного цикла при выявлении локальных дефектов хроматина в процессе репарации ДНК-разрывов. Му-тация АТМ-киназы, приводящая, к снижению ее фосфорилирующей активности в отношении гистонов; наблюдается при наследственном синдроме атаксии-телеангиоэктазии, который характеризуется повышенной чувствительностью к ионизирующей радиации.
Определение действующих концентраций активирующих агентов (митогенов)
Биологическая стандартизация исследуемого агента (ФКС) проводилась с использованием клеточной линии человеческой гистиоцитарнои лимфомы U937 (CRL-1593.2, АТЄС). Для проведения опытова /? vitro клеточную линию U937 вели как суспензионную культуру, которую поддерживали культивированием- в среде RPMI-1640 с 10% эмбриональной телячьей сывороткой, 10-мМ Хепес-буфера (рН 7,2) и антибиотиками: 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (полная средаіКРМІ-1640), при 37С и 5% содержании углекислого газа в окружающем воздухе. Для поддержания экспоненциального роста клеточную культуру пассировали каждые 4-5 дней. Проводили оценку влияния ФКС на пролиферативную активность опухолевых клеток. Было показано дозозависимое подавление . пролиферации, при этом уровень пролиферации 40±2% соответствовал концентрации ФКС 10 мкг/мл в пересчете на галловую кислоту.
В экспериментах in vivo ФКС вводили внутривенно или внутрибрю-шинно в дозе 10 мг/кг в изотоническом растворе натрия хлорида с 5% содержанием этанола. Мышам контрольной группы вводили соответствующие объемы растворителя. В опытах in vitro в культуру клеток вносили ФКС в диапазоне концентраций 0,1 — 20 мкг/мл, так, чтобы финальная концентрация этанола не превышала 1%. В контрольные лунки добавляли соответствующие объемы высокоочищенного этанола.
Для экспериментальных исследований использовали кровь здоровых добровольцев. Критерием отбора доноров было отсутствие инфекционных и аллергических заболеваний. Кровь забирали из локтевой вены доноров в пробирки, содержащие 2,7% раствора натриевой соли ЭДТА (рН 7,2-7,4). Выделение лимфоцитов проводили по методу Вбушп [23]. Все процедуры выделения лимфоцитов осуществляли в стерильных условиях при комнатной температуре. Цельную кровь разводили фосфатно-солевым буфером (ФСБ) (ПанЭко, Россия) в соотношении 1:3 и, после перемешивания, о сгорожно с помощью шприца с длинной иглой наслаивали на раствор фиколл-урографина плотностью 1,077 г/см3 (24 части 9% раствора фиколла (Pharmacia, Швеция) и 10 частей 34% раствора, урограф ина (Schering, Германия)). Пробирки центрифугировала в. бакетном роторе в течение 30-35 мин. при 400 g и 20С на центрифуге TJ-6 (Beckman, Германия). Мононуклеарные клетки (МНК), образующие мутное кольцо в интерфазе, собирали и переносили в центрифужные пробирки (следовое количество эритроцитов лизировали раствором Бройля) и производили два последовательных центрифугирования (300 g, 10 мин.) со сменой ФСБ. После этого супернатант удаляли, а осадок МНК ресуспензировали в 1 мл полной среды. Количество выделенных клеток подсчитывали в камере Горяева по стандартной методике.
Для выделения селезенок мышей, у животных удаляли кожу на левом боку, делали разрез длиной около 1 см, осторожно извлекали орган пинцетом и отпрепарировали ножницами. Селезенки помещали в чашки Петри содержащие 2 мл среды RPMI-1640. Во время манипуляций чашки Петри находились при температуре таящего льда. Суспензии спленоцитов готовили методом щадящей гомогенизации, затем фильтровали через капроновый фильтр в пробирки для удаления стромальных элементов и клеточных агрегатов. Далее клеточные суспензии отмывали двухкратно путем центрифугирования (300 g, 10 мин.). Супернатант удаляли. Осадок клеток смешивали с охлажденным раствором Бройля (0 84% NH4CI, Хепес-буфер 10 мМ, 1 кристалл фенолового красного) в пропорции 1:9, инкубировали в течение 1-2 мин. при постоянном помешивании при комнатной температуре. Затем суспензию клеток дважды отмывали от раствора Бройля центрифугированием в неполной культуральной среде. Осадок ресуспензиро вали в полной среде RPMI-1640, и подсчитывали абсолютное количество ядросодержащих клеток в камере Горяева. При подсчете клеток, присутствовавшее в пробах незначительное количество эритроцитов лизировали 3% уксусной кислотой.
Для выделения лимфоузлов у мыши делали разрез кожи по срединной брюшинной линии и осторожно извлекали паховые лимфоузлы пинцетом. Суспензию клеток готовили также, как и для спленоцитов, за исключением лизиса эритроцитов раствором Бройля.
Для получения отдельных популяций спленоцитов использовали метод негативной селекции и набор реактивов Dynal Mouse Negative Isolation Kit (Invitrogen Dynal AS, Норвегия) (рисунок 2.2). Для сепарации отдельной популяции лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+) из 107 клеток, к суспензии спленоцитов в 100 мкл «буфера 1» (ФСБ без Са2+ и Mg2+, 0,1% фетальної! сыворотки, 2 мМ ЭДТА, рН 7,4) добавляли 20 мкл смеси моноклональных антител против поверхностных антигенов клеток, которые следовало удалить. После тщательного перемешивания, содержимое пробирки оставляли инкубироваться 20 мин при 4С. На следующем этапе клетки отмывали, добавлением 2 мл «буфера 1» и центрифугированием (300 g, 8 мин.) при 4С. После отбора супернатанта клетки ресуспензировали в 800 мкл «буфера 1». Следующим шагом было добавление парамагнитных полимерных микрочастиц Dynalbeads и инкубация с постоянной ротацией в течение 15 мин. при 18-25С. Затем содержимое пробирки разбавляли добавлением 1 мл «буфера 1» и оставляли в магнитном поле штатива DynalMag-2 (Invitrogen Dynal AS, Норвегия) на 2 мин. После чего собирали супернатант, содержа-щий интересующую популяцию клеток, не прикрепившуюся к полимерным микрочастицам, и отмывали центрифугированием. На заключительном этапе клеточную популяцию ресуспендировали в растворе Хенкса с добавле нием 10 мМ Хепес-буфера и после подсчета, обрабатывали 20 мкг/мл ФКС т vitro в течение 30 мин в условиях термостатата при 37С, 5% С02 и 100% влажности. Затем отмытые от ФКС клетки вводили внутривенно медленно экспериментальным животным в объеме 0,5 мл.
Влияние предобработки ФКС in vivo на митоген-стимулированную пролиферациию МНК мышей ex vivo
В. литературе описано несколько?способов активации лимфоцитов in viti o. Среди них наиболее часто используется митогенная стимуляция и стимуляция с помощью моноклональных антител, направленных против анти-ген-распознающих рецепторов. В настоящей работе в качестве агентов для стимуляции человеческих МНК использовали - фитогемагглютинин (ФЕА) и анти-СЭЗ антитела, для мышиных клеток - конканавалин А (КонА).
Для оценки влияния ФКС на пролиферацию МНК преинкубировали в 96-луночном планшете в присутствии оптимальной концентрации митогенов в течение 24 ч. Затем в лунки вносили;ФКС в концентрациях 0,1-20 мкг/мл и продолжали инкубацию1 еще в течение; 48і ч. Каждую концентрацию тестировали в четырех повторах. Радиоактивную метку вносили за 16 часов до сбора клеток, после чего оценивали включение 3Н-тимидина в ДНК. Результат выражали в процентах по отношению к контролю.
На первом этапе исследовали влияние ФКС на пролиферативный" ответ активированных мышиных МНК. В экспериментах использовали спленоциты, выделеннные из мышей-самцов трех линий: СВА, BDF и BALB/c. Как демонстрируют результаты, внесение ФКС в опытные лунки дозозависимо подавляло пролиферацию КонА-активированных МНК. -Следует отметить, что при этом не наблюдалось зависимости антипроли-феративного эффекта от принадлежности спленоцитов к той или иной линии мышей, поэтому результаты. всех серий экспериментов были усреднены и представлены в виде одной кривой на рисунке 3.1; Рисунок 3.1. Влияние ФКС на пролиферацию КонА-активированных мышиных МНК.
Исследуемый препарат флавоноидов даже в концентрации 1 мкг/мл достоверно (р 0,05) подавлял пролиферацию МНК более чем на 40% (57,5±6,0%). Таким образом, концентрация 1 мкг/мл приближалась к значению ИК5о (концентрация, ингибирующая пролиферацию на 50% от максимального эффекта) для ФКС. Эффект ФКС в концентрации 0,1 мкг/мл составил - 103,5±2,8%, что не имело достоверных различий в сравнении с контрольными значениями. ФКС в дозе 20 мкг/мл практически полностью блокировали пролиферативный ответ мышинных МНК, индуцированный митогенами, что составляло 7,8±1,5% от контрольных значений.
Следующим этапом стала оценка влияния ФКС на пролиферацию МНК человека, активированных Т-клеточными митогенами. Как и в случае КонА-активированных мышиных спленоцитов, ФКС проявили in vitro до-зозависимую антипролиферативную активность по отношению к ФГА- и aHTH-CD3-стимулированным МНК человека (рисунок 3.2). Однако анти-пролиферативный эффект препарата был несколько ниже. Так, в присутствии ФГА ФКС в концентрации 1 мкг/мл вызывали угнетение пролиферации человеческих МНК, что составило 82,6±4,5% от контрольного показателя. С увеличением концентрации эффективность ФКС статистически достоверно (р 0,05) повышалась: в концентрации 5 мкг/мл уровень пролиферации составил 64,0±5,0%, 10 мкг/мл - 46±7,0%, 20 мкг/мл - 23,5±0,5%.
Похожая закономерность была выявлена при инкубации ФКС с анти-CD3 -стимулированными МНК человека. Результаты графика демонстрируют дозозависимые изменения эффекта, с пиковым ингибирующим значением в концентрации 20 мкг/мл.
Таким образом, результаты экспериментов по изучению антипроли-феративных эффектов ФКС in vitro позволяют заключить следующее: 1. ФКС эффективно подавляют пролиферацию митоген-активированных МНК in vitro 2. В диапазоне концентраций 1-20 мкг/мл наблюдается дозозависимый антипролиферативный эффект 3. Не выявлено межвидовых (человек - мышь) или межлинейных (СВА, BDF и BALB/c) различий в проявлении антипролиферативной активности ФКС in vitro.
Следующим шагом в изучении, антипролиферативных эффектов фла-воноидов стало использование экспериментальной модели, в которой МНК «обрабатывались» ФКС in vivo с последующей их эксплантацией и активацией митогенами в условиях клеточной культуры in vitro. В ходе такого эксперимента мышам линии BALB/c внутрибрюшинно вводили ФКС в дозах 10-30 мг/кг (10 мг/кг одно-, двух- или трехкратно с интервалом 12 ч). Через 4 ч после последнего введения ФКС, выделяли спленоциты, засевали в 96-луночные планшеты, активировали КонА и инкубировали в течение 72 ч. Пролиферацию МНК оценивали в Н-тимидиновом тесте, а результат выражали в процентах к контрольному значению.
До начала эксперимента животные были разделены на 3 группы: ФКС(10 мг/кг) - спленоциты мышей с однократным введением ФКС; ФКС(20 мг/кг) - спленоциты мышей с двухкратным введением ФКС; ФКС(30 мг/кг) - спленоциты мышей с трехкратным введением ФКС. Каждой экспериментальной группе соответствовал контроль, где мыши вместо ФКС получали аналогичные объемы растворителя.
Данные представленные на рисунке 3.3 показывают снижение пролиферации МНК в зависимости от дозы ФКС, вводимой внутрибрюшинно. Так, при однократном внутрибрюшинном введении ФКС уровень пролиферативного ответа, индуцированного митогеном in vitro составил 86,2±6,1%, при двух- и трехкратном - 77,4±3,2% и 49,5±3,1% соответственно.
Оценка проапоптогенного эффекта ФКС по отношению к лимфоцитам-эффекторам КЧ
Флавоноиды относятся к полифенольным соединениям растительного происхождения. К настоящему времени идентифицировано более 4000= индивидуальных соединений флавоноидной; структуры. Даже отдельные семейства растений характеризуются исключительным: многообразием представителей этого классам веществ. Результаты исследований демонстрируют, что они обладают широким диапазоном эффектов: в животных клетках. Биологическая активность флавоноидов, в основном, обусловлена их способностью проникать внутрь клеток и влиять на транскрипцию генов. Подавляющее большинство экспериментальных данных свидетельствует о том, что влияние флавоноидных соединений на транскрипцию генов у млекопитающих опосредовано ингибированием: фосфорилирования в; сигнальных каскадах, за счет влияния на активность ферментов класса ки-наз [56, 99, 112]. В последние годы пристальное внимание уделяется им-муносупрессивной активности этой группы веществ [29g. 74], Однако, не-смотря на это, на сегодняшний день, отсутствует единая концепция объясняющая механизмы их действия на иммунокомпетентные клетки.
Настоящее исследование было посвящено изучению молекулярных и клеточных механизмов иммунотропной активности ФКС in vitro и фармакологической эффективности этого препарата в экспериментальной модели контактной чувствительности на лабораторных животных как обоснование возможности использования флавоноидов солодки в качестве имму-носупрессивных агентов. Все модели, использованные в данной, работе, рекомендованы «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [12].
В рамках изучения: иммунотропной активности in vitro была исследована способность ФКС влиять на процессы активации МНК (пролифера-тивный ответ на Т-клеточные митогены), их апоптоз, а также синтез цито кинов. В качестве митогенов, способных вызывать поликлональную активацию Ттлимфоцитов, были выбраны: Кон А (для мышиных клеток), ФГА и aHTH-CD3-антитела (в случае человеческих МНК).
В условиях нашего эксперимента флавоноиды корня солодки в диапазоне концентраций 1-20 мкг/мл дозозависимо ингибировали, пролиферацию лимфоидных клеток, активированных Т-клеточными митогенами in vitro. В проявлении антипролиферативной активности ФКС не прослеживалось межвидовых (человек — мышь) или межлинейных (СВА, BDF1 и BALB/c) различий, хотя, следует заметить, что эффективность ФКС в отношении мышиных МНК была несколько выше. При внесении исследуемого агента в концентрации 20 мкг/мл пролиферация ингибировалась во всех случаях более чем на 80%. Более того, пролиферативный ответ, индуцированный КонА в спленоцитах, эксплантированных из мыши по-еле внутрибрюшинного введения ей ФКС также дозозависимо снижался. Последнее может свидетельствовать о том, что в составе ФКС содержатся вещества, которые, взаимодействуя с Т-лимфоцитами, препятствуют их активации.
Имеются сведения об антипролиферативных эффектах некоторых флавоноидов, выделенных из корня солодки по отношению к опухолевым клеткам различного происхождения [69, 91, 104, 123]. В таких исследованиях ингибирование пролиферации опухоль-трансформированных клеток коррелирует с проапоптогенной активностью соединений этого класса [48]. Однако в нашем эксперименте ФКС даже в концентрации, которая обладала максимальным антипролиферативным эффектом, не проявляли проапоптогенных свойств по отношению как к нормальным мышиным спленоцитам, активированным КонА, так и человеческим МНК, активированным aHTH-CD3-антителами in vitro. Вероятно, индукция апоптоза не является механизмом антипролиферативного эффекта ФКС в отношении активированных нормальных Т-лимфоцитов. Известно, что активация Т-лимфоцитов сопровождается индукцией внутриклеточного сигнала, сопряженного с тирозинкиназными каскадами [106, 117]. Такой внутриклеточный сигнал приводит к экспрессии индуци-бельных генов (прежде всего, гена ИЛ-2), обеспечивающих пролиферацию этих клеток. По литературным данным некоторые флавоноиды. способны блокировать сопряженную с Т-клеточным рецептором тирозинкиназу p56Ick, что коррелирует с уменьшением секреции ИЛ-2 и экспрессии рецептора этого цитокина Т-лимфоцитами [16, 106, 117, 125]. Повсей вероятности компоненты ФКС тоже могут обладать подобными свойствами. Так, при оценке уровня секреторных цитокинов в супернатантах КонА-стимулированных клеток, выделенных из лимфоузлов интактных мышей, ФКС (20 мкг/мл) подавляли секрецию ИЛ-2, что, по-видимому, и объясняет антипролиферативный эффект флавоноидов солодки по отношению к активированным Т-лимфоцитам.
На следующем этапе эффективность ФКС оценивалась в экспериментальной терапии КЧ, индуцированной ДНФБ у мышей. КЧ к ДНФБ является моделью Т-клеточного иммунного ответа, воспроизводящей заболевание - контактный дерматит у человека. В иммунопатогенезе КЧ выделяют две фазы: сенсибилизации и проявления иммунного воспаления.
Сенсибилизация {афферентная стадия) наблюдается при первичном контакте кожи с ДНФБ, в процессе которой клетки Лангерганса захватывают антиген, процессируют его и экспрессируют на своей поверхности вместе с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС) [53, 138]. Активированные клетки Лангерганса мигрируют по афферентным лимфатическим сосудам в регионарные лимфатические узлы, где представляют антиген в комплексе с молекулами МНС класса I предшественникам цитэтоксических лимфоцитов (CD8+) и/или в комплексе с молекулами МНС класса II Т-хелперам (ТхО, CD4+) [26, 51, 54]. В конечном счете, это приводит к пролиферации и дифференцировке ДНФБ-специфических Т-лимфоцитов-эффекторов, которые выходят в кровоток и распространяются по тканям, попадая, в том числе и в кожу.
Фаза проявления КЧ (эффекторная стадия) начинается при повторном контакте антигена с организмом (накожная аппликация, либо внутри- или подкожные инъекции антигена). Повторное1 попадание ДНФБ приводит к его узнаванию и запуску механизмов, приводящих к возникновению очага иммунного воспаления с участием ДНФБ-специфических эф-фекторных Г-лимфоцитов.
Поскольку ФКС in vitro значительно супрессировал индуцированную пролиферацию Т-лимфоцитов в дальнейшем, было вынесено предположение, что нарушение процесса формирования клона Т-лимфоцитов-эффекторов может являться одним из механизмов действия, способствуя эффективности ФКС как иммуносупрессанта.
Результаты, ранее полученные в нашей лаборатории [10], по исследованию динамики пролиферативной активности клеток регионарных лимфатических узлов и абсолютного количества лимфоцитов при инициации КЧ демонстрируют, что пролиферация клеток паховых лимфоузлов начинает возрастать через 24 ч после нанесения ДНФБ на кожу брюшка мышей, достигает пиковых значений через 96 ч, затем градиентно снижается к 168 ч (рисунок 4.1). Зависимость абсолютной клеточности лимфоузлов от времени после сенсибилизации положительно коррелирует с динамикой пролиферации, но сдвинута по временной оси вправо. Так, количество клеток в лимфоузлах мышей увеличивается вплоть до 120 часов после сенсибилизации ДНФБ, затем оно начинает снижаться, а через 7 дней практически не отличается от количества, содержавшегося в лимфатических узлах интактных мышей.
