Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Современные направления противоопухолевой терапии 10
1.2. Молекулярные мишени и механизмы, лежащие в основе действия таргетных препаратов 14
1.3. Флавоноиды, как основа для создания новых противоопухолевых лекарственных средств 18
1.3.1. Ингибирование протеинтирозинкиназ, как механизм противоопухолевого действия флавоноидов 21
1.3.2. Флавоноиды в регуляции клеточного цикла 24
1.3.3. Флавоноиды как индукторы апоптоза 27
1.3.4. Флавоноиды - ингибиторы ангиогенеза 30
1.3.5. Использование флавоноидов для повышения эффективности химиотерапии и преодоления резистентности опухоли к цитостатикам 31
Глава 2. Материалы и методы исследования 35
2.1. Поэтапная схема постановки экспериментов 35
2.2. Лабораторные животные 35
2.3. Опухолевые клеточные линии и штаммы 37
2.3.1. Характеристика используемых опухолевых клеточных линий и условия их культивирования in vitro 37
2.3.2. Характетистика опухолевого штамма и условия его поддержания in vivo 39
2.4. Тестируемые агенты 39
2.4.1. Стандартизация ФКС 40
2.5. Оценка пролиферации 42
2.6. МТТ-тест (изучение прямой цитотоксичности ФКС) 43
2.7. Оценка апоптоза 44
2.8. Модель перевиваемой опухоли 47
2.8.1. Оценка противоопухолевой эффективности ФКС на модели перевиваемой опухоли 47
2.8.2. Использование модели перевиваемой опухоли для оценки влияния ФКС на противоопухолевый эффект ЦФ 48
2.9. Статистическая обработка результатов 49
Глава 3. Результаты собственных исследовании 50
3.1. Изучение влияния флавоноидов корня солодки на ростовые характеристики различных опухолевых клеточных линий in vitro 50
3.1.1. Изучение влияния ФКС на пролиферацию опухолевых клеток in vitro 50
3.1.2. Изучение влияния ФКС на жизнеспособность опухолевых клеток in vitro 55
3.1.3. Изучение влияния ФКС на апоптоз опухолевых клеток in vitro 60
3 2 Изучение влияния флавоноидов корня солодки на ростовые характеристики резистентной к доксорубицину клеточной опухолевой линии K-562/DOX in vitro 66
3.2.1. Изучение влияния ФКС и доксорубицина на пролиферацию опухолевой линии K-562/DOX in vitro 66
3.2.2. Изучение влияния ФКС и доксорубицина на апоптоз клеток опухолевой линии K-562/DOX in vitro 69
3.3. Изучение противоопухолевой эффективности флавоноидов корня солодки в модели in vivo 70
Глава 4. Обсуждение результатов 75
Выводы 85
Список литературы 86
- Современные направления противоопухолевой терапии
- Использование флавоноидов для повышения эффективности химиотерапии и преодоления резистентности опухоли к цитостатикам
- Изучение влияния ФКС на пролиферацию опухолевых клеток in vitro
- Изучение противоопухолевой эффективности флавоноидов корня солодки в модели in vivo
Введение к работе
Актуальность темы исследования
За последние десятилетия значительно расширился арсенал противоопухолевых препаратов. Однако в схемах противоопухолевой химиотерапии на сегодняшний день еще широко применяются, занимая лидирующие позиции, цитотоксические средства (цитостатики). Цитостатики имеют ряд недостатков, среди которых самый существенный – низкая избирательность действия по отношению к мишени (высокая токсичность не только для злокачественных, но и для нормальных клеток).
Бурное развитие молекулярной биологии и генетики опухолей во второй половине XX века открыло огромные возможности для развития новых подходов к лечению больных онкологическими заболеваниями. Идентификация молекулярных механизмов, принимающих участие в возникновении злокачественных новообразований, изменила стратегию поиска противоопухолевых препаратов. Если раньше в этой области превалировал эмпирический компонент, то в настоящее время изыскание новых противоопухолевых средств стало принимать целенапрвленный, патогенетически обоснованный характер [Абдрахманов И.Б., 2005, Имянитов Е.Н., 2004, Северин Е.С., 2006, Hanahan ., 2001].
Внедрение в клиническую практику противоопухолевых моноклональных антител (МАТ) и низкомолекулярных ингибиторов тирозинкиназ, явилось важным шагом в направлении создания мишень-направленных (таргетных) средств [Демидов Л.В., 2009, Dancey J., 2003]. Применение «таргетных» средств в клинической онкологии явилось прорывом в лечении определенных опухолей (например, в онкогематологии), но во многих случаях их эффективность оказывается ниже ожидаемой. Внедрение новых препаратов не решило и проблему формирования лекарственной резистентности опухолей.
На сегодняшний день остаются актуальными исследования в области разработки менее токсичных, высокоспецифичных и при этом относительно «простых» для производства противоопухолевых лекарственных средств. С этой точки зрения представляют огромный интерес низкомолекулярные полифенольные соединения растительного происхождения (флавоноиды). Современные исследования демонстрируют широкий спектр фармакологической активности этих соединений. Изучение механизмов действия флавоноидов на молекулярном уровне показывает, что некоторые их классы (изофлавоны, халконы) способны ингибировать фосфорилирование, а, как следствие, и активацию, ключевых молекул сигнальных путей в клетках [Bharrhan S., 2011, Clere N., 2011, He L., 2011, Teillet F., 2007], что может лежать в основе противоопухолевого эффекта. Уже накоплен ряд экспериментальных данных, которые демонстрируют как антиканцерогенные, так и противоопухолевые эффекты отдельных представителей этого класса соединений. Кроме того, есть доказательства, что некоторые флавоноиды способны снижать токсичность цитостатиков, а также повышать чувствительность опухолевых клеток к ним [Liang G., 2010, ., 2009, ., 2008, Velasco C., 2010].
Все эти факты обосновывают перспективность флавоноидов как основы для создания новых противоопухолевых лекарственных препаратов. В связи с этим актуальным является изучение механизмов противоопухолевой активности флавоноидов и экспериментальное обоснование их фармакологической эффективности в моделях на животных.
Цель работы
Изучить на доклиническом уровне противоопухолевые эффекты флавоноидов корня солодки (ФКС).
Задачи исследования
-
Изучить влияние ФКС на ростовые характеристики (пролиферация, апоптоз), а также оценить их прямую цитотоксичность по отношению к различным опухолевым клеткам in vitro.
-
Оценить влияние ФКС на ростовые характеристики (пролиферация, апоптоз) опухолевых клеток, резистентных к доксорубицину in vitro.
-
Исследовать влияние комбинации ФКС+доксорубицин на ростовые характеристики (пролиферация, апоптоз) опухолевых клеток, резистентных к доксорубицину in vitro.
-
Оценить противоопухолевый эффект ФКС in vivo на модели перевиваемого лимфолейкоза Р388 у мышей.
-
Сравнить противоопухолевый эффект комбинации циклофосфамид+ФКС на модели лимфолейкоза Р388.
Научная новизна
Впервые было проведено исследование фармакодинамических эффектов флавоноидной фракции экстракта корня солодки в моделях, рекомендованных для доклинического изучения новых фармакологических веществ с противоопухолевой активностью.
Впервые был продемонстрирован дозозависимый антипролиферативный эффект препарата ФКС in vitro в отношении человеческих и мышиных опухолевых линий с различной гистологической характеристикой (лейкозы, раки, саркомы). Было показано, что возможный механизм антипролиферативного действия обусловлен остановкой опухолевых клеток в G2/M-фазе клеточного цикла с последующей индукцией их апоптоза.
Показано, что комбинированное использование ФКС и доксорубицина в культуре опухолевой линии K-562/DOX, резистентной к данному цитостатику, дозозависимо подавляет пролиферацию опухолевых клеток за счет индукции апоптоза. Эффект комбинированного использования ФКС+доксорубицин характеризуется суммацией эффектов цитостатика и препарата ФКС.
Впервые экспериментально доказано, что ведение препарата ФКС в комбинации с алкилирующим цитостатиком циклофосфамидом на модели перевиваемого лимфолейкоза Р388 у мышей потенцирует противоопухолевый эффект используемого цитостатика.
Практическая значимость
Совокупность полученных в работе данных о влиянии ФКС на опухолевую прогрессию углубляет фундаментальные представления о механизмах фармакологического действия ФКС.
Выявленные механизмы действия ФКС открывают перспективу их дальнейшего изучения в качестве новых противоопухолевых лекарственных препаратов.
Потенцирование противоопухолевого эффекта алкилирующего цитостатика циклофосфамида ФКС позволяет рекомендовать их дальнейшее изучение в качестве средств для повышения эффективности химиотерапии.
Личный вклад автора
Автор принимала непосредственное участие в создании концепции работы, планировании диссертации. Все экспериментальные исследования проведены автором лично. В печатных работах, опубликованных по теме диссертации, имеется существенный вклад диссертанта. Все результаты, изложенные в диссертации, получены, обработаны и обобщены в виде обсуждения, заключения и выводов лично автором.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на (Москва, Россия, 2011), V World Congress of Immunopathology and Respiratory Allergy (Тель-Авив, Израиль, 2009), VI Georgian Congress of Allergology and Immunology, VI International Congress “Health and Drug” (Тбилиси-Цхалтубо, Грузия, 2010), III World Asthma & COPD Forum, World Forum of Pediatrics (Дубай, ОАЭ, 2010), IV World Asthma & COPD Forum, XVI International Congress on Rehabilitation in medicine and Immunorehabilitation (Париж, Франция, 2011).
Работа апробирована на расширенном заседании кафедры фармакологии ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития РФ (ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова).
По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 5 статьей – в рецензируемых изданиях и журналах, рекомендованных ВАК Минобрануки России.
Использование результатов исследования
Результаты диссертации используются в учебном процессе на кафедре фармакологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова. Разработанные в диссертации модели и методы используются в экспериментальной работе кафедры и отдела иммунологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова и отдела молекулярной и экспериментальной медицины ФГБУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии Минздравсоцразвития РФ.
Структура и объем диссертации
Современные направления противоопухолевой терапии
Противоопухолевая химиотерапия как раздел медицинской науки, включающий разработку и изучение новых препаратов и их практическое применение, имеет сравнительно короткую историю. До начала XX века было изучено немного веществ на наличие противоопухолевой активности; это были соединения мышьяка, некоторые металлы, токсины, колхицин и другие митотические яды [23]. Научно обоснованная лекарственная терапия злокачественных опухолей, зародилась лишь в 40-х годах XX столетия. Первым химиотерапевтическим противоопухолевым препаратом стал примененный в 1946 г. эмбихин [16]. Появление эмбихина привело к созданию серии препаратов, механизм действия которых заключался в ал-килировании нуклеофильных центров ДНК. В дальнейшем были внедрены в клиническую практику цитотоксические противоопухолевые препараты (цитостатики) с различными механизмами действия. Предложенная ВОЗ классификация цитостатиков (табл. 1.1) носит условный характер, поскольку многие препараты, объединяемые в одну группу, имеют уникальный механизм действия и эффективны в отношении совершенно разных нозологических форм злокачественных новообразований.
Практически для всех цитостатических химиотерапевтических препаратов мишенями являются: системы синтеза и функционирования ДНК; ферменты, ответственные за отдельные стадии митоза; некоторые микроструктуры самого аппарата митоза не только опухолевых, но и нормальных клеток. Поэтому противоопухолевая химиотерапия сопровождается развитием существенных побочных эффектов. Среди них преобладают реакции, обусловленные поражением быстрообновляющихся (с высоким темпом пролиферации) клеток кроветворных и иммунокомпетентных органов, в первую очередь костного мозга. Частота различных видов токсич ности неодинаковая, наиболее часто встречаются гастроинтестинальная (до 90%) и гематологическая токсичность (85-90%). Реже встречаются нарушение репродуктивной функции, нарушение функции печени, почек, нейротоксичность, иммунодепрессивное действие [29].
Вторая проблема, которая встречается при использовании цитоста-тиков, это развитие опухолевой резистентности, возникающая даже при лечении наиболее чувствительных форм злокачественных новообразова ний. По мере гибели чувствительных к цитостатикам клеток химиорези-стентные штаммы получают избирательное преимущество в росте [23, 29, 36].
Принимая во внимание вышеизложенное, становится понятным стремление исследователей к поиску путей терапии, основанных на понимании патогенеза опухолевого процесса. Прогресс в молекулярной биологии и биотехнологии открыл огромные возможности для развития новых подходов к лечению больных онкологическими заболеваниями [22, 26, 32]. Во второй половине XX века основоположники молекулярной онкологии Ханахан и Вайнберг обобшили отличительные признаки злокачественных опухолей [85];
1) самодостаточность в отношении сигналов пролиферации;
2) потеря чувствительности к рост-ингибиторным сигналам;
3) замедление процессов программируемой клеточной гибели;
4) неограниченный репликативный потенциал клеток (преодоление лимита Хэйфлика);
5) стимуляция процессов ангиогенеза в опухоли;
6) способность к инвазии и метастазированию;
7) геномная нестабильность.
Появление этих данных стало стимулом для поиска принципиально новых препаратов для терапии, воздействующих на конкретные молекулярные мишени — ключевые звенья патогенетической цепи неопластического процесса (таргетная терапия) [18, 32].
Объединяемые общим принципом молекулярно-нацеленного действия таргетные препараты по своей природе относятся к различным соединениям: моноклональные антитела (МАТ), низкомолекулярные ингибиторы протеинтирозинкиназ. В табл. 1.2 приведены некоторые представители таргетных препаратов, разрешенных в клинической практике [29, 30, 36, 39,41,66,69,75,114].
Внедрение в клиническую практику таргетных препаратов, доказало перспективность данного направления, способного значительно повысить эффективность медикаментозного лечения злокачественных опухолей. Однако они имеют определенные недостатки, ограничивающие их применение в терапии опухолевых новообразований [36, 44]. Так, даже при всех успехах биотехнологии и генной инженерии производство МАТ является высокозатратным. При меньшем угнетающем действии на кроветворную систему, таргетные препараты чаще вызывают кожные сыпи, аллергические реакции, гастроинтестинальные нарушения. Проблема резистентности к этим препаратам также не решена [18, 29, 36].
Использование флавоноидов для повышения эффективности химиотерапии и преодоления резистентности опухоли к цитостатикам
На сегодняшний день существуют пул исследований, демонстрирующих, что отдельные представители класса флавоноидов способны повышать противоопухолевую эффективность других противоопухолевых агентов, включая и химиопрепараты [3, 10, 63, 71, 79, 89, 94, 104, 112, 117, 138, 140, 148, 151]. В экспериментах in vivo при комбинированном использовании флавоноида флавопиридола с флударабином и ритуксимабом наблюдалось потенцирование противоопухолевого эффекта [144]. В условиях клеточной культуры in vitro при сочетании данного синтетического флавоноида с трастузумабом происходила индукция апоптоза и уменьшение экспрессии EGFR на опухолевых линиях MDA-453 и SKBR3 [114].
Ряд экспериментов на мышах показывает эффективность комбинации циклофосфана с флавоноидами Л. еязолистного (F. ulmari) [10]. Так, флавоноид фисетин ингибировал ангиогенез и подавлял рост карциномы Льюиса у мышей на 67%. Данный эффект был сопоставим с эффектом циклофосфамида, а при их комбинации флавоноида с цитостатиком наблюдалось 97% ингибирование роста опухоли с низкой системной токсичностью [147]. При диффузной крупноклеточной В-лимфоме наблюдается гиперэкспрессия NF-kB. При введении генистеина мышам с диффузной крупноклеточной В-лимфомой в комбинации с полихимиотерапией (цик-лофосфамид, доксорубицин, винкристин, преднизолон), наблюдалось повышение чувствительности опухолевых клеток к используемым химиоп-репаратам и повышался противоопухолевый эффект терапии [112].
Серьезным препятствием на пути химиотерапии злокачественных новообразований является химиорезистентность. На сегодняшний день, есть экспериментальные сведения, показывающие повышение чувствительности опухолевых клеток к цитостатикам, при применении флавонои-дов. Возможными механизмами преодоления резистентности флавоноида-ми могут быть как антипролиферативные и проапоптогенные эффекты, так и возможность влияния на транспортные белки (АТФ-зависимые транспортеры, ABС-транспортеры, ATP-binding cassette (ABC) transporters) [89, 104, 108, 119, 140, 160]. Белки из семейства ABC-транспортеров являются наиболее изученным фактором, определяющим в клетке множественную лекарственную устойчивость (МЛУ) [5, 15, 37,46, 62, 83].
МЛУ - это система защиты популяции опухолевых клеток от множества лекарств, различающихся по химической структуре и механизму действия на клетку [46]. Семейство ABС-транспортеров подразделяется на подсемейства в зависимости от структуры АТФ-связывающих доменов и в настоящее время насчитывает около 50 белков. К ним относят: белок Р-гликопротеин (P-gp) [83], MRP (белок, ассоциированный с множественной лекарственной устойчивостью) [64], а также LRP и BCRP (белки, ассоциированные с устойчивостью рака легкого и рака молочной железы соответственно) [71]. Механизмы МЛУ хорошо изучены, однако основным и наиболее часто встречающимся является P-gp-опосредованный механизм об ратного транспорта цитостатиков из опухолевых клеток, что приводит к снижению их внутриклеточной концентрации и, как результат, к уменьшению или отмене эффекта противоопухолевой терапии. Этот механизм основан на активации гена MDR1, кодирующего трансмембранный белок Р-gp, который относится к семейству АВС-транспортеров [83]. Причиной гиперэкспрессии P-gp может являться гиперактивация NF-kB, API и Nrf2 транскрипционных факторов [140].
Литературные данные говорят о том, что такие флавоноиды как ге-нистеин, даидзеин и куместрол являются субстратами человеческих BCRP и мышиных Всгр. В экспериментах in vitro они дозозависимо ингибируют Вcrp-связанный транспорт метотрексата [89]. Показано, что блокада АВС-транспортеров, контролирующих накопление цитостатиков в цитоплазме и в ядре, генистеином повышает внутриклеточную концентрацию доксору-бицина [112]. Есть данные, что катехины зеленого чая, (галлокатехин, эпи-катехингаллат) могут увеличить индуцированную доксорубицином гибель клетки и сенситизировать резистентную человеческую клеточную линию НСС к этому цитостатику in vitro и in vivo. Данный эффект реализуется за счет подавления экспрессии MDR1 или ингибирования P-gp [104]. Транскрипционный фактор NF-kB регулирует процессы воспаления, выживаемости клеток, экспрессию P-gp и подавляет апоптогенную способность химиотерапевтических агентов. Флавоноид кверцетин способствует повышению эффективности цитостатика доксорубицина in vitro в клетках опухолевой линии, резистентной к доксорубицину K562/DOX, за счет подавления экспрессии NF-kB [140]. Eddy S. с соавт. показали что флавоноид эпикатехингаллат подавляет пролиферацию и вызывает апоптоз опухолевых клеток молочной железы ВТ474 резистентных к трастузумабу, за счет ингибирования фосфорилирования Akt, и связывания АТФ-транспортеров in vitro [160]. Как видно из проанализированных доступных литературных источников, на данный момент накоплены многочисленные сведения о различной рост-ингибирующей эффективности индивидуальных полифенолов растительного происхождения, а также о возможности потенцирования противоопухолевого действия цитостатиков при комбинации с флавонои-дами. Совокупность экспериментальных фактов позволяет предположить, что механизм противоопухолевого действия флавоноидов базируется на ингибировании внутриклеточных сигнальных молекул на разных уровнях ростовых каскадов. Это свидетельствует об актуальности исследования флавоноидов как основы для создания лекарственных препаратов ингиби-рующих как патогенетические механизмы прогрессирования опухоли, так и направленных на повышение эффективности противоопухолевых цито токсических препаратов.
Изучение влияния ФКС на пролиферацию опухолевых клеток in vitro
Раннее в нашей лаборатории было показано, что экстракт корня солодки, подавляет пролиферацию клеток лимфолейкоза Р388 [28]. На основании сравнения эффектов различных компонентов экстракта предположили, что антипролиферативной активностью обладают соединения фла-воноидной структуры. Поэтому одной из задач настоящего исследования явилось изучение влияния ФКС на пролиферацию опухолевых культур клеток различной видовой и гистологической принадлежности.
Для оценки влияния ФКС на пролиферацию, опухолевые клетки преинкубировали в течение 24 ч. Затем вносили исследуемый препарат в концентрациях 0,1-20 мкг/мл (в четырех повторах) и радиоактивную метку. Через 24 ч инкубации с агентом оценивали включение Н-тимидина в ДНК делящихся клеток. Результат выражали в процентах по отношению к контролю.
На первом этапе исследования использовали мышиные клеточные линии RAW-264.7, L-929. Характеристика линий приведена в табл. 2.1. Как демонстрируют результаты, внесение ФКС в опытные лунки дозозависимо подавляло пролиферацию опухолевых клеток обеих линий (рис. 3.1). В концентрации ФКС 0,1 мкг/мл уровень пролиферации опухолевых клеток составил для линии L-929 - 93,0±4,0%, а для RAW-264.7 -89,1±Ц,0%, что не имело достоверных различий в сравнении с контрольными значениями. Исследуемый препарат флавоноидов уже в концентрации 1 мкг/мл достоверно (р 0,05) подавлял пролиферацию клеток линии RAW-264.7 более чем на 30% (64,0±11,0%), а L-929 на 13% (87,0±6,9%).
С увеличением концентрации эффективность ФКС статистически достоверно (р 0,05) повышалась: для клеток RAW-264.7: в концентрации 5 мкг/мл уровень пролиферации составил 38,0±5,0%, 10 мкг/мл -26,0±10,0%, а в концентрации 20 мкг/мл ФКС практически полностью блокировали пролиферацию, что составляло 14,0±7,1% от контрольного значения. Для L-929 клеток также наблюдалось дозозависимое ингибиро-вание пролиферации, но меньшая степень выраженности эффекта. В концентрации ФКС 5 мкг/мл уровень пролиферации L-929 клеток составил 76,0±8,7%, 10 мкг/мл - 63,Ш,5%, 20 мкг/мл- 32,3±3,2% (р 0,05).
Следующим этапом исследования стала оценка влияния ФКС на пролиферацию клеток человеческих опухолевых линий (табл. 2.1): эпителиального (НТ-29, А-431), глиального (GL-6, U-373) и лейкозного (U-937) типов. Как и в случае с мышиными клеточными линиями, мы наблюдали дозозависимое подавление пролиферации при внесении ФКС в культуру клеток опухолей человека.
Наименее чувствительной к ФКС оказались опухолевые клетки эпи-дермоидной карциномы А-431. При внесении препарата в культуру клеток линии А-431 в концентрациях 0,1-10 мкг/мл (рис. 3.2) не было выявлено статистически достоверной разницы в сравнении с контролем. Даже в дозе 20 мкг/мл ФКС достоверно ингибировали пролиферацию всего лишь на 16,2±2,7% (р 0,05). Клетки колоректальной аденокарциномы НТ-29 оказались более чувствительными к ФКС. При внесении препарата флавоноидов солодки в концентрации 1 мкг/мл уровень пролиферации клеток этой линии составил 87,4±3,5%. С увеличением концентрации препарата, его анти-пролиферативная эффективность достоверно повышалась. Так, в концентрации 5 мкг/мл пролиферация составляла - 72,0±13,4% (р 0,05). При вве-дении ФКС в культуру клеток в концентрации 10 мкг/мл уровень пролиферации составил 62,5±6,8% (р 0,05). При тестировании препарата флавоноидов в концентрации 20 мкг/мл подавление пролиферации превышало 48% (52,3±6,9%) (рис. 3.2).
Чувствительность исследуемых глиальных клеточных линий к ФКС была различной: подавление пролиферации клеток GL-6 наблюдалось в меньшей степени, чем клеток линии U-373. При инкубации препарата фла-воноидов с клетками линии GL-6 в концентрации 1 мкг/мл уровень пролиферации составлял 98,1±10,6%, что не имело достоверных различный по отношению к контролю. С увеличением концентрации эффективность ФКС достоверно (р 0,05) повышалась: в концентрации 5 мкг/мл уровень пролиферации составил 86,8±11,9%; 10 мкг/мл - 78,7±5,9%; 20 мкг/мл -62,3±8,9%. При введении ФКС в культуру клеток U-373, эффективность препарата была сравнительно выше. Результаты демонстрировали (рис. 3.3) дозозависимые изменения эффекта: в концентрации 5 мкг/мл уровень пролиферации составил 57,8±6,7%; 10 мкг/мл - 33,9±5,3%; 20 мкг/мл -21,2±2,9%(р 0,05).
Клетки моноцитарной опухолевой линии U-937 были высокочувствительны к препарату флавоноидов корня солодки. Так, ФКС в концентрации 20 мкг/мл подавляли пролиферацию почти на 80% (до 22,1±3,9%; р 0,05). При инкубации ФКС в концентрации 10 мкг/мл ингибирование пролиферации превышало 56% (44,2±2,3%; р 0,05). В концентрации 5 мкг/мл препарат флавоноидов подавлял пролиферацию более чем на 40% (60,1±4,7%; р 0,05). При введении ФКС в культуру клеток в концентрации 1 мкг/мл VDOBeHь пролиферации достоверно (р 0,05) отличался от контроля и составлял 85,3±4,5%. Результаты представлены на рис. 3.4.
При внесении флавоноида сравнения дигидрокверцетина в культуру опухолевых клеток П-937 наблюдалось дозозависимое подавление пролиферации, однако эффект был сравнительно менее выражен, чем эффект пре-парата ФКС. Так, ФКС в концентрации 20 мкг/мл подавляли пролиферацию почти на 80% (до 22,1±3,9%; р 0,05), а дигидрокверцетин (20 мкг/мл) только на 50% (до 46,5±2,9%; р 0,05) (рис. 3.5).
Таким образом, результаты экспериментов по изучению антипролифе-ративных эффектов ФКС по отношению к опухолевым клеткам in vitro позволяют заключить следующее:
1) ФКС в диапазоне концентраций 1,0-20,0 мкг/мл дозозависимо подавляют пролиферацию опухолевых клеток in vitro.
2) Антипролиферативный эффект ФКС по отношению к опухолевым клеткам не имеет значимой видовой (человек/мышь) или гистологической специфичности (лейкозы/раки/саркомы).
Изучение противоопухолевой эффективности флавоноидов корня солодки в модели in vivo
На следующем этапе исследовали противоопухолевую эффектив-ность препарата ФКС in vivo, а также его влияние на противоопухолевый эффект цитостатика в модели лимфолейкоза мыщей Р388. В качестве цитостатика был использован алкилирующий агент циклофосфамид (ЦФ), широко используемый в клинике в различных схемах полихимиотерапии.
Для моделировании гемобластоза мышам BDFi перевивали внутри-брюшинно суспензию опухолевых клеток (10 на мышь). Эксперимент проводили в прямом параллельном сравнении следующих групп.
1-й группе (контроль) внутрибрюшинно вводили изотонический раствор натрия хлорида с 5% содержанием этанола;
2-я группа получала внутрибрюшинно ФКС (10 мг/кг);
3-й и 4-й группе вводили внутрибрюшинно ЦФ (100 или 150 мг/кг);
5-я и 6-я группа получала комбинированную терапию ЦФ (100 или 150 мг/кг) и ФКС (10 мг/кг).
Экспериментальную терапию начинали через 24 ч после перевивки гемобластоза. ЦФ вводили однократно, препарат ФКС - внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг в режиме через день до начала гибели животных в группе. Для оценки эффекта терапии рассчитывали среднюю продолжительность жизни (СПЖ), увеличение продолжительности жизни (УПЖ) в процентах по отношению к группе, не получавшей какого-либо лечения и терапевтический выигрыш (ТВ) в процентах по отношению к группе, пролеченной только цитостатиком.
При качественной визуальной оценке на разных сроках роста опухоли не отмечалось явных различий в поведенческих реакциях животных в контрольной группе и группе, получавшей только ФКС. На поздних сроках ОПУХОЛИ (7-11 дни) признаки опухолевого токсикоза были выражены у всех экспериментальных животных, не получавших лечение цитостатиком. Это проявлялось в снижении двигательной активности, пилоэрекции, на-коплении выпота в брюшной полости и одышке. ФКС в исследуемом режиме введения не обладали достоверной противоопухолевой активностью. Статистическая обработка результатов показала, что СПЖ мышей в группе, получавшей только ФКС, составила 9,5±0,4 дней, что статистически недостоверно отличалось от контрольных значений (9,9±0,3 дней). В группе мышей, получавших ФКС, процентное распределение погибших мышей, по дням за время наблюдения, также не имело достоверной разницы с контролем (кривые Kaplan-Meier на рис. 3.19).
На рис. 3.20 и 3.21 приведено сравнение динамики гибели животных ппи введении ЦФ и комбинации ЦФ+ФКС. ФКС в исследуемых дозировках достоверно сдвигает кривые в сторону увеличения продолжительности жизни (р 0,05, logrank тест). Необходимо заметить, что в группе, которой вводили ФКС с ЦФ в дозе 150 мг/кг, до 10% мышей выжили (СПЖ 90 дней) что является критерием излечения для моделей гемобластозов. При комбинированном лечении ФКС с ЦФ в высокой дозе (150,0 мг/кг) около трети животных в группе погибали на 8-13 день развития лейкоза без признаков прогрессирования гемобластоза, но были заметны признаки токсичности; потеря массы тела (рис. 3.20)
Таким образом, проведенные исследования показали:
1. ФКС (многократно внутрибрюшинно 10 мг/кг) не обладает значимым, противоопухолевым эффектом в модели лимфолейкоза мышей Р388.
2. ФКС потенцирует противоопухолевый эффект циклофосфамида в экспериментальной терапии лимфолейкоза Р388.
3. В комбинации с большими дозами циклофосфамида ФКС потенцирует токсичность цитостатика в экспериментальной терапии лимфолейкоза Р388.
