Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Иммунотропные лекарственные препараты: классификация и клиническое применение 10
1.1.1. Иммунопатология как элемент патогенеза заболеваний 10
1.1.2. Иммуносупрессанты и иммуностимуляторы 11
1.2. Лекарственные препараты на основе биологически активных пептидов 14
1.3. Современные представления об организации и функциональной активности экстраклеточного матрикса 21
1.3.1. Коллагеновые белки - один из важнейших компонентов ЭКМ 23
1.3.2. Регуляторный потенциал экстраклеточного матрикса и механизмы его реализации 25
1.3.3. Рецепторы для компонентов ЭКМ 28
1.4. Матрикины - новый класс регуляторных пептидов 32
1.4.1. Коллаген как источник регуляторных пептидов 37
Глава 2. Материалы и методы исследования 44
2.1. Схема постановки экспериментов 44
2.2. Объекты исследования 44
2.2.1. Кровь здоровых доноров 44
2.2.2. Фибробласты линии М-19 и условия их культивирования 45
2.2.3. Экспериментальные животные 46
2.3. Тестируемая фракция коллагеновых пептидов 46
2.3.1. Выделение стандартного препарата коллагена I типа 46
2.3.2. Определение концентрации коллагена в растворе по содержанию оксипролина 47
2.3.3. Очистка бактериальной коллагеназы 48
2.3.4. Получение фракции низкомолекулярных КП 49
2.4. Методы исследования 49
2.4.1. Выделение клеток из периферической крови человека и подготовка их к культивированию 49
2.4.2. Оценка функциональных характеристик клеток периферической крови человека 51
2.4.3. Исследование хемотаксиса нейтрофилов и макрофагов на модели in vivo 59
2.4.4. Модель экспериментального перитонита 60
2.4.5. Исследование плазменного гемостаза 62
2.4.6. Определение пролиферативной активности фибробластов линии М-19 63
2.4.7. Статистическая обработка результатов 63
Глава 3. Результаты собственных исследований 65
3.1. Действие КП на МНК периферической крови человека 65
3.1.1. Действие КП на спонтанную и индуцированную различными агентами пролиферацию МНК 65
3.1.2. Влияние КП на апоптоз МНК 69
3.2. Регуляция функциональной активности фагоцитов периферической крови человека под действием КП 75
3.2.1. Исследование влияния КП на фагоцитарную реакцию нейтрофилов и моноцитов человека 75
3.2.2. Влияние КП на продукцию активных форм кислорода нейтрофилами и моноцитами периферической крови 79
3.2.3. Влияние КП на развитие апоптоза нейтрофилов 81
3.2.4. Исследование миграционной активности лейкоцитов под действием КП в модели in vivo 83
3.2.5. Изучение влияния КП на развитие экспериментального перитонита 86
3.3. Дополнительные фармакологические эффекты КП 89
3.3.1. Действие КП на систему гемостаза 89
3.3.2. Действие КП на пролиферативную активность фиброб-ластов линии М-19 92
Глава 4. Обсуждение результатов 94
Выводы 104
Список литературы 105
- Иммуносупрессанты и иммуностимуляторы
- Матрикины - новый класс регуляторных пептидов
- Фибробласты линии М-19 и условия их культивирования
- Действие КП на спонтанную и индуцированную различными агентами пролиферацию МНК
Введение к работе
К настоящему времени накоплено множество данных о роли иммунной системы в патогенезе многих заболеваний. Иммунные нарушения, являясь причиной или следствием патологического состояния, приводят к утяжелению течения заболевания, его хронизации, резистентности к традиционной симптоматической терапии и повышенному риску возникновения осложнений. В связи с этим поиск новых лекарственных средств, способных корригировать иммунные нарушения приобретает на современном этапе все большую актуальность.
Одним из перспективных направлений в этой области является изучение иммунорегуляторных пептидов. В медицинском арсенале уже имеются фармакологические препараты, созданные %на основе биологически активных пептидов [4, 14, 18, 22, 26, 33, 52]. Главное преимущество регу-ляторных пептидов перед химическими препаратами состоит в том, что, являясь аналогами эндогенных соединений, они реже вызывают побочные реакции, и в большинстве случаев проявляют выраженный терапевтический эффект в сравнительно небольших дозах.
Выявление регуляторного потенциала у фрагментов белков экстраклеточного матрикса (ЭКМ) - матрикинов, послужило толчком для разработки новых подходов в создании оригинальных высокоэффективных лекарственных препаратов, в частности, обладающих иммунотропным действием. В этом плане большой интерес для исследования представляют коллагеновые пептиды (КП), так как по имеющимся в литературе отрывочным данным они способны оказывать существенное влияние на функции различных видов клеток, в том числе и иммунокомпетентных [9, 63, 82, 93, 100, 112, 130]. Благодаря эндогенному происхождению, низкой ви-доспецифичности, малому размеру и наличию высокоспецифичных рецеп-
торов на клетках, КП являются перспективными веществами для терапевтического использования.
Проблема исследования эффектов КП, кроме прикладного значения, имеет и важный теоретический аспект. Изучение биологических эффектов этого нового класса регуляторных агентов является актуальным для более глубокого и всестороннего понимания механизмов развития различных физиологических и патологических процессов, протекающих в организме в целом и в иммунной системе в частности.
Цель и задачи исследования
Целью данного исследования явилось изучение иммунотропных и других фармакодинамических эффектов низкомолекулярных пептидов коллагена. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
Получить фракцию низкомолекулярных (<10 кДа) пептидов коллагена I типа.
Оценить действие КП на спонтанную и индуцированную различными агентами пролиферацию мононуклеарных клеток периферической крови человека.
Изучить эффекты КП в отношении нейтрофилов и макрофагов: миграционную активность, фагоцитоз, продукцию активных форм кислорода и апоптоз.
Исследовать влияние КП на течение острой генерализованной инфекции у мышей.
Изучить влияние КП на плазменно-коагуляционный гемостаз.
Исследовать действие КП на пролиферацию фибробластов человека.
Научная новизна
В ходе работы был модернизирован метод получения препарата низкомолекулярных пептидов, являющихся аналогами продуктов воспали-
тельной деградации коллагена. Впервые было проведено комплексное тестирование фармакодинамических эффектов КП на иммунокомпетентных клетках человека. Было выявлено, что основной мишенью для КП в иммунной системе являются макрофаги и нейтрофилы. В отношении этих клеток КП оказывают провоспалительное действие, которое выражается в активации миграционных, фагоцитарных и синтетических функций лейкоцитов.
Впервые было показано, что действие КП на лимфоциты человека носит модулирующий характер, зависящий от степени активации клеток. Данный эффект КП проявлялся только в отношении Т-лимфоцитов и не наблюдался в случае В-клеток.
Впервые выявлено, что введение КП при экспериментальном перитоните у мышей увеличивает среднюю продолжительность жизни и количество выживших животных, а таюке снижает интенсивность процесса спайкообразования.
Впервые было исследовано влияние КП на плазменно-коагуля-ционный гемостаз человека. Было выявлено, что, в зависимости от концентрации, КП способны оказывать как прокоагулянтное, так и антикоагу-лянтное действие.
Также было продемонстрировано, что в широком диапазоне концентраций КП вызывают усиление пролиферации фибробластов.
Практическая значимость
В процессе работы был модернизирован метод получения препарата КП, позволяющий сократить время выделения и увеличить выход активных пептидов. Совокупность данных, полученных о влиянии КП на иммуноком-петентные клетки, открывает большие возможности для их применения в качестве иммуностимулирующих препаратов. Так, возможно их использование, как при острых, так и при хронических вялотекущих инфекционных заболе-
ваниях. Не исключено их применение в качестве адъювантов при вакцинации. Такой эффект КП, как усиление пролиферации фибробластов, может быть использован для ускорения репаративных процессов.
Данные, полученные в ходе исследования, представляют также фундаментальный интерес и позволяют начать полномасштабные исследования регуляторного влияния КП в отношении клеток, участвующих в воспалении и иммунном ответе.
Публикация и апробация работы
Материалы диссертации были доложены на V Съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Санкт-Петербург, 2003), II Международной конференции «Современные аспекты реабилитации в медицине» (Ереван, 2005), II Российской конференции по иммунотерапии и иммунореабилитологии (Москва, 2005), IV конференции иммунологов Урала «Актуальные проблемы фундаментальной и клинической иммунологии и аллергологии» (Уфа, 2005), Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия» (Курск, 2006), Всероссийской конференции молодых ученых «Иммунитет и аллергия: от эксперимента к клинике» (Пермь, 2006), VIII Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармако-логии» (Москва, 2007).
Работа апробирована на совместном заседании кафедры фармакологии, кафедры и отдела иммунологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.
Внедрение результатов исследования
Результаты диссертации внедрены в учебный процесс на кафедре фармакологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава.
Разработанные в диссертации модели и методы используются в экспериментальной работе кафедры и отдела иммунологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава и отдела молекулярной и экспериментальной гематологии, онкологии и иммунологии ФНКЦ Детской гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава.
Иммуносупрессанты и иммуностимуляторы
Иммуносупрессанты - лекарственные средства, которые ослабляют или полностью подавляют иммунный ответ [80]. Они являются базовыми патогенетическим препаратами для терапии атопических, аутоиммунных заболеваний и других видов иммуноагрессии. Следует отметить, что в большинстве случаев иммуносупрессивная терапия является патогенетической и может приводить к серьезным осложнениям, угрожающим жизни пациента.
Существует классификация иммуносупрессантов, основанная на разделении препаратов по избирательности действия на иммунную систему [16]: 1. Неселективные препараты: a) глюкокортикоиды: беклометазон, декасметазон, преднизолон и др. b) цитостатики: азатиоприн, метотрексат, циклофосфамид c) фотосенсибилизаторы: 5-метоксипсорален, 8-метоксипсорален 2. Препараты с относительной избирательностью: а) антилимфоцитарные антисыворотки: антилейкоцитарный иммуноглобулин, антитимоцитарный иммуноглобулин b) внутривенные иммуноглобулины: нормальный иммуноглобулин человека для внутривенного введения 3. Высокоселективные препараты: a) циклоспорин А и макролидные антибиотики (пимекролимус, сиро-лимус, такролимус) b) моноклональные антитела: базиликсимаб, даклизумаб, инфликсимаб, мурономаб c) другие препараты: ингибитор рецептора ИЛ-1
В настоящее время для обозначения веществ, усиливающих иммунный ответ, используется два термина: иммуностимуляторы и иммуномоду-ляторы [43]. Иммуностимулирующие средства определены как препараты, повышающие активность как поврежденных, так и неповрежденных звеньев иммунной системы. Термин «иммуномодуляторы» более широкий, обозначает лекарственные средства, восстанавливающие функции иммунной системы, возвращающие показатели иммунитета к нормальному уровню как при гиперергических, так и при гипоергических состояниях. Эти два понятия в настоящее время часто подменяют друг друга, так как бывает достаточно сложно определить, какой из эффектов препарата является ведущим в нормализации функционирования системы иммунного гомеоста-за. Абсолютным показанием к назначению иммуностимуляторов (-модуляторов) являются вторичные иммунодефицита [41]. Помимо этого данные препараты показаны также при дисбалансах, при которых на фоне им-муноагрессии наблюдается дефицит гуморального или клеточного иммунного ответа [43]. Помимо основного иммуностимулирующего (-модулирующего) эффекта, многие из препаратов этой группы имеют дополнительное фармакологическое действие. Так, например, левамизол (декарис) - известное противоглистное средство, в высоких дозах может оказывать им-муносупрессивное действие [5]. Тактивин имеет пирогенный, антистрес-сорный, аналгезирующий и ранозаживляющий эффекты [1]. У полиокси дония выявлено детоксицирующее, антиоксидантное и мембраностабили-зирующее действие [27].
Группа иммуномодуляторов объединяет свыше 60 различных препаратов. В силу того, что список иммуномодуляторов постоянного пополняется, также как изменяются фундаментальные представления о работе иммунной системы, однозначной классификации, удовлетворяющей всем требованиям специалистов, для данной группы препаратов в настоящий момент не существует [23, 31, 81]. Наиболее часто приводимая в литературе классификация основана на разделении иммуномодуляторов по происхождению [42]. В соответствии с этой классификацией выделяют 6 основных групп препаратов: 1. Препараты микробного происхождения a) I поколения - вакцина БЦЖ, пирогенал, продигиозан b) II поколения - бактериальные лизаты: бронхо-ваксом, бронхо-мунал, имудон, имунал, ИРС-19, нуклеинат натрия, постеризан, рибомунил, рузам, уро-ваксом c) III поколения - ликопид 2. Препараты тимуса: a) I поколения: тактивин, тималин, тимактид, тимоген, тимоптин, тимо-стимулин и др. b) II поколения: иммунофан 3. Препараты костного мозга: миелопид 4. Цитокины и препараты на их основе a) препараты на основе интерферонов: бетаферон, интрон А, лейкинфе-рон, пегинтрон, реаферон и др. b) препараты на основе интерлейкинов: беталейкин, ронколейкин, суперлимф c) препараты на основе ФИО: ридостин, хебертранс d) препараты на основе колониестимулирующих факторов: молграмо-стим, филграстим, ленограстим e) препараты иммуноглобулинов: биавен, интраглобин, октагам, пен-таглобин, сандоглобин 5. Препараты нуклеиновых кислот: нуклеинат натрия 6. Химически чистые препараты: амиксин, арбидол, галавит, гепон, глу-токсим, левамизол, неовир, полиоксидоний, полудан, ридостин, цикло-ферон и др.
Матрикины - новый класс регуляторных пептидов
Термин «матрикины» был предложен для обозначения пептидов, высвобождаемых при частичном протеолизе из макромолекул ЭКМ, обладающих способностью регулировать клеточные функции. В литературе первые упоминания о существовании биологически-активных пептидов, полученных из соединительнотканных гликопротеинов, относятся к 60 гг. прошлого столетия. С тех пор интерес к этому классу регуляторных факторов не ослабевает, так как получены многочисленные доказательства участия матрикинов как в нормальных физиологических процессах, так и при патологических реакциях организма, таких как, заживление раны, воспаление, опухолевая инвазия. Для многих матрикинов установлена химическая структура, биологическая роль, определены рецепторы и сигнальные пути, через которые они участвуют в регуляции клеточной активности. Происходящие из разных по составу и локализации матриксных компонентов, матрикины обладают общими свойствами: 1. Являются низкомолекулярными фрагментами гликопротеинов и проте-огликанов ЭКМ; 2. В силу низкой молекулярной массы способны диффундировать в системный кровоток и распределяться по тканям организма; 3. Являются маркерами интенсификации деградационных процессов в тканях и имеют характерную динамику накопления. Матрикины практически не обнаруживаются в норме, но при некоторых патологических процессах их концентрация значительно возрастает. 4. Обладают значительной биологической активностью в отношении большинства клеток организма. Как правило, один матрикин обладает способностью воздействовать на разные клеточные типы. 5. Эффекты, оказываемые на клетки матрикинами, могут значительно отличаться от действия исходного компонента ЭКМ (скрытые последовательности). Литературные данные свидетельствуют, что практически все глико-протеиды и отдельные гликозаминогликаны ЭКМ могут служить источниками для образования матрикинов. Большинство известных данных касаются универсальных гликопротеинов ЭКМ.
Эластин, являющийся главным компонентом матрикса сосудистой стенки и дермы, является важным источником биологически активных пептидов. При различных патологических состояниях наблюдается увеличение концентрации эластиновых матрикинов в циркулирующей крови (до 10" - 10" мг/мл). Несколькими группами исследователей показано участие эластиновых пептидов в патогенезе атеросклеротического повреждения сосудов, развитии эмфиземы легких, опухолевой прогрессии. Интересные данные были получены при изучении матрикина VGVAPG. Он повторяется несколько раз в молекуле тропоэластина и является сайтом для связывания специфическим клеточным рецептором. Этот гексапептид выполняет разнообразные функции: является хемоаттрактантом для фибробластов, нейтрофилов и моноцитов, способен индуцировать продукцию лейкоцитами свободных радикалов, высвобождение эластазы и миелопероксидазы [77], опосредует локальную вазодилятацию, стимулирует в фибробластах экспрессию ММР-1 и ММР-2, участвующих в перестройке соединительной ткани [70]. Были выявлены и другие эластиновые пептиды, обладающие схожими активностями. Хемотаксическую активность проявляют AGVPGFGVG и GFGVGAGVP (фибробласты), VPGVG (фибробласты и моноциты), GFGVGAGVP и GLGVGAGVP (эндотелиальные клетки). Пептиды VGV, VGVA, GVGVA, PGVGVA способны активировать лейкоциты, a VGV и VGVAPG обладают вазодилатирующими свойствами. Пентапеп-тид VGPVG индуцирует пролиферацию гладкомышечных клеток и уменьшает продукцию ими эластина. Матрикин VGVAPG обладает тим-мунотропной активностью, направляя дифференцировку наивных Т клеток периферической крови человека в ТЫ-лимфоциты [67, 70].
Один из главных компонентов базальной мембраны - ламинин также служит источником матрикинов. Например, при тканевом повреждении высвобождается биологически активная последовательность а-цепи лами-нина-10 - AQARSAASKVKVSMKF, которая вызывает миграцию нейтро-филов и моноцитов и стимулирует в них синтез ММР-9, что способствует развитию воспалительной реакции [47]. Пептид RKRLQVQLSIRT (из G-домена осЛ-цепи) ингибирует морфогенез слюнных желез, а фрагмент отцепи CSRARKQAASIKVAVSADR (2091-2108) - стимулирует рост аксонов [101]. YIGSR из III домена pi-цепи ламинина (929-933), связываясь с рецептором эпидермального фактора роста, способствует миграции эпителиальных опухолевых клеток (при раке молочной железы, толстого кишечника, желудка) [122]. Этот матрикин также увеличивает адгезию и миграционную активность эндотелиальных и гладкомышечных клеток сосудов, эпителиоцитов роговицы [74]. Последовательность LGTIPG (pl-цепи ламинина) увеличивает продукцию ММР-2.
Тканевой фибронектин содержит несколько доменов, способных регулировать клеточную активность. Его 25 кДа N-терминальный домен стимулирует экспрессию ММР-1 фибробластами, а другой домен с м.м. 45 кДа -индуцирует синтез ММР-13 в хондроцитах и деградацию протеогликана хряща [101]. Трипептид из 1-домена - IGD, является митогеном для фиброб-ластов [124], в то время как, последовательность WQPPRARI С-тер-минального гепарин-связывающего домена фибронектина обеспечивает формирование в фибробластах фокальных адгезионных контактов [149] Фрагмент фибронектина - GRGS, вызывает хемотаксис моноцитов, а пептид GRGD - ингибирует тромбин-индуцированную агрегацию тромбоцитов [63].
Минорные компоненты ЭКМ также могут быть источником биологически активных фрагментов. Так матрикины остеонектина (SPARC), главного «разобщителя» клеточно-матриксных контактов при активной перестройке ткани (морфо- и ангиогенез, репарация и т.д.), KGHK и KKGHK, способствуют ангиогенезу и синтезу ЭКМ: активируют пролиферацию эндотелиальных клеток и усиливают синтетическую активность фибробластов. Совершенно иную активность несет пептид остеонектина -KNVLVTLYERDEGNNLLTEK. Он стимулирует в моноцитах продукцию ММР-9 [101]. Матрикины тромбоспондина-1 (CSVTCG, WSHWSPWS, GVITRIR), другого минорного гликопротеина соединительной ткани, подавляют пролиферацию эндотелиальных клеток [66].
Необходимо отметить, что некоторые матрикины одного и того же состава могут происходить из разных молекул ЭКМ. Классическим примером может служить матрикин состава Arg-Gly-Asp (RGD). Данная последовательность высвобождается при протеолизе коллагенов, ламининов, фибронектина, также как из белков плазмы крови (витронектина и фибриногена) и белков, синтезируемых в месте повреждения тканей (остеопон-тина и тенасцина) [63]. Поскольку RGD является сайтом связывания ин-тегриновыми рецепторами, взаимодействие клеток с RGD-содержащими пептидами может прямо воздействовать на клеточное поведение. На сегодняшний день известно более 10 интегринов, способных распознавать данную последовательность (сс2рі, ссЗрІ, cc4f31, ct5pi, алфі, алфЗ, ocvp5, avp6, avp8, allb/pilla), что обусловливает разнообразие эффектов RGD-содержащих пептидов.
RGD-матрикины усиливают адгезию клеток к матриксу (фибробла-сты, кератиноциты, тромбоциты, эндотелиоциты, клетки островков Лан-герганса и др.), активируют клеточную пролиферацию и дифференцировку (мегакариоциты, эндотелиоциты), контролируют сосудистый тонус, инги-бируют экспрессию провоспалительных цитокинов моноцитами/макрофагами [64, 102]. Взаимодействуя in vitro и in vivo с a4pi и aLp2 интегрина-ми, RGD-матрикины блокируют адгезию лимфоцитов, моноцитов и эози-нофилов к эндотелиальным клеткам, приводя к подавлению воспалительной реакции [154], а связываясь с a5pl, угнетают экспрессию в моноцитах/макрофагах провоспалительных цитокинов (TNF-a и IFN-y), ММР-9 и индуцибельной NO-синтазы [75].
Фибробласты линии М-19 и условия их культивирования
Линия диплоидных фибробластов человека М-19 была получена в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН [21]. Источником клеток служили кожа и мышцы 7-10-недельных эмбрионов человека. По морфологическим характеристикам линия М-19 содержит параллельно ориентированные, однородные веретеновидные клетки с удлиненным ядром. Более 80% клеток в культуре являются диплоидными. Клетки линии М-19 обладают высокой пролиферативной активностью и способны длительно (более 25 пассажей) поддерживаться в культуре без изменения свойств.
Для проведения опытов in vitro культуру фибробластов поддерживали пассированием в стеклянных сосудах Карреля или пластиковых матрасах. Для культивирования использовали среду Игла MEM в модификации Дюльбеко с добавлением 300 мкг/мл глютамина, 10% инактивированной эмбриональной сыворотки, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. При пересевах или постановке экспериментов, требующих переноса клеток в другую культуральную посуду, фибробласты снимали с поверхности стекла смесью раствора Версена и 0,25% раствора трипсина (в соотношении от 1:1 до 4:1) в течение 3-15 мин. при 37С. После ошарива-ния клеток и открепления их от поверхности, трипсин инактивировали, смывая клетки со стекла сыворточной средой. Количество и жизнеспособность фибробластов оценивали в камере Горяева в присутствии 0,1% раствора трипанового синего.
Эксперименты поставлены на 480 мышах-самцах линии СВА массой 20-22 г 8-10-недельного возраста. В опытах использовали животных, прошедших карантинный режим вивария РГМУ и не имевших внешних признаков каких-либо заболеваний. Все животные содержались в одинаковых условиях на стандартном рационе вивария РГМУ. Экспериментальные группы животных формировали рандомизированно по 10 мышей в каждой. В контрольные и опытные группы входили мыши одного возраста, полученные из питомника одновременно, разброс по исходной массе животных составлял не более 10%. Все исследования на животных проводили не менее чем в трех повторных сериях опытов, в первой половине дня. Для проведения иммунологических исследований мышей выводили из опыта методом цервикальной дислокации.
В настоящей работе изучали эффекты смеси низкомолекулярных пептидов, полученных ферментативной деградацией коллагена I типа. В качестве наиболее доступного источника для получения коллагена I типа использовали хвостовые сухожилия лабораторных крыс. Кожу на хвосте удаляли, сухожильные тяжи отделяли от позвонков, размельчали ножницами и промывали дистиллированной водой. После 24 ч набухания в 100-кратном объеме раствора 3% уксусной кислоты путем фильтрования удаляли нерастворенные фрагменты. Препарат нейтрализо вали до рН 7,5 добавлением З М раствора трис-буфера (трис-(гидрокси-метил)-аминометан) рН 10,9. Затем центрифугировали в течении 1 ч при 40 000 об/мин., отбирали супернатант, представляющий собой вязкий опа-лесцирующий раствор.
Коллаген I типа очищали высаливанием в градиенте хлорида натрия (2,0-2,5 М). Осадок собирали центрифугированием при 20 000 об/мин., однократно промывали раствором 2,5 М хлорида натрия в 50 мМ трис-HCl (рН 7,5) и перерастворяли в 0,3% уксусной кислоте. Диализовали против двух смен 0,3% уксусной кислоты. Последний диализный раствор готовили на деионизированной тридистиллированной воде. Для стерилизации и осаждения агрегатов белка раствор коллагена центрифугировали 20 ч при 17 000 об/мин. Супернатант осторожно собирали в стерильных условиях, ампулиро-вали, замораживали и хранили при -20С в течение 2-3 месяцев [73].
Концентрацию коллагена в образцах определяли спектрофотометри-чески при длине волны 558 нм с помощыо специфического окрашивания оксипролина реактивом Эрлиха. Раствор коллагена гидролизовали в течении 16 ч в 6 Н соляной кислоте при 100С. Гидролизат упаривали на водяной бане и перерастворяли в дистиллированной воде. В качестве контроля использовали стандартный раствор оксипролина (20 мкг/мл) в 0,1 Н соляной кислоте. Аликвоту исследуемого образца или стандартного раствора (с концентрацией 1, 2 и 3 мкг/мл) объемом 150 мкл смешивали с 300 мкл изопропанола и 150 мкл окисляющего раствора (1 часть 7% хлорамина Т в дистиллированной воде и 4 части буфера, содержащего 57 г ацетата натрия, 37,5 г тринатрий цитрата в 500 мл воды, рН 6,0 выводили лимонной кислотой, 385 мл изопропанола и объем доводили до 1 л). После 4 мин. инкубации добавляли 1,95 мл реактива Эрлиха (2 г 4-диметиламинобен зальдегида в 3 мл 57% хлорной кислоты смешивали с 13 мл изопропанола) и выдерживали 25 мин. при 65С. После охлаждения определяли оптическую плотность раствора при длине волны 558 нм.
В случаях, когда оптическая плотность образца превышала значения калибровочной кривой, образец разбавляли изопропанолом. Концентрацию коллагена рассчитывали, исходя из 13% содержания оксипролина [97].
Действие КП на спонтанную и индуцированную различными агентами пролиферацию МНК
Спонтанная пролиферация МНК. Влияние КП на спонтанную проли-феративную активность МНК человека изучали с помощью радиоизотопного метода, культивируя клетки в течение 72 ч в присутствие 1-1000 мкг/мл КП. При оценке действия КП сравнивали значения включений Н-тимидина в МНК, обработанные пептидами, и в контроле (полный гидролизат коллагена I типа, см. раздел 2.3.2.). Результаты выражали в процентах. В отсутствие стимуляторов пролиферативная активность МНК находилась на очень низком уровне. Добавление КП уже в концентрации 1 мкг/мл вызывало усиление пролиферации лимфоцитов (119,8±3,5%). Десятикратное увеличение дозы КП практически не изменяло достигнутый эффект. Максимальная стимуляция пролиферации (149,1±9,2%, Р 0,05) наблюдалась при концентрации пептидов 100 мкг/мл. В высокой дозе (1000 мкг/мл) КП ингибировали пролиферацию нестимулированных МНК. Таким образом, эффект КП на спонтанную пролиферацию МНК носит дозозависимый характер: в малых и средних концентрациях (1-100 мкг/мл) КП активируют пролиферацию клеток, тогда как высокие дозы пептидов (1000 мкг/мл) угнетают клеточное деление. Стимулированная пролиферация МНК. К настоящему времени в литературе описано несколько способов активации лимфоцитов in vitro. Среди них наиболее часто используется митогенная стимуляция и стимуляция с помощью моноклональных антител, направленных против антиген-специфических рецепторов (анти-СБЗ или анти-slg). В настоящей работе в качестве стимулирующих агентов использовали митогены - фитогемагглютинин (ФГА) и поквид-митоген (ПВ), а также моноклональные airra-CD3 антитела Ісо-90 в дозах, вызывающих максимальный и субмаксимальный пролиферативный ответ лимфоцитов. В связи с тем, что с течением времени партии стимуляторов не менялись, для проведения экспериментов использовали концентрации препаратов, установленные ранее в нашей лаборатории. Для ФГА эти концентрации были 10 и 2,5 мкг/мл, для ПВ - 5 и 1 мкг/мл, а для анти-СБЗ-Ат - 2,5 и 1 мкг/мл, соответственно. Пролиферативный ответ лимфоцитов оценивали радиоизотопным методом, культивируя клетки в присутствие активаторов и пептидов. При оценке действия КП сравнивали значения включений 3Н-тимидина в культурах, обработанных пептидами и в контроле (только активирующие агенты). Результаты выражали в процентах.
В присутствие субмаксимальных доз ФГА пептиды вызывали усиление пролиферации МНК: незначительное при концентрации пептидов 1 мкг/мл (117,6±7,5%), и почти двукратное - при 10-100 мкг/мл (Р 0,05). Доза КП 1000 мкг/мл практически не влияла на клеточную пролиферацию (104,4±7,5%). При стимуляции МНК максимальными дозами ФГА действие пептидов практически во всех исследуемых концентрациях носило ингибирую-щий характер (Р 0,05). КП вызывали сходное по выраженности угнетение (около 77%) в низких (1-10 мкг/мл), средней (100 мкг/мл) и высокой (1000 мкг/мл) дозах. При субмаксимальных дозах анти-СБЗ-Ат добавленные в культуры КП в концентрациях 1 и 10 мкг/мл вызывали дополнительное увеличение пролиферации МНК (на 71,8±7,6% и 113,2±16,8%, соответственно; Р 0,05). Дальнейшее увеличение концентрации пептидов в диапазоне 100-1000 мкг/мл приводило к снижению пролиферативного ответа лимфоцитов до контрольных значений. В присутствии максимальных доз анти-СОЗ-Ат пролиферативный ответ клеток находился на уровне чуть выше контрольных значений при всех исследуемых концентрациях КП (среднее значение составляло 120,5±9,6%). Добавление КП к лимфоцитам, стимулированным ПВ, не приводило к достоверному изменению уровня их пролиферации. Ни одна из тестированных доз КП (1-1000 мкг/мл) не влияла на ПВ-стимулированные МНК независимо от степени клеточной активации (табл. 1.).
Таким образом, эффект КП проявляется в широком диапазоне концентраций (1-1000 мкг/мл) и носит модулирующий характер - зависит от концентрации пептидов, от уровня пролиферативной активности клеток, а также от вида активирующего вещества (рис. 3.4.). Интактные и слабостимулиро-ванные клетки (субмаксимальными дозы ФГА и анти-СБЗ-Ат) после обработки КП отвечают усилением пролиферации. Причем, наибольшее деление клеток наблюдается при добавлении КП в средних дозах - 10-100 мкг/мл. В случае максимальной ФГА-стимулированной пролиферации КП ингибируют рост лимфоцитов. При максимальной анти-СБЗ-симуляции эффект КП на пролиферативную активность МНК незначителен. При использовании в качестве активирующего агента ПВ ни одна из тестируемых концентраций пептидов не приводит к изменению пролиферативной активности лимфоцитов. Уровень активации клеток в этом случае роли не играет.
В ходе предыдущих экспериментов мы выявили, что КП способны оказывать ингибирующее действие на пролиферативную активность МНК человека. Следующая наша задача состояла в выяснении вопроса: происходит ли этот феномен за счет индукции пептидами апоптоза в МНК.
Определение уровня апоптоза МНК оценивали методом проточной ци-тофлюориметрии. Для дифференциального окрашивания ДНК клеток использовали флуоресцентный краситель пропидиум йодид. Анализ действия КП проводили путем сравнения процента субдиплоидных, диплоидных и тетраплоидных клеток в культурах клеток, обработанных пептидами, с контрольными пробами (полный гидролизат коллагена I типа, см. раздел 2.3.2.).
Апоптоз МНК. активированных анти-СРЗ антителами. Для изучения влияния КП на апоптоз активированных лимфоцитов, в клеточные культуры вносили анти-СОЗ-Ат в дозах, вызывающих субмаксимальный и максимальный пролиферативный ответ, а также КП в концентрациях 1 и 100 мкг/мл. Контрольными служили пробы, в которые добавляли только максимальные и субмаксимальные стимулирующие дозы анти-СРЗ-Ат. Исследование флуоресценции ДНК проводили на ранних этапах клеточной активации - через 24 ч после начала культивирования, основываясь на литературных данных о том, что именно этот период требуется для необратимой активации лимфоцитов [36]. Второй временной период - 72 часа, был выбран для изучения влияния КП в период максимальной пролифера-тивной активности клеток.
В контрольных культурах МНК, активированных субмаксимальными дозами анти-СРЗ-Ат, через 24 ч количество апоптозирующих клеток составляло 14,2±1,8% (рис. 3.6.). Обработка клеток КП в концентрациях 1 и 100 мкг/мл не приводила к статистически значимому изменению этого показателя. Распределение клеток по степени плоидности также не изменялось по сравнению с контролем.
Увеличение времени экспозиции клеток с активирующим агентом до 72 ч приводило к повышению количества клеток, находящихся в апоптозе. В контрольных пробах этот показатель составлял 28,3±2,3%. При добавлении в культуры МНК пептидов в дозе 1 мкг/мл наблюдалось незначительное, по сравнению с контролем, изменение в гистограмме распределения МНК: уменьшение количества апопозирующих клеток (21,8±1,4%) сопровождалось увеличением числа покоящихся клеток (74,8±3,0%).
